Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response
May 23rd, 2020
We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.
Dit protocol kan worden gebruikt om time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen produceren en om de afstoting van zwerm vast te leggen door bacteriofhage of antibiotica. De time-lapse films vangen de gedetailleerde dynamiek van de zwermen reactie op antibiotica en bacteriofaag en de techniek vereist alleen een ontvochtiger, computer, incubator, en document scanner. Voor te bereiden zwermen agar platen voor P.aeruginosa zwermen time-lapse imaging, gebruik maken van een 25 milliliter pipet om 20 milliliter zwermen agar oplossing toe te voegen aan elke experimentele 10 centimeter diameter Petri schotel.
Plaats de platen in een enkele stapel met deksels gedurende een uur op kamertemperatuur. Zet een ontvochtiger aan om de relatieve vochtigheid van de ruimte te verlagen tot 40-50%Wanneer de agar heeft gestold, droog de zwermende agar platen voor een extra 30 minuten in een laminaire stroom kap met de deksels af en gezicht op 300 kubieke meter per minuut met een 40-50% relatieve vochtigheid bij kamertemperatuur. Bewaar vervolgens de gedroogde zwermende agarplaten tot 24 uur op vier graden Celsius.
Voor zwermen agar plating, houd een P20 pipet tip geladen met vijf microliters van een 's nachts P.aeruginosa cultuur op een hoek van 10-45 graden 2-1/2 centimeter boven het centrum van een zwermende plaat en deprimeren de zuiger aan de eerste stop het aanraken van de agar met alleen de vloeistof te laten vallen. Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over de verschillende zwermen agar platen. Om een faaginfectie te plaat, eerst meng 30 microliter van 's nachts gekweekte P.aeruginosa met zes microliter van een keer 10 tot de 12 plaque-vormende eenheden per milliliter van faag DMS3 vir en onmiddellijk toe te voegen zes microliter van de P.aeruginosa faag mengsel op zes gelijke satelliet posities op een 2,8 centimeter straal concentric cirkel zoals aangetoond.
Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over verschillende zwermen agar platen. Om antibiotica behandelingen plaat, meng 30 microliters van 's nachts gekweekte P.aeruginosa met de juiste concentratie en het volume van het antibioticum van belang en voeg onmiddellijk zes microliters van de met antibiotica behandelde bacteriën op zes equidistant satelliet posities op een 2,8 centimeter straal concentrische cirkel over het centrum van de schotel. Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over de verschillende zwermen agar platen.
Wanneer alle culturen zijn verguld, vervang de heldere Petri schotel deksels met op maat gemaakte zwarte deksels. Plaats voorzichtig de zwermende agarplaten op een scanner in een incubator set op 37 graden Celsius met een 10 liter waterbad om de luchtvochtigheid op 75% te behouden Na het plaatsen van de platen in de scanner, open het bestand en sla instellingen op om het besparingspad voor de beelden in te stellen en klik op scan en OK op 30 minuten intervallen. Gebruik de scriptsoftware om de beeldverwerving te automatiseren.
Selecteer zowel idle scanning als single scan en klik met de rechtermuisknop op idle scanning en klik vervolgens links op ingeschakeld. Importeer aan het einde van de incubatie alle gescande afbeeldingen in ImageJ. In het venster volgordeopties geeft het aantal afbeeldingen het aantal geselecteerde afbeeldingen aan.
Houd startafbeelding bij één om te beginnen vanaf de eerste afbeelding in de map en de schaalafbeeldingen op 100% om de oorspronkelijke grootte van de afbeeldingen te behouden. Klik heim aan RGB om de afbeeldingen in kleur te houden. Laat de virtuele stapel onbeheerd staan en klik op OK om de afbeeldingen te laden.
Klik op bestand, sla als EN AVI op om de afbeeldingen samen te voegen in een AVI-bestand. Pas de compressie aan op JPEG en de framesnelheid op vijf frames per seconde. Sla vervolgens de AVI-time-lapse op in de juiste opslagmap.
Time-lapse beeldvorming van een enkele kolonie van wild-type P.aeruginosa van een LB agar plaat in LB bouillon 's nachts op 37 graden Celsius en gespot in het midden van een zwermende agar plaat onthult een eerste groei in de vorm van een kolonie in het midden van de plaat die zich verspreidt in ranken radially van de kolonie. Zwermen verplaatsen zich van het centrum van de zwermende agarplaten naar de periferie en worden afgeweerd door een stresssignaal dat wordt uitgezonden door de bacteriën die besmet waren met fagen of behandeld werden met Gentamycine. Fagen of Gentamycine alleen gespot op de satelliet posities veroorzaken niet zwermen populaties om deze gebieden te vermijden.
Gebruik een pipet van 25 milliliter om ervoor te zorgen dat de zwermende agarplaten precies 20 milliliter bevatten. Het is ook belangrijk om de droogtijd van de plaat aan te passen aan de laboratoriumomgeving. Onze techniek stelt ons in staat om de algehele zwermende patronen van Pseudomonas aeruginosa populaties te visualiseren.
Het volgende doel is om individuele celmotiliteit te controleren met behulp van Brightfield microscopie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft een eenvoudige methode voor het produceren van hoogwaardige time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen als reactie op bacteriofaag en antibioticastress. De techniek maakt real-time monitoring van zwermdynamiek mogelijk, die kan worden aangepast voor het bestuderen van motiliteit en groei van verschillende bacteriesoorten.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Zwermdynamiek van bacteriën
- Reactie op bacteriofaag en antibioticabehandelingen
- Time-lapse beeldtechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van het gedrag van bacteriezwermen is cruciaal voor microbiële ecologie.
- Faag en antibiotica-invloeden op bacteriën kunnen belangrijke interacties onthullen.
- Time-lapse films geven visuele inzichten in het gedrag van bacteriën in de loop van de tijd.
Gebruikte methoden
- Time-lapse beeldvorming via een documentscanner
- Pseudomonas aeruginosa als modelorganisme
- Beeldverwerking met ImageJ-software
Belangrijkste resultaten
- Visualisaties tonen zwermpatronen als reactie op faag en antibiotica.
- Bacteriën vertoonden afstoting van gebieden met faag of antibioticabehandelingen.
- De bevindingen ondersteunen de rol van faag en antibiotica in het beïnvloeden van bacteriële beweging.
Conclusies
- Deze techniek visualiseert en kwantificeert effectief zwermgedrag bij bacteriën.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrijpen van microbiële reacties op behandelingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, cost-effective monitoring of bacterial swarming dynamics and collective stress responses, providing quantitative phenotypic data for target de-risking in antimicrobial discovery. By visualizing repulsion behaviors induced by phage or antibiotic exposure, it supports mechanistic interrogation of compound effects on microbial motility and virulence pathways. The approach offers a scalable, reproducible platform for early-stage phenotypic screening and pathway validation in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying swarm repulsion as a phenotypic readout of stress response activation.
- Operational Value: Uses accessible instrumentation (document scanner, incubator) to standardize swarm imaging across laboratories.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking compound exposure to measurable changes in collective bacterial behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-lapse data on swarm expansion rates and spatial patterns for dose-response profiling.
- Operational Value: Automates image acquisition via scripting software, enabling consistent, high-throughput data capture.
- Assay Readiness: Produces standardized AVI outputs at five frames per second for downstream image analysis in tools like ImageJ.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro swarm behavior to potential in vivo biofilm and dispersal phenotypes relevant to infection models.
- Mechanistic De-risking: Isolates the collective stress response as a biomarker-like output for evaluating antimicrobial mechanism of action.
- Pathway Clarification: Distinguishes direct growth inhibition from behavior-modifying effects of phage or antibiotics on swarm dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting lead identification by providing phenotypic readouts that complement growth-based assays and help prioritize compounds with anti-virulence or anti-biofilm potential.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of how antimicrobials affect microbial collective behaviors beyond planktonic growth.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization and inter-laboratory comparison.
- Analytics: Generates morphometric and kinetic parameters (e.g., tendril expansion, repulsion zones) for statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Links swarm repression to reduced surface colonization, a trait associated with persistent infections.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple bacterial species and stressor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating effects on motility from effects on viability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized plate preparation, humidity control, and automated scanning intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds that disrupt virulence-associated behaviors early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads showing dual action on growth and swarming behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile plate preparation.
- Depends on access to a document scanner, incubator with humidity control, and image analysis software.
- Necessitates standardization of inoculation timing, spot placement, and environmental conditions across replicates.
- Involves adaptation considerations when extending to non-swarming or fastidious bacterial species.
- Limited to surface-associated behaviors; does not replace planktonic growth or biofilm thickness assays.
