Name: Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Ontdek een eenvoudige methode voor time-lapse beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa zwermen in reactie op bacteriofaag- en antibioticastress. Deze techniek visualiseert collectieve bacteriële dynamica in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.-L.B., A.S., en N.M.H-K. schreef en herzag het manuscript. Alle auteurs ontwierpen de experimenten. J.-L.B. voerde de experimenten en analyses uit. Dit werk werd ondersteund door de NIH award K22AI112816 en R21AI139968 subsidie aan A.S. en door de Universiteit van Californië. N.M.H-K. werd ondersteund door Lundbeck Fellowships R220-2016-860 en R251-2017-1070. De financiers hadden geen rol in het besluit om het werk voor publicatie in te dienen. We hebben geen concurrerende belangen te verklaren.

1. Voorbereiding Swarming Agar Platen voor P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
<ol><li>Bereid 1 L van 5x M8 minimale media in een glazen fles door toevoeging van 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4,en 2,5 g NaCl in 500 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Pas het uiteindelijke volume aan op 1 L met extra ddH2O. Autoclave om vloeibare media bij kamertemperatuur te steriliseren en op te slaan.</li>
	<li>Bereid 100 mL van 1 M MgSO4 (magnesiumsulfaat) in een glazen fles door 24,6 g MgSO4•7H2O in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Autoclave te steriliseren. Bewaar op kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid 100 mL casaminozuren in een glazen fles door 20 g casaminozuren toe te voegen in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Autoclave om te steriliseren. Bewaar op kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid 100 mL van 20% glucose in een glazen fles door toevoeging van 20 g glucose in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Steriliseren door filtratie met 0,22 μm filter. Bewaar op kamertemperatuur.</li>
	<li>Om 10 zwermen agar platen, voeg 1 g agar in 100 mL van ddH2O en het laatste volume aan te passen tot 160 mL met extra ddH2O in een 250 mL Erlenmeyer kolf. Steriliseren door autoclaven.<ol>
<li>Plaats onmiddellijk na autoclaven de agar-oplossing gedurende 15 min in een waterbad van 55 °C.</li>
		<li>Haal de agar-oplossing uit het waterbad en voeg 40 mL van 5x M8 minimummedia, 200 μL van 1 M MgSO4,2 mL van 20% glucose en 5 mL van 20% casaminozuren15toe. Ga onmiddellijk na het mengen naar stap 1.6. OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zijn 0,5% agar, 1 mM MgSO4,0,2% glucose en 0,5% casaminozuren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een 25 mL pipet voor consistent volume, voeg 20 mL van de zwermen agar oplossing per 10 cm diameter Petri dish. OPMERKING: Een vast volume van de agar-oplossing is belangrijk, omdat het volume de droogtijd en het vochtgehalte van de agar beïnvloedt. Vermijd bubbels bij het maken van de zwermen agar platen.</li>
	<li>Laat de agar stollen door het plaatsen van de zwermen agar platen in een enkele stapel met deksels op voor 1 uur op de bank bij kamertemperatuur. Schakel de ontvochtiger in om de relatieve vochtigheid van de kamer te verlagen tot 40-50% 1 uur voor de volgende stap.</li>
	<li>Droog de zwermen agar platen voor een extra 30 min met de deksels af in een laminaire stroom kap op 300 ft3/ min met 40-50% relatieve vochtigheid bij kamertemperatuur. Droog het interieur van de deksels door ze gezicht omhoog in de laminaire stroomkap. Bewaar zwermen agar platen op 4 °C voor maximaal 24 uur.</li>
	<li>Bereid zwarte 10 cm petrischaaldeksels voor beeldvorming door de binnenkant van het deksel glad te strijken met schuurpapier. Doe de deksels in een verpakkingsdoos en leg de verpakkingsdoos onder een chemische kap. Spray in de deksels met behulp van zwarte spuitverf. Laat de deksels drogen. LET OP: Zwarte deksels kunnen opnieuw worden gebruikt voor extra experimenten. Het is belangrijk dat de deksels zo zijn geschilderd dat ze geen licht reflecteren tijdens het scannen.</li>
</ol>2. Groei van P. aeruginosa en Plating Conditions
<ol><li>Bereid 400 mL lysogene bouillon (LB) door 10 g LB-Miller poedermix toe te voegen tot 400 mL ddH2O. Voor 2% LB-agar Petri gerechten, voeg een extra 8 g agar. Autoclave te steriliseren.</li>
	<li>Giet 20 mL gesmolten LB-agar medium in petrischaaltjes met een diameter van 10 cm en laat ze 's nachts bij kamertemperatuur stollen. Bewaar vloeibare media bij kamertemperatuur en agarplaten op 4 °C.</li>
	<li>Streep P. aeruginosa op een LB-agar Petri schaal uit een bevroren voorraad opgeslagen bij -80 °C met behulp van steriele lussen of houten stokken. Incubeer het petrischaaltje 's nachts ondersteboven bij 37 °C. Bewaar LB-agar plaat op 4 °C voor maximaal 1 week.</li>
	<li>Kies een enkele kolonie uit de petrischaal met een steriele lus of houten stok, inent het in 2 mL LB medium en incubeer de cultuur tot verzadiging 's nachts (16-18 uur) bij 37 °C in een roller drumset bij 100 rpm.</li>
	<li>Pipet 5 μL van 's nachts cultuur van stap 2.4 met behulp van een P20 pipet en ter plaatse in het midden van de zwermen agar plaat door het naderen van de pipet tip onder een hoek (10-45 °) 2,5 cm boven het spotting gebied, pipetteren naar beneden naar de eerste halte, en het aanraken van de agar met alleen de vloeibare daling (Figuur 1B).<ol>
<li>Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een sjabloon om de spot consistent te positioneren over verschillende zwermen agar platen (Aanvullende figuur S1).</li>
		<li>Voor traditionele zwermen testen, gebruik alleen het centrum plek en overslaan naar stap 2.8. Voor collectieve stressresponstesten blijven stap 2.6 (voor faaginfectie) of stap 2.7 (voor antibioticastress).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meng voor faaginfectie 30 μL nachtkweek van P. aeruginosa vanaf stap 2.4 met 6 μL van 1 x 1012 pfu/mL faag DMS3vir20. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.<ol>
<li>Pipet 6 μL van de P. aeruginosa-faagmengselvanaf stap 2.6 met behulp van een P20-pipet en spot op 6 equidistant satellietposities op een concentrische cirkel van 2,8 cm straal die gecentreerd is op de petrischaal door de pipetpunt onder een hoek (10 tot 45°) 2,5 cm boven het spotting-gebied te benaderen, naar beneden te pipetteren tot de eerste stop en de agar aan te raken met alleen de vloeibare druppel (Figuur 1C).</li>
		<li>Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een beplatingssjabloon voor consistentie(Aanvullende figuur S1). Ga naar stap 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor antibioticabehandelingen, meng 30 μL nachtcultuur P. aeruginosa vanaf stap 2.4 met 6 μL van 3 mg/mL gentamycine, 10 μL van 100 mg/mL kanamycine, of 7,5 μL van 100 mg/mL fosfomycine. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.<ol>
<li>Pipet 6 μL van antibiotica behandeld P. aeruginosa van stap 2.7 met behulp van een P20 pipet en spot op 6 equidistant satelliet posities op een 2,8 cm straal concentrische cirkel over het midden van de schotel door het naderen van de pipet tip in een hoek (10 tot 45 °) 2,5 cm boven het gebied spotten, pipetteren naar beneden naar de eerste halte, en het aanraken van de agar met alleen de vloeibare druppel (Figuur 1D).</li>
		<li>Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een beplatingssjabloon voor consistentie(Aanvullende figuur S1). Ga naar stap 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vervang de heldere petrischaaldeksels door zwarte deksels gemaakt in stap 1.9(figuur 2A).</li>
	<li>Plaats de zwermende agarplaten op een scanner in een couveuse op 37 °C met een waterbad van 10 L om de luchtvochtigheid op 75% te houden (Figuur 1E, figuur 2B). LET OP: Verstoor gevlekte cellen op de zwermen de agarplaten niet. Houd platen naar boven te allen tijde.</li>
</ol>3. Beeldverwerving met scanner
<ol><li>Verlaag de sfeerverlichting van de petrischaaltjes door zwarte matte stof aan een rek te bevestigen dat 40-60 cm boven de flatbeddocumentscanner ligt. Beveilig het met behulp van zip-ties(figuur 2B).</li>
	<li>De scanner wordt aangestuurd met behulp van een scansoftware en een automatische scriptsoftware.<ol>
<li>Selecteer in de scansoftware de homemodus (figuur 3A). Maak afbeeldingen in kleur vast door Kleur te selecteren onder Afbeeldingstype. Als u de beeldkwaliteit wilt instellen, selecteert u Andere onder Bestemming en past u de resolutie aan op 300 dpi. Houd de standaardgrootte voor de afbeeldingen behouden door Origineel voor doelgrootte teselecteren. Laat alle opties onder Afbeeldingsaanpassingen onaangevinkt voor standaardbeeldkwaliteit. OPMERKING: Doelgrootte is standaard ingesteld op Origineel. Als u andere opties voor doelgrootte wilt selecteren, klikt u eerst op Voorbeeld.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel het opslaande pad van afbeeldingen in door op het mappictogram rechts van Scan te klikken om Instellingen voor opslaan bestand te openen (figuur 3A).<ol>
<li>Selecteer de mapbestemming voor het opslaan van afbeeldingen door Andere te selecteren onder Locatie en klik op Bladeren. Kies een map om de afbeeldingen op te slaan.</li>
		<li>Geef de afbeeldingen een naam in het tekstvak Voorvoegsel. Stel Startnummer 001 in om de naamgevingsvolgorde voor de afbeeldingen te beginnen. Stel de bestandsindeling in op JPEG door JPEG (*.jpg) te kiezen voor Tekst onder Afbeeldingsindeling en klik op Opties om aan te passen voor details. Stel de beeldkwaliteit in door compressieniveau aan te passen op 16, Codering op Standaard en schakel ICC-profiel insluitenin. Klik op OK om het venster te sluiten(figuur 3B).</li>
		<li>Laat de eerste optie onaangevinkt ('Alle bestanden met dezelfde naam overschrijven') en controleer de 3 volgende opties ('Dit dialoogvenster weergeven voordat volgende scan' wordt gemaakt, 'Afbeeldingsmap openen na het scannen' en 'Pagina weergeven na het scannen'). Klik op OK om het venster te sluiten</li>
		<li>Controleer de beeldkwaliteit door op Voorbeeldte klikken . Het voorbeeldvenster wordt weergegeven en het pictogram Scannen wordt functioneel(figuur 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik de scriptingsoftware om de beeldacquisitie te automatiseren. Het meegeleverde script klikt op Scan in het venster Scannen en OK in het venster Instellingen voor bestandsopslag met intervallen van 30 minuten.<ol>
<li>Het script importeren door op Taak te klikken | Importeer en selecteer zowel Single_scan.tsk als Idle_scanning.tsk (TSK-bestanden die worden aangeboden als aanvullende bestanden 1 en 2). Zie figuur 3D. OPMERKING: Single_scan.tsk klikt op de knop Scannen in het venster Scannen en OK in het venster Instellingen voor opslaan van bestanden. Idle_scanning.tsk activeert Single_scan.tsk om de 30 min. Men kan de scanfrequentie wijzigen door de activering van Idle_scanning.tsk tewijzigen.</li>
		<li>Automatisch scannen inschakelen met intervallen van 30 minuten door zowel Idle scanning (geïmporteerd) als Single scan (geïmporteerd)te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken op Idle scannen (geïmporteerd)en links te klikken op Ingeschakeld (figuur 3D, Aanvullende figuur S2). OPMERKING: Automatisch scannen wordt uitgevoerd totdat de gebruiker het script handmatig stopt. Als u het script wilt stoppen, selecteert u Niet-actief scannen (geïmporteerd)en klikt u met de rechtermuisknop op Niet actief scannen (geïmporteerd)en klikt u links op Ingeschakeld. Het vinkje wordt verwijderd.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Het samenstellen van time-lapse beelden en het meten van zwerm afstoting
<ol><li>Filmbewerking en beeldanalyse uitvoeren met ImageJ.</li>
	<li>Alle gescande afbeeldingen importeren in ImageJ door op Bestand te klikken | Invoer | Afbeeldingsvolgorde en selecteer de afbeeldingen. Schakel in het venster Reeksenopties de optie Converteren naar RGB in om afbeeldingen in kleur te houden. Het aantal afbeeldingen geeft het aantal geselecteerde afbeeldingen aan.</li>
	<li>Houd De afbeelding starten op 1 om te beginnen vanaf de eerste afbeelding in de map en Afbeeldingen op 100% schalen om de oorspronkelijke grootte van de afbeeldingen te behouden. Laat Virtuele stapel gebruiken onaangevinkt. Klik op OK en wacht tot afbeeldingen zijn geladen(figuur 4A).</li>
	<li>Stel het videocompressieniveau in op 100 door op Bewerken te klikken | Opties | Invoer/uitvoer... en pas de JPEG-kwaliteit aan op 100.</li>
	<li>Sla het bestand op als een .avi door op Bestand te klikken | Behoudenals | AVI. Compressie aanpassen aan JPEG en framesnelheid tot 5 fps(figuur 4B). Sla de time-lapse van .avi op in de gewenste map.</li>
	<li>Als u de szwermafstotingsafstanden wilt kwantificeren, opent u een afbeelding aan het einde van de zwermperiode in ImageJ. Klik op Bestand | Open en selecteer de afbeelding. De schaal aanpassen door op Analyseren te klikken | Schaal instellen en Afstand instellen in pixels op 118, Bekende afstand tot 1, Pixel-beeldverhouding op 1,0 en Eenheid van lengte tot cm(figuur 4C). Laat Global ongecontroleerd. Klik op OK om het venster te sluiten.</li>
	<li>Klik op het rechte pictogram en meet vanaf het midden van de kolonie op de satellietpositie tot aan de rand van de zwermende populatie. Analyseren selecteren | Meten om een nieuw venster te laten verschijnen met de metingen (Lengte)(figuur 4D). OPMERKING: Gebruik '+' om dichterbij in te zoomen en '-' om uit te zoomen.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li>
<li>Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility%3A+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li>
<li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li>
<li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li>
<li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li>
<li>Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%C3%A9ziel%2C+E+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).</li>
<li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li>
<li>Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li>
<li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698(2015).</li>
<li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotaxis+system%2C+but+not+chemotaxis%2C+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).</li>
<li>Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li>
<li>Bru, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+signaling+for+more+than+a+quorum%3A+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li>
<li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888(2011).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li>
<li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).</li>
<li>Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol richt zich op het minimaliseren van de variabiliteit in zwermen agar platen en het verstrekken van een eenvoudige en low-cost methode om time-lapse beelden van P. aeruginosa zwermen en reageren op stress te verwerven. Deze procedure kan worden uitgebreid tot het beeld van andere bacteriële systemen door het aanpassen van de media samenstelling en groeivoorwaarden. Voor P. aeruginosa, hoewel M9 of FAB minimaal medium kan worden gebruikt om zwermen te induceren16,...

Zwermen is een collectieve vorm van gecoördineerde bacteriële beweeglijkheid die de antibioticaresistentie en de productie van virulentiefactoren in gastheer1verhoogt ,2,3. Dit meercellige gedrag vindt plaats op semi-vaste oppervlakken die lijken op die van slijmlagen die epitheelmembranen in de longen4,5. Biosurfactants worden vaak geproduceerd door zwermpopulaties om de oppervlaktespanning op oppervlakken te overwinnen en de productie hiervan wordt gereguleerd door complexe celcelsignaleringssystemen, ook wel quorumdetectie6,7,8genoemd . Veel soorten bacteriën kunnen zwermen, waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, en Escherichia coli9,10,11,12. De zwermpatronen die door bacteriën worden gecreëerd, zijn divers en worden beïnvloed door de fysische en chemische eigenschappen van de oppervlaktelaag, waaronder de samenstelling van voedingsstoffen, porositeit en vocht13,14. Naast oppervlakte-eigenschappen beïnvloeden de groeitemperatuur en de luchtvochtigheid verschillende aspecten van de zwermdynamiek, waaronder zwermsnelheid en patronen12,13,14,15. De groeivariabelen die van invloed zijn op de zwermen creëren uitdagingen die de experimentele reproduceerbaarheid en het vermogen om resultaten te interpreteren beïnvloeden. Hier beschrijven we een eenvoudige gestandaardiseerde methode om de dynamiek van bacteriële zwermen te monitoren door middel van time-lapse beeldvorming. De methode beschrijft hoe kritieke groeiomstandigheden die de progressie van zwermen aanzienlijk beïnvloeden, kunnen worden onder controle. Vergeleken met traditionele methoden van zwermanalyse, maakt deze time-lapse imaging methode het mogelijk om de beweeglijkheid van meerdere zwermen gelijktijdig te volgen tijdens langere perioden en met hoge resolutie. Deze aspecten verbeteren de diepte van de gegevens die kunnen worden verkregen uit monitoring zwermen en vergemakkelijken de identificatie van factoren die van invloed zijn zwermen.
Zwermen in P. aeruginosa wordt vergemakkelijkt door de productie en afgifte van rhamnolipiden en 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic zuren in de omgeving6,16. De introductie van stress door sub-dodelijke concentraties van antibiotica of infectie door faagvirus heeft gevolgen voor de organisatie van zwermen. In het bijzonder leiden deze spanningen ertoe dat P. aeruginosa het quorumdetectiemolecuul 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolon vrijgeeft, ook wel bekend als het Pseudomonas quinolone signaal (PQS)17,18. In zwermtesten die twee populaties zwermen bevatten, pqs geproduceerd door de stress-geïnduceerde bevolking afstoot onbehandelde zwermen van het invoeren van het gebied met de stress (Figuur 1). Deze collectieve stressrespons vormt een signaalsysteem voor gevaarcommunicatie dat P. aeruginosa waarschuwt voor bedreigingen in de buurt18,19. De effecten van stress op P. aeruginosa, de activering van de collectieve stressrespons en de afstoting van zwermen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de time-lapse beeldvormingsmethode die hier wordt beschreven. Het protocol dat hier wordt beschreven legt uit hoe: (1) agarplaten voorbereiden op zwermen, (2) cultuur P. aeruginosa voor twee soorten tests (traditionele zwermen de assays of collectieve stressresponstesten) (Figuur 1), (3) verkrijg time-lapse beelden, en (4) imagej gebruiken om de beelden samen te stellen en te analyseren.
Kortom, P. aeruginosa uit een nachtelijke cultuur wordt gespot in het midden van een zwermen agar plaat, terwijl P. aeruginosa die besmet zijn met faag of behandeld met antibiotica worden gespot op de satelliet posities. De progressie van P. aeruginosa zwermen wordt gecontroleerd op een consumentendocument flatbed scanner die wordt geplaatst in een vochtigheid geregeld37 °C incubator. De scanner wordt aangestuurd door een software die automatisch scant de platen op regelmatige tijdstippen over de zwerm groeiperiode, meestal 16-20 uur. Deze methode levert gelijktijdige time-lapse video's op van maximaal zes 10 cm zwermplaten. De beelden worden gecompileerd in films en de afstoting van zwermen door stress-geïnduceerde populaties wordt gekwantificeerd met behulp van vrij beschikbare ImageJ software. Er wordt speciale aandacht besteed aan de consistentie en reproduceerbaarheid tussen de verschillende zwermexperimenten.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, gedehydrateerd</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td>Voor LB-agarplaat en swarming agar plaat</td></tr><tr><td>Casamino aciden</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>Voor swarming media</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose. Voor swarming media</td></tr><tr><td>Fosfomycin disodium zout</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0889</td><td>Stock concentratie: 200 mg/mL. Opgelost in ddH2O</td></tr><tr><td>Gentamycin sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Stock concentratie: 3 mg/mL. Opgelost in ddH2O</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Stock concentratie: 100 mg/mL. Opgelost in ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Voor LB bouillon en LB-agar platen</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Voor swarming media</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Voor 5x M8 media</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Voor 5x M8 media</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td>Voor 5x M8 media</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14 stam</td></tr><tr><td>DMS3vir</td><td>O'Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>Bacteriofaag</td></tr><tr><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumoxide schuurpapier</td><td>3M</td><td>150 Fijn</td><td>Voor zwarte deksels</td></tr><tr><td>Zwarte stof</td><td>Joann</td><td>PRD7089</td><td>Zwarte stof</td></tr><tr><td>Zwarte spuitverf</td><td>Krylon</td><td>5592 Matte Black</td><td>Voor zwarte deksels</td></tr><tr><td>Erlenmeyer kolf</td><td>Kimax</td><td>26500</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Glazen opslagflessen</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1.000 mL</td></tr><tr><td>8 inch kabelbinders</td><td>Gardner Bender</td><td>E173770</td><td>Voor het bevestigen van zwarte matte stof</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 mm x 15 mm polystyreen platen</td></tr><tr><td>Houtstokjes</td><td>Fisher</td><td>23-400-102</td><td>Voor het strepen en inoeculeren van bacteriën</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Market Forge Industries</td><td>STM-E</td><td>Voor het steriliseren van reagentia</td></tr><tr><td>25 mL pipette</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>Om 20 mL voor swarming agar platen te pipetten</td></tr><tr><td>Luchtontvochtiger</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70-pint</td><td>Om de relatieve luchtvochtigheid in de kamer op ongeveer 45% te houden</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>Software voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Voor het kweken van bacteriën bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbad</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Voor het koelen van media tot 55 &deg;C</td></tr><tr><td>Laminaire stroomkap</td><td>The Baker Company</td><td>SG603A</td><td>Voor het drogen van platen</td></tr><tr><td>P-20 pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Spotten op swarming agar platen</td></tr><tr><td>Pipet Controller</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>Om 20 mL voor swarming agar platen te pipetten</td></tr><tr><td>Roller Drum</td><td>New Brunswick</td><td>TC-7</td><td>Voor het kweken van bacteriën bij 100 rpm</td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Epson</td><td>Epson Perfection V370 Foto</td><td>Scanner voor het maken van platen</td></tr><tr><td>Scanner automatiseringssoftware</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>Voor beeldvorming met intervallen van 30 minuten</td></tr><tr><td>Scanner beeldverwervingssoftware</td><td>Epson</td><td>v9.9.2.5US</td><td>Software voor het maken van platen</td></tr></tbody></table>

time-lapse beeldvorming van bacteriële zwermen en de collectieve stress response

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Zwermen is een vorm van oppervlakte beweeglijkheid waargenomen bij veel bacteriële soorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli. Hier, dichte populaties van bacteriën bewegen zich over grote afstanden in karakteristieke rank-vormige gemeenschappen in de loop van uren. Zwermen is gevoelig voor verschillende factoren, waaronder medium vocht, vochtigheid, en het gehalte aan voedingsstoffen. Bovendien weerhoudt de collectieve stressrespons, die wordt waargenomen in P. aeruginosa die wordt benadrukt door antibiotica of bacteriofaag (faag), zwermen van het naderen van het gebied met de stress. De hier beschreven methoden gaan over hoe de kritische factoren die van invloed zijn op de zwermen te controleren. We introduceren een eenvoudige methode om de zwermdynamiek en de collectieve stressrespons met hoge temporele resolutie te monitoren met behulp van een flatbeddocumentscanner, en beschrijven hoe u een kwantitatieve analyse van zwermen compileren en uitvoeren. Deze eenvoudige en kosteneffectieve methode zorgt voor nauwkeurige en goed gecontroleerde kwantificering van zwermen en kan worden uitgebreid tot andere soorten op platen gebaseerde groeitesten en bacteriële soorten.

De stappen om P. aeruginosate kweken, benadrukken de cellen, en beeld de zwermende agar platen zijn vertegenwoordigd in figuur 1. We inenten een enkele kolonie van wild-type P. aeruginosa UCBPP-PA14 stam van een LB-agar plaat in 2 mL lb bouillon 's nachts op 37 °C en gespot 5 μL in het midden van de zwermen agar plaat. Time-lapse beeldvorming van deze plaat onthult de eerste groei in de vorm van een kolonie in het midden en vervolgens verspreiden van ranken radiaal uit de kolonie (<stro...

We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.

Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Dit protocol kan worden gebruikt om time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen produceren en om de afstoting van zwerm vast te leggen door bacteriofhage of antibiotica. De time-lapse films vangen de gedetailleerde dynamiek van de zwermen reactie op antibiotica en bacteriofaag en de techniek vereist alleen een ontvochtiger, computer, incubator, en document scanner. Voor te bereiden zwermen agar platen voor P.aeruginosa zwermen time-lapse imaging, gebruik maken van een 25 milliliter pipet om 20 milliliter zwermen agar oplossing toe te voegen aan elke experimentele 10 centimeter diameter Petri schotel.Plaats de platen in een enkele stapel met deksels gedurende een uur op kamertemperatuur. Zet een ontvochtiger aan om de relatieve vochtigheid van de ruimte te verlagen tot 40-50%Wanneer de agar heeft gestold, droog de zwermende agar platen voor een extra 30 minuten in een laminaire stroom kap met de deksels af en gezicht op 300 kubieke meter per minuut met een 40-50% relatieve vochtigheid bij kamertemperatuur. Bewaar vervolgens de gedroogde zwermende agarplaten tot 24 uur op vier graden Celsius.Voor zwermen agar plating, houd een P20 pipet tip geladen met vijf microliters van een 's nachts P.aeruginosa cultuur op een hoek van 10-45 graden 2-1/2 centimeter boven het centrum van een zwermende plaat en deprimeren de zuiger aan de eerste stop het aanraken van de agar met alleen de vloeistof te laten vallen. Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over de verschillende zwermen agar platen. Om een faaginfectie te plaat, eerst meng 30 microliter van 's nachts gekweekte P.aeruginosa met zes microliter van een keer 10 tot de 12 plaque-vormende eenheden per milliliter van faag DMS3 vir en onmiddellijk toe te voegen zes microliter van de P.aeruginosa faag mengsel op zes gelijke satelliet posities op een 2,8 centimeter straal concentric cirkel zoals aangetoond.Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over verschillende zwermen agar platen. Om antibiotica behandelingen plaat, meng 30 microliters van 's nachts gekweekte P.aeruginosa met de juiste concentratie en het volume van het antibioticum van belang en voeg onmiddellijk zes microliters van de met antibiotica behandelde bacteriën op zes equidistant satelliet posities op een 2,8 centimeter straal concentrische cirkel over het centrum van de schotel. Gebruik een sjabloon om de plek consequent positie over de verschillende zwermen agar platen.Wanneer alle culturen zijn verguld, vervang de heldere Petri schotel deksels met op maat gemaakte zwarte deksels. Plaats voorzichtig de zwermende agarplaten op een scanner in een incubator set op 37 graden Celsius met een 10 liter waterbad om de luchtvochtigheid op 75% te behouden Na het plaatsen van de platen in de scanner, open het bestand en sla instellingen op om het besparingspad voor de beelden in te stellen en klik op scan en OK op 30 minuten intervallen. Gebruik de scriptsoftware om de beeldverwerving te automatiseren.Selecteer zowel idle scanning als single scan en klik met de rechtermuisknop op idle scanning en klik vervolgens links op ingeschakeld. Importeer aan het einde van de incubatie alle gescande afbeeldingen in ImageJ. In het venster volgordeopties geeft het aantal afbeeldingen het aantal geselecteerde afbeeldingen aan.Houd startafbeelding bij één om te beginnen vanaf de eerste afbeelding in de map en de schaalafbeeldingen op 100% om de oorspronkelijke grootte van de afbeeldingen te behouden. Klik heim aan RGB om de afbeeldingen in kleur te houden. Laat de virtuele stapel onbeheerd staan en klik op OK om de afbeeldingen te laden.Klik op bestand, sla als EN AVI op om de afbeeldingen samen te voegen in een AVI-bestand. Pas de compressie aan op JPEG en de framesnelheid op vijf frames per seconde. Sla vervolgens de AVI-time-lapse op in de juiste opslagmap.Time-lapse beeldvorming van een enkele kolonie van wild-type P.aeruginosa van een LB agar plaat in LB bouillon 's nachts op 37 graden Celsius en gespot in het midden van een zwermende agar plaat onthult een eerste groei in de vorm van een kolonie in het midden van de plaat die zich verspreidt in ranken radially van de kolonie. Zwermen verplaatsen zich van het centrum van de zwermende agarplaten naar de periferie en worden afgeweerd door een stresssignaal dat wordt uitgezonden door de bacteriën die besmet waren met fagen of behandeld werden met Gentamycine. Fagen of Gentamycine alleen gespot op de satelliet posities veroorzaken niet zwermen populaties om deze gebieden te vermijden.Gebruik een pipet van 25 milliliter om ervoor te zorgen dat de zwermende agarplaten precies 20 milliliter bevatten. Het is ook belangrijk om de droogtijd van de plaat aan te passen aan de laboratoriumomgeving. Onze techniek stelt ons in staat om de algehele zwermende patronen van Pseudomonas aeruginosa populaties te visualiseren.Het volgende doel is om individuele celmotiliteit te controleren met behulp van Brightfield microscopie.

time-lapse-imaging-bacterial-swarms-collective-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Opname Meercellige Gedrag in Myxococcus Xanthus Biofilms met Time-lapse Microcinematography

Source: Bru, J., et al., Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the procedure for analyzing the swarming behavior of Pseudomonas aeruginosa by observing bacterial growth from a central culture toward satellite spots containing the same culture mixed with an antibiotic, using an agar plate setup and time-lapse imaging.

Swarming Behavior of Pseudomonas aeruginosa Under Antibiotic Stress

Source: Bru, J., et.al. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates how to visualize and measure swarm avoidance behavior in Pseudomonas aeruginosa using a swarming agar plate assay. It shows the setup for time-lapse imaging under controlled conditions and explains how antibiotic-induced stress signals redirect bacterial movement, which is quantified through image analysis.

Imaging and Quantifying Swarm Avoidance Responses to Antibiotic Stress in Pseudomonas aeruginosa

Source: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a swarming assay using bacteria that express green fluorescent protein to observe surface motility on soft agar. Time-lapse imaging captures coordinated expansion and tendril formation, highlighting bacterial surface motility.

Swarming Assay for Visualizing Bacterial Surface Motility

Source: Cayron, J., et al. Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates how to prepare and use a microfluidic plate for imaging bacterial cells under stress conditions. It outlines the process of introducing a bacterial culture and a stress-inducing antibiotic medium, followed by cell loading and microscopic setup. Time-lapse imaging in phase-contrast mode is then used to observe the development of elongated, filamentous cells...

Microscopic Analysis of Bacterial Growth Under Stress Using Microfluidic Chambers

Source: Guo, S., et al. Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the use of a double-layer gradient swarm plate to study bacterial swarming behavior under varying inhibitor concentrations. A plate with a gradient-forming inhibitor in the bottom layer is inoculated with bacteria and incubated. Images are captured at regular intervals to analyze the effect of inhibitor concentration on bacterial swarming.

Assessing Bacterial Swarming Using a Gradient Inhibitor Plate

ScanLag is een methode met hoge doorvoer voor het meten van de vertraging in groei, namelijk latentietijd, evenals de groeisnelheid van kolonies voor duizenden cellen parallel. Screening met behulp van ScanLag maakt de onderscheiding mogelijk tussen lange latentietijd en langzame groei op het niveau van een enkele variant.

ScanLag: High-throughput Kwantificering van Colony Groei en vertraging

Dit protocol staat een tijd opgeloste beschrijving van bacteriële groei onder stressomstandigheden op de eencellige en de celpopulatie niveaus.

Multi-Scale analyse van bacteriële groei onder stress behandelingen

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

In dit manuscript bieden we een uitgebreid protocol voor het beoordelen van de antibioticaoverleving voor Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus, waarbij plasmiden worden getransformeerd in P. aeruginosa en S. aureus om reporterstammen te creëren en fenotypische varianten, zoals persisters, te visualiseren door time-lapse epifluorescentiemicroscopie.

Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes

Ontdek een eenvoudige methode voor time-lapse beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa zwermen in reactie op bacteriofaag- en antibioticastress. Deze techniek visualiseert collectieve bacteriële dynamica in real-time.

Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response

Meer video's verkennen