Name: Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer een meerlaagse bioink-strategie met gelatinemethacryloyl voor 3D-bioprinting. Deze methode voorkomt celsedimentatie en zorgt voor homogene celdistributie in weefselconstructen voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 en 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) en Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Voorbereiding van met cellen beladen SF-GelMA
<ol><li>Steriliseer alle materialen met behulp van 0,22 μm spuitfilterunits. Voer alle stappen uit in een biologische veiligheidskast.</li>
	<li>Verwarm 1x PBS tot 50 °C en los gelatine op in de verwarmde 1x PBS met roeren. De uiteindelijke concentratie gelatine in PBS moet 10% (w/v) zijn.</li>
	<li>Voeg methacrylic anhydride toe aan de gelatineoplossing (gewichtsverhouding van methacrylic anhydride tot gelatine van 0,6 tot 1) langzaam met roeren en meng het complex gedurende ten minste 1 h (50 °C). Bereid doorgaans 200 mL van 10% gelatineoplossing voor met 12 g methacrylic anhydride; het volume is afhankelijk van de behoeften van de studie.</li>
	<li>Breng de gemengde oplossing met gelatine en methacrylic anhydride over in een steriele buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeren de gemengde oplossing op 3.500 x g. Het duurt meestal 3-5 min om twee lagen te verkrijgen. Verzamel de bovenste laag (GelMA) en gooi de onderste laag (niet-gereageerde methacrylic anhydride) weg.</li>
	<li>Verdun de in stap 1,5 verkregen oplossing met twee volumes gedeïnoneerd water (40−50 °C).</li>
	<li>Dialyze de oplossing verkregen in stap 1.6 met een 12-14 kDa moleculair gewicht cutoff dialyse membraan tegen gedeïemiseerd water gedurende 5−7 dagen (40−50 °C). Verander het water twee keer per dag.</li>
	<li>Verzamel en bevries de GelMA-oplossing 's nachts bij −80 °C.</li>
	<li>Lyophilize de GelMA-oplossing gedurende 3−5 dagen in een vriesdroger met de temperatuur ingesteld op -45 °C en de druk ingesteld op 0,2 mbar.</li>
	<li>Los de gelyofiliede GelMA op (mate van substitutie van ongeveer 75%) in 1x PBS met 10% FBS (foetaal runderserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethaan-sulfonic acid) en fotoinitiator (0,5%, w/v) om het GelMA bioinkpreparaat te verkrijgen. OPMERKING: De mate van substitutie van GelMA kan worden berekend door een ninhydrinetest3.</li>
	<li>Meng de GelMA-oplossing (10%, w/v) met verschillende volumes initiële SF-oplossing (5%, w/v) en verschillende volumes van 1x PBS om SF-GelMA-bioinks met verschillende concentraties SF te verkrijgen. Het aandeel per 1 mL gelma- en SF-oplossing in de verschillende bioinks wordt gepresenteerd in tabel 1. OPMERKING: Alle bioinks moeten een uiteindelijke concentratie van 5% (w/v) GelMA bevatten, maar de concentratie van SF varieert: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 en 1,5% (w/v) in de verschillende SF-GelMA-bioinks. Gebruik SF-M-Layered-GelMA om de GelMA bioink gewijzigd met SF op een laag-voor-laag manier te noemen. Gebruik SF-X-GelMA om die GelMA die met SF wordt gewijzigd op een homogene manier te noemen (b.v., werd GelMA met wijziging van 1% SF genoemd SF-1-GelMA).</li>
	<li>Sonicate alle bioinks voor 10-20 min.</li>
	<li>Kweek NIH3T3-cellen met DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine in een incubator (37 °C met 5% CO2). Doorsnee de cellen met een verhouding van 1:3 wanneer de dichtheid 80% bereikt.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie van NIH3T3 cellen bij 1500 tpm gedurende 5 min. Verwijder de supernatant met zuigkracht en zet de celpellet opnieuw op met verse bioinkoplossing in een steriele buis van 15 mL. OPMERKING: De concentratie van de ingekapselde cellen in het bioink moet 1 x 106 cellen/mL zijn en de concentratie moet worden berekend met een cytometer.</li>
	<li>Gebruik 2 mL van verschillende SF-GelMA bioinks om de celpellets op te schorten om verschillende celbeladen bioinks te verkrijgen.</li>
</ol>2. Laden, opwarmen en bioprinten van de SF-M-Layered-GelMA
<ol><li>Laad 0,4 mL met celbeladen SF-0,5-GelMA in de onderste laag van de spuit. LET OP: Gebruik een 2 mL spuit als het bioink reservoir in deze studie. Laad verschillende SF-GelMA bioinks op een laag-voor-laag manier in de spuit.</li>
	<li>Plaats de spuit 5 minuten in ijswaterbad (0 °C) om de onderste laag bioink te laten transformeren in een geltoestand.</li>
	<li>Laad 0,4 mL met celbeladen SF-0,75-GelMA bioink boven de onderste laag.</li>
	<li>Plaats de spuit met de twee lagen bioinks gedurende 5 minuten in een ijswaterbad (0 °C) om de twee lagen bioinks te laten transformeren in een geltoestand.</li>
	<li>Fiets de laad- en koelstappen nog 3 keer met de overige 3 soorten bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) om een meerlaags bioinksysteem te verkrijgen met verschillende concentraties SF in de verschillende lagen. Het volume dat wordt gebruikt voor het laden van alle bioinks moet 0,4 mL zijn.</li>
	<li>Verwarm het meerlaagse bioink op door de spuit 30 minuten in een couveuse (37 °C) te plaatsen voorafgaand aan bioprinting.</li>
	<li>Gebruik een 2 mL spuit als het bioink reservoir met een 27 G printmond. Stel de doorstromingssnelheid in op 50 μL/min, de bewegingssnelheid van het mondstuk op 2 mm/s en de hoogte van het mondstuk op 1 mm. Voer de bioprintprocedure uit bij kamertemperatuur (ongeveer 20 °C).<ol>
<li>Print de weefselconstructie op een extrusiemanier met behulp van een op maat gemaakte bioprinter onder de parameters die zijn aangepast aan onze vorige studies11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik ultraviolet licht (365 nm, 800 mW) voor 40 s om de bioprinted weefselconstructie te crosslinken.</li>
	<li>Kweek het kruisgekoppelde weefsel in DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine in een incubator (37 °C met 5% CO2). Het medium werd elke 8 uur veranderd tijdens de eerste 2 dagen en elke 2-3 dagen daarna.</li>
</ol>

<ol><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li>
<li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting%3A+from+benches+to+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510(2019).</li>
<li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization%2C+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li>
<li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li>
<li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).</li>
<li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De stabiliteit van het meerlaagse systeem is een belangrijk punt om dit protocol succesvol uit te voeren. We hebben theoretisch de verspreiding van SF-moleculen in de GelMA-oplossing berekend op basis van Naumans studie13. Men vond dat de verspreiding van proteïnen in oplossing met hun moleculair gewicht verwant was. Het gemiddelde molecuulgewicht (MW) van runderserum albumine (BSA) is 66,5 kDa en de diffusiecoëfficiënt is 64-72 μm2/s. De gemiddelde MW van fibrinogen is 339,7 kDa, en de...

Driedimensionale (3D) bioprinting is een veelbelovende methode voor de vervaardiging van complexe architectonische en functionele replica's van inheemse weefsels in biofabricage en regeneratieve geneeskunde1,2,3. De gemeenschappelijke strategieën van bioprinting, met inbegrip van inkjet, extrusie, en stereolithografie afdrukken, hebben voors en tegens vanuit verschillende perspectieven4. Onder deze technieken wordt de extrusieprocedure het meest gebruikt vanwege de kosteneffectiviteit. Bioink speelt een sleutelrol in de processtabiliteit van extrusie bioprinting. De ideale cel-beladen bioink moet niet alleen biocompatibel zijn, maar ook geschikt zijn voor mechanische eigenschappen5. Bioinks met een lage viscositeit worden meestal gepresenteerd als een vloeibare toestand. Deze bioinks kunnen gemakkelijk en snel worden afgezet en voorkomen dat celmembraan schade veroorzaakt door hoge schuifspanning tijdens extrusie. In complexe gevallen die lange termijn afdrukperioden vereisen, leidt een lage viscositeit echter vaak tot de onvermijdelijke sedimentatie van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir, wat meestal wordt aangedreven door de zwaartekracht en leidt tot een inhomogene celdispersie in het bioink6,7. Bijgevolg belemmert een bioink met inhomogene celdisperding de in vitro bioprinting van een functionele weefselconstructie.
Verschillende recente studies gericht op bioinks hebben gemeld de bevordering van homogene dispersiteit van ingekapselde cellen. Een gemodificeerde alginaat bioink op basis van dual-stage crosslinking werd gebruikt voor extrusie bioprinting8. Een alginaat polymeer werd gewijzigd met peptiden en eiwitten in deze studie. Cellen presenteerden een meer homogene verdeling in deze gemodificeerde alginaat dan in de veelgebruikte alginaat als gevolg van de gehechtheid sites die door de peptiden en de eiwitten. Als alternatief zijn gemengde bioinks gebruikt om de sedimentatie van cellen in bioink op te lossen. Een blended bioink met polyethyleenglycol (PEG) en gelatine of gelatine methacryloyl (GelMA) met verbeterde mechanische robuustheid werd gebruikt in een andere studie9. De ingekapselde cellen vertoonden een homogene verdeling, vooral omdat de viscositeit van het gemengde bioink werd verbeterd. In het algemeen zijn er verschillende factoren die van invloed zijn op de verspreiding van de ingekapselde cellen in het bioink, zoals de viscositeit van het bioink, de zwaartekracht van de cellen, de dichtheid van de cellen en de duur van de werkperiode. Onder deze factoren speelt de zwaartekracht van cellen een cruciale rol bij het bevorderen van sedimentatie. Het drijfvermogen en de wrijving die door de viskeuze bioink zijn onderzocht als de belangrijkste krachten tegen de zwaartekracht tot op heden10.
Hierin ontwikkelden we een nieuwe strategie om homogene dispersie van de ingekapselde cellen in bioink te bevorderen door meerdere vloeibare interfaces in het bioinkreservoir te manipuleren. Deze vloeibare interfaces die door de meerlaagse modificatie van bioink worden gecreëerd, kunnen niet alleen interfaciale retentie bieden, wat de sedimentatie van cellen vertraagt, maar ook een geschikt biocompatibiliteits- en rheologisch gedrag van het bioink behoudt. In de praktijk hebben we waterige GelMA-oplossing (5%, w/v) met zijdefibroine (SF) op een meerlaagse manier aangepast om in de lengterichting vier interfaces te produceren, waardoor interfaciale spanningen in het gemengde bioink worden ondersteund. Als gevolg hiervan werd de zwaartekrachtbelasting op de cellen gecompenseerd door de door de mens gemaakte interfaciale spanning, en een bijna homogene dispersie van de ingekapselde cellen in de bioink werd verkregen als gevolg van minder sedimentatie over de aangrenzende lagen cellen. Geen soortgelijk protocol om de sedimentatie van ingekapselde cellen te vertragen door het manipuleren van interfaciale retentie in vloeibare bioinks is gemeld tot op heden. We presenteren ons protocol hier om een nieuwe manier aan te tonen om celsedmentatie in bioprinting op te lossen.

<table><tbody><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon (PI2959)</td><td>TCI</td><td>M64BK-QD</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900863MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylzuuranhydride (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine antibiotica</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Zijdefibroïne</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5154</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van meerlaagse hydrogel bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Tijdens het op extrusie gebaseerde driedimensionale bioprintingproces kunnen vloeibare bioinks met een lage viscositeit cellen beschermen tegen membraanschade veroorzaakt door schuifstress en de overleving van de ingekapselde cellen verbeteren. Snelle celsedmentatie op basis van zwaartekracht in het reservoir kan echter leiden tot een inhomogene celverdeling in bioprintstructuren en dus de toepassing van vloeibare bioinks belemmeren. Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (bijvoorbeeld gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen. Meerdere vloeibare interfaces werden gemanipuleerd in de meerlaagse bioink om interfaciale retentie te bieden. Bijgevolg werd de celsedmentatieactie die over aangrenzende lagen in het meerlaagse systeem ging, vertraagd in het bioinkreservoir. Er werd vastgesteld dat de interfaciale retentie veel hoger was dan de sedimentale aantrekkingskracht van cellen, wat een cruciale rol aantoont van de interfaciale retentie bij het voorkomen van celsedimentatie en het bevorderen van een meer homogene dispersie van cellen in het meerlaagse bioink.

Een schema van de bereiding van met cellen beladen bioinks is weergegeven in figuur 1. Na de bereiding van de verschillende bioinks werden laden, opwarmen en bioprinten uitgevoerd (figuur 2). Om de verdeling van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir te evalueren, werd een bioprinting procedure uitgevoerd met behulp van drie verschillende celbeladen bioinks in drie 96-putplaten(figuur 3A). Twee controlegroepen (ongerepte GelM...

Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om de sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen.

Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Met behulp van ons protocol bevordert de meerlaags van de vloeibare bioinkverdunningen niet alleen een homogene dispersie van de ingekapselde cellen, maar behoudt het ook een celgeschlene bioinkomgeving. We gebruiken de interfaciale spanning om de sedimentatie van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir te stoppen, waardoor de hoge schuifspanningsbelasting voor de cellen tijdens extrusiedruk wordt vermeden. Met behulp van deze technologie kunnen we 3D-weefselconstructies genereren met een homogene celdistributie, die een functionele in vitro weefselmalrij biedt voor gebruik in medicijnscreening en regeneratiegeneeskundestudies.Bij het voorbereiden van de bioink is het belangrijk om aandacht te besteden aan de experimentele temperatuur en de hygrogelbeladingsprocedure, omdat deze factoren de kwaliteit van de inkt kunnen beïnvloeden. Gebruik voor het begin van de voorbereiding 0,22-micrometer spuitfiltereenheden om alle materialen te steriliseren en gelatine op te lossen tot een 10%-eindconcentratie in 50-graden-Celsius PBS in een biologische veiligheidskast. Voeg methacrylic anhydride toe aan de gelatineoplossing bij een gewichtsverhouding van 0,6 tot één met langzaam roeren gedurende ten minste een uur bij 50 graden Celsius.Breng aan het einde van de incubatie de gemengde oplossing over in een steriele buis van 50 milliliter en scheid de oplossing in lagen door centrifugatie. Verzamel de bovenste GelMA-laag en verdun de verzamelde oplossing met twee volumes van 40 tot 50 graden Celsius gedeïmiseerd water. Dialyze de GelMA oplossing met een 12 tot 14-kilodalton moleculair gewicht cutoff dialyse membraan tegen gedeïmiseerd water gedurende vijf tot zeven dagen bij 40 tot 50 graden Celsius, het veranderen van het water twee keer per dag.Aan het einde van de dialyse, bevriezen de GelMA oplossing op min 80 graden Celsius 's nachts. Vervolgens lyophilize de GelMA oplossing voor drie tot vijf dagen in een vriesdroger bij min 45 graden Celsius en 0,2 millibars druk. Los vervolgens de lyophilized GelMA op in PBS aangevuld met 10%foetaal runderserum, 25 millimolar HEPES en 0,5%fotoinitiator.Om de zijdefibroine GelMA bioinks te verkrijgen, meng de GelMA-oplossing met verschillende volumes van de initiële zijdefibroinoplossing en verschillende volumes PBS zoals voorgesteld in de tabel. Wanneer alle bioinks zijn voorbereid, sonicate de oplossing voor 10 tot 20 minuten. Terwijl de inkten sonicating, verzamel de cellen van een 80%confluent NIH/3T3 celcultuur in een 15-milliliter conische buis per bioink oplossing, en pellet de cellen door centrifugatie.Dan zorgvuldig aspirate de supernatants en resuspend de cellen in elke buis met twee milliliter bioink op een een keer 10 tot de zes cellen per milliliter van bioink oplossing concentratie. Om de bioink voor het afdrukken te laden, voeg je 400 microliters van met celbeladen zijdefibroine 0,5 GelMA toe aan de onderste laag van een spuit van twee milliliter. Plaats de spuit vijf minuten in een ijswaterbad van nul graden Celsius om de onderste laag bioink om te zetten in een geltoestand voordat u 400 microliters met celbeladen zijdefibroine 0,75 GelMA bioink over de laag zijdefibroine 0,5 GelMA laadt.Breng de spuit vervolgens vijf minuten terug naar het ijsbad en voeg elke extra concentratie van celbeladen bioink op dezelfde manier toe aan de spuit. Wanneer een meerlaags bioinksysteem met verschillende concentraties zijdefibroin binnen de verschillende lagen is bereikt, verwarmt u het bioink gedurende 30 minuten in een couveuse van 37 graden Celsius. Laad aan het einde van de incubatie een 27-meter printmond op de spuit en stel de stroomsnelheid in op 50 microliters per minuut, de bewegende snelheid van het mondstuk op twee milliliter per seconde en de hoogte van het mondstuk op een millimeter.Vervolgens printen het weefsel te bouwen in een extrusie manier met behulp van een op maat gemaakte bioprinter bij kamertemperatuur, en cross-link de bioprinted weefsel constructie met 365 nanometer ultraviolet licht gedurende 40 seconden op 800 milliwatt. Kweek vervolgens het met elkaar verbonden weefsel in DMEM aangevuld met 10%foetaal runderserum en 1%penicilline-streptomycine in een celkweek incubator, waarbij het medium gedurende de eerste twee dagen en daarna om de twee tot drie dagen om de acht uur verandert. In deze representatieve analyse, naarmate de bioprintprocedure vorderde, nam de dichtheid van cellen in de doelputten in alle groepen af.In de zijdefibroine nul GelMA groep, ongeveer 70% van de cellen werden afgezet in de onderste laag. In de zijdefibroine één groep GelMA, werden ongeveer 40% van de cellen gedeponeerd in de bodemlaag, en ongeveer 5% van de cellen werden gedeponeerd in de hoogste laag. In de zijdefibroin meerlaagse GelMA-groep was de afzetting van ingekapselde cellen homogener dan die van de controlegroepen.Het meest kritische onderdeel van dit protocol is het laden van de SF-GelMA bioink multilayers. Dit protocol kan worden toegepast op andere extrusie bioprinting analyse die vloeibare-achtige bioinks gebruiken.

using-multilayered-hydrogel-bioink-three-dimensional-bioprinting-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Dit artikel beschrijft een methode voor het transformeren van een goedkope commerciële 3D-printer in een bacteriële 3D-printer die het afdrukken van gedessineerde biofilmen kan vergemakkelijken. Alle noodzakelijke aspecten van de voorbereiding van de bioprinter en bio-Ink worden beschreven, evenals verificatiemethoden om de vorming van biofilmen te beoordelen.

Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter

Hier gepresenteerd is een methode voor de 3D bioprinten van gelatine methacryloyl.

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Deze studie introduceert een nieuw κ-carrageen sub-microgel suspensiebad, dat opmerkelijke omkeerbare jamming-unjamming overgangseigenschappen vertoont. Deze eigenschappen dragen bij aan de opbouw van biomimetische weefsels en organen in ingebedde 3D-bioprinting. Het succesvol printen van hart-/slokdarmachtige weefsels met hoge resolutie en celgroei demonstreert hoogwaardige bioprinting- en tissue engineering-toepassingen.

Ingebedde bioprinting van weefselachtige structuren met behulp van κ-carrageen sub-microgelmedium

Leer een meerlaagse bioink-strategie met gelatinemethacryloyl voor 3D-bioprinting. Deze methode voorkomt celsedimentatie en zorgt voor homogene celdistributie in weefselconstructen voor regeneratieve geneeskunde.

Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

Meer video's verkennen