Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

Met behulp van ons protocol bevordert de meerlaags van de vloeibare bioinkverdunningen niet alleen een homogene dispersie van de ingekapselde cellen, maar behoudt het ook een celgeschlene bioinkomgeving. We gebruiken de interfaciale spanning om de sedimentatie van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir te stoppen, waardoor de hoge schuifspanningsbelasting voor de cellen tijdens extrusiedruk wordt vermeden. Met behulp van deze technologie kunnen we 3D-weefselconstructies genereren met een homogene celdistributie, die een functionele in vitro weefselmalrij biedt voor gebruik in medicijnscreening en regeneratiegeneeskundestudies.

Bij het voorbereiden van de bioink is het belangrijk om aandacht te besteden aan de experimentele temperatuur en de hygrogelbeladingsprocedure, omdat deze factoren de kwaliteit van de inkt kunnen beïnvloeden. Gebruik voor het begin van de voorbereiding 0,22-micrometer spuitfiltereenheden om alle materialen te steriliseren en gelatine op te lossen tot een 10%-eindconcentratie in 50-graden-Celsius PBS in een biologische veiligheidskast. Voeg methacrylic anhydride toe aan de gelatineoplossing bij een gewichtsverhouding van 0,6 tot één met langzaam roeren gedurende ten minste een uur bij 50 graden Celsius.

Breng aan het einde van de incubatie de gemengde oplossing over in een steriele buis van 50 milliliter en scheid de oplossing in lagen door centrifugatie. Verzamel de bovenste GelMA-laag en verdun de verzamelde oplossing met twee volumes van 40 tot 50 graden Celsius gedeïmiseerd water. Dialyze de GelMA oplossing met een 12 tot 14-kilodalton moleculair gewicht cutoff dialyse membraan tegen gedeïmiseerd water gedurende vijf tot zeven dagen bij 40 tot 50 graden Celsius, het veranderen van het water twee keer per dag.

Aan het einde van de dialyse, bevriezen de GelMA oplossing op min 80 graden Celsius 's nachts. Vervolgens lyophilize de GelMA oplossing voor drie tot vijf dagen in een vriesdroger bij min 45 graden Celsius en 0,2 millibars druk. Los vervolgens de lyophilized GelMA op in PBS aangevuld met 10%foetaal runderserum, 25 millimolar HEPES en 0,5%fotoinitiator.

Om de zijdefibroine GelMA bioinks te verkrijgen, meng de GelMA-oplossing met verschillende volumes van de initiële zijdefibroinoplossing en verschillende volumes PBS zoals voorgesteld in de tabel. Wanneer alle bioinks zijn voorbereid, sonicate de oplossing voor 10 tot 20 minuten. Terwijl de inkten sonicating, verzamel de cellen van een 80%confluent NIH/3T3 celcultuur in een 15-milliliter conische buis per bioink oplossing, en pellet de cellen door centrifugatie.

Dan zorgvuldig aspirate de supernatants en resuspend de cellen in elke buis met twee milliliter bioink op een een keer 10 tot de zes cellen per milliliter van bioink oplossing concentratie. Om de bioink voor het afdrukken te laden, voeg je 400 microliters van met celbeladen zijdefibroine 0,5 GelMA toe aan de onderste laag van een spuit van twee milliliter. Plaats de spuit vijf minuten in een ijswaterbad van nul graden Celsius om de onderste laag bioink om te zetten in een geltoestand voordat u 400 microliters met celbeladen zijdefibroine 0,75 GelMA bioink over de laag zijdefibroine 0,5 GelMA laadt.

Breng de spuit vervolgens vijf minuten terug naar het ijsbad en voeg elke extra concentratie van celbeladen bioink op dezelfde manier toe aan de spuit. Wanneer een meerlaags bioinksysteem met verschillende concentraties zijdefibroin binnen de verschillende lagen is bereikt, verwarmt u het bioink gedurende 30 minuten in een couveuse van 37 graden Celsius. Laad aan het einde van de incubatie een 27-meter printmond op de spuit en stel de stroomsnelheid in op 50 microliters per minuut, de bewegende snelheid van het mondstuk op twee milliliter per seconde en de hoogte van het mondstuk op een millimeter.

Vervolgens printen het weefsel te bouwen in een extrusie manier met behulp van een op maat gemaakte bioprinter bij kamertemperatuur, en cross-link de bioprinted weefsel constructie met 365 nanometer ultraviolet licht gedurende 40 seconden op 800 milliwatt. Kweek vervolgens het met elkaar verbonden weefsel in DMEM aangevuld met 10%foetaal runderserum en 1%penicilline-streptomycine in een celkweek incubator, waarbij het medium gedurende de eerste twee dagen en daarna om de twee tot drie dagen om de acht uur verandert. In deze representatieve analyse, naarmate de bioprintprocedure vorderde, nam de dichtheid van cellen in de doelputten in alle groepen af.

In de zijdefibroine nul GelMA groep, ongeveer 70% van de cellen werden afgezet in de onderste laag. In de zijdefibroine één groep GelMA, werden ongeveer 40% van de cellen gedeponeerd in de bodemlaag, en ongeveer 5% van de cellen werden gedeponeerd in de hoogste laag. In de zijdefibroin meerlaagse GelMA-groep was de afzetting van ingekapselde cellen homogener dan die van de controlegroepen.

Het meest kritische onderdeel van dit protocol is het laden van de SF-GelMA bioink multilayers. Dit protocol kan worden toegepast op andere extrusie bioprinting analyse die vloeibare-achtige bioinks gebruiken.