Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het bevorderen van heterochromatine vorming. Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode voor het identificeren van kleine moleculen verbindingen die dit proces bevorderen. Ons screeningprotocol biedt een eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk te volgen in vivo systeem voor heterochromatine-bevorderende identificatie van geneesmiddelen.

Het identificeren van verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen, kan leiden tot de ontdekking van mechanismen van kanker die herstellen en kankertherapie. Deze kosteneffectieve is gemeten voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende verbindingen in Drosophila kan ook worden gebruikt om vorm hits tellen als het is een preventieve maatregel om een hoogste cel pool van celscreening. Ons screening protocol kan ook nuttig zijn voor snelle pilot schermen als dit Drosophila TranSheet systeem produceert een bonte oogkleur fenotype dat omgekeerd is gecorreleerd aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig in de vlieg.

Helpen om de procedure aan te tonen zal Kenny Dao, een student uit ons laboratorium. Na het identificeren en voorbereiden van een drugsbibliotheek voor een screening met behulp van een geschikt oplosmiddel, en de gewenste concentratie, kruisen drie mannelijke vliegen met drie of meer maagdelijke vrouwelijke vliegen in een 25 bij 95 millimeter voedsel flesje. Met negen millimeter standaard Drosophila voedingsmedium.

Zet drie replica flesjes voor elke drug. Voeg een bedieningsbladje toe voor het scherm. En laat de vliegen om eieren te leggen voor twee dagen op kamertemperatuur.

Op dag twee van het kruis verdooft u de vliegen met een korte uitbarsting van kooldioxide. En gooi de ouder vliegt in een fles met 70% ethanol. Vervolgens verdun elke drug verbinding uit de oorspronkelijke voorraad om micro molaire uiteindelijke concentratie bij te wonen in 33%DMSO in water.

En voeg 60 microliter van het medicijn toe, of de controle 33%DMSO alleen, bovenop het vliegvoedsel. Bevestig dan dat er geen oudervliegen aanwezig zijn in de flesjes. En voeg de medicijnoplossing toe aan de juiste flesjes.

Twee dagen nadat de F1-vliegen tevoorschijn komen, brengen verdoofde vliegen van één flesje tegelijk over op een poreus ontleedpad met kooldioxide die onder het filterpapier doorfiltert. Onder een ontledenmicroscoop, onderzoeken elke hele vlieg, het identificeren van alle heterozygoot mannen door hun gebrek aan de krullend o-dominante krullende vleugel fenotype. Score de kleur van de ogen van elke heterozygoot man op een schaal van een tot vijf.

Met een een score wordt toegewezen aan een minder dan 5% rode verspreide oog totale oppervlakte. Voeg een twee score aan vliegen met een 6 tot 25% rode vlek oog totale oppervlakte. Een drie tot vliegt met een 26 tot 50% rode vlek oog totale oppervlakte.

Een vier tot vliegt met een 51 tot 75% rode vlek oog totale oppervlakte. En een vijf vliegt met een meer dan 75% rode vlek oog totale oppervlakte. Bereken vervolgens de gemiddelde kleurindex van alle mannetjes uit elke flacon gescoord in drievoud.

Om te bevestigen dat de verbindingen inderdaad heterochromatinevorming bevorderen, kan een andere validatietechniek, zoals westelijke blotting, worden uitgevoerd. In dit representatieve experiment, een klein molecuul drug bibliotheek, oncologie set 3, die is samengesteld uit 97 FDA geautoriseerde oncologie drugs, werd gescreend met behulp van de DX1 stam van Drosophila Melanogaster. Volgens de screening test, methotrexaat, gecodeerd als E7 in de bibliotheek, veroorzaakt de meeste variatie binnen de Dx1 stam.

Suggereren dat methotrexaat zou de meest veelbelovende heterochromatine-bevorderende drug voor toekomstige kanker gerichte therapie. Om verder te bevestigen dat deze verbinding heterochromatine transformatie bevordert, werden westerse vlekkengegevens uitgevoerd. Het aantonen van de up regulatie van heterochromatine formaat in geassocieerd eiwit, H3K9 trimethylation, en het valideren van de screening resultaten.

De kritische stap is het scoren van de oogkleur van elk van de witte 11-18 DX1 heterozygoot mannelijke vliegt op een schaal van een tot vijf volgens een vooraf bepaalde studie route. We kunnen westerse vlekken of immunostaining gebruiken om de hits te bevestigen. De ontdekking van verbindingen waarvan wordt vermoed dat ze heterochromatinevorming bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van het genetisch mechanisme iv van kankerontwikkeling en klinische proeven bij menselijke patiënten.