Name: Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryos met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Leer gestandaardiseerde weefselanalyse voor congenitale hartafwijkingen in muizenembryo's met kwalitatieve en kwantitatieve methoden. Deze technieken verbeteren cardiologische diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Aguirre Lab wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder award nummer K01HL135464 en door de American Heart Association onder award nummer 19IPLOI34660342.

<ol><li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li>
<li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Heart+Disease%3A+Causes%2C+Diagnosis%2C+Symptoms%2C+and+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li>
<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li>
<li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+congenital+heart+disease%3A+The+glass+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li>
<li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li>
<li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li>
<li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+in+the+single+ventricle+population%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li>
<li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li>
<li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+Fontan+palliation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li>
<li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease%3A+part+II.+Clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery+%3A+Official+Journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li>
<li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects%3A+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li>
<li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood+-+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li>
<li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+%3A+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506(2015).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015(2016).</li>
<li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li>
<li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+toward+heart+regeneration%3A+Stem+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+or+breaking+the+heart%3A+from+lineage+determination+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).</li>
<li>Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).</li>
<li>Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).</li>
<li>Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).</li>
<li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22IJC+Heart+and+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li>
<li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+in+the+Child+and+Young+Adult%3A+From+Bench+to+Bedside%22%5BJournal%5D)">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , Elsevier. 269-290 (2018).</li>
<li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction%3A+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen te melden.

Dit protocol onderzoekt de technieken die betrokken zijn bij de analyse van de hartontwikkeling in embryonale harten. Sommige beperkingen van deze methode zijn de vereiste fysieke behendigheid voor de voorbereidende technieken, die oefening kunnen vereisen, en vaardigheid met microscoopbeeldvorming. Als de plakjes verkregen op de cryostat zijn rommelig, de hematoxyline en eosine vlekken zal niet duidelijk zijn, of als de beelden genomen op de microscoop hebben slechte verlichting, dan is de methode die wordt gebruikt met...

CHDs zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens en zijn de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijking gerelateerde sterfgevallen1,2,3,4,5,6. Hoewel ongeveer 90% van de pasgeboren kinderen CHD overleven, wordt het in de loop der jaren vaak geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en medische ingrepen, die een zware last opleggen voor het leven van de patiënten en het gezondheidszorgstelsel7,8,9,10. Buiten zuiver genetische factoren, zijn de oorzaken van CHD slecht begrepen4. Niet-geïdentificeerde oorzaken zijn goed voor ~ 56-66% van alle CHD gevallen volgens de American Heart Association en andere bronnen2,3,4,11. Bekende factoren zijn genetische mutaties, CV's, de novo single nucleotide varianten en aneuploïdie. Het vermoeden bestaat dat milieu- en voedingsfactoren ook belangrijke bronnen zijn die bijdragen aan CHD, zoals blijkt uit epidemiologische studies die de levensstijl van moeders met elkaar verbinden2,12, economische ontbering en ras13, en door onderzoek naar voedingsfactoren zoals foliumzuur11,14 en het bioactieve lipideretinoïnezuur15,16. Het onderzoeken van de mechanismen en oorzaken van CHD en andere cardiovasculaire defecten is belangrijk om preventieve strategieën en nieuwe therapeutische optiesteontwikkelen 1,4,17,18,19.
De ontwikkelende muis is een hoeksteenmodel voor het bestuderen van CHD bij zoogdieren. Echter, sommige van de gebruikte methoden en analyses, zoals dissecties behoud van hartmorfologie, analyse van ontwikkelingsstadia, en de identificatie van CHD-geassocieerde gebreken, kan ontmoedigend zijn voor wetenschappers die nieuw zijn voor de analyse van murine harten. Het doel van de in dit protocol beschreven methoden is om kwalitatieve en kwantitatieve richtlijnen voor deze processen aan te bieden. Zo leggen we in dit protocol uit hoe getimede paringen kunnen worden uitgevoerd om embryo's van het gewenste zwangerschapsstadium te produceren, zwangere vrouwtjes te ontleden voor intact hartherstel (inclusief bijbehorende weefsels zoals het uitstroomkanaal), hartfixatie en voorbereiding cryostat sectioning, basis histologie methoden, kwantitatieve analyses van gemeenschappelijke hartafwijkingen, en kwalitatieve analyse van hartspier verdichting, een gemeenschappelijke voorloper fenotype voor sommige soorten CHD.

<table><tbody><tr><td>15 mL Conical Tube(s)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Muizen</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Staining Jars (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiebakjes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fijne Tang (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y-oplossing</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fijne Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Stereo Microscoop Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Tang</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematexylin-oplossing</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettip(s) - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CkX53 Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verfpenselen (minstens 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>Maak een 4% oplossing (opgelost in PBS)</td></tr><tr><td>Pasteur Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Verdun van 10x naar 1x voor gebruik</td></tr><tr><td>Schaal</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Schaal</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handvat #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Bladen</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante Mal</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Voor OCT mal</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Wegwerp Microtoompes</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Reisschaal</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Aangeboren hartafwijkingen (CHD) zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens, die tot 1% van alle levende geboorten. Echter, de onderliggende oorzaken voor CHD zijn nog steeds slecht begrepen. De ontwikkelende muis vormt een waardevol model voor de studie van CHD, omdat cardiale ontwikkelingsprogramma's tussen muizen en mensen sterk worden bewaard. Het protocol beschrijft in detail hoe muisembryo's van het gewenste zwangerschapsstadium kunnen worden geproduceerd, methoden om het hart te isoleren en te behouden voor downstreamverwerking, kwantitatieve methoden om gemeenschappelijke soorten CHD te identificeren door histologie (bijv. ventriculaire septal defecten, atriumseptale defecten, octrooiductus arteriosus), en kwantitatieve histomorfometrie methoden om gemeenschappelijke spierverdichting fenotypes te meten. Deze methoden articuleren alle stappen die betrokken zijn bij monstervoorbereiding, verzameling en analyse, waardoor wetenschappers CHD correct en reproducibly kunnen meten.

De spierverdichtingsindex werd vergeleken tussen harten die zich ontwikkelden onder twee verschillende omgevingen, een controle en een experimentele groep. Deze protocollen werden gebruikt om de verdichting van spierweefsel kwantitatief te analyseren, wat statistische analyse mogelijk maakte. Spierverdichting bleek aanzienlijk te zijn verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich ontwikkelden in niet-experimentele omstandigheden.
<p class="jove_content" f...

In dit protocol beschrijven we procedures om ontwikkelingsfenotypes bij muizen geassocieerd met aangeboren hartafwijkingen kwalitatief en kwantitatief te analyseren.

Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Dit protocol standaardiseert nieuwe weefselanalysetechnieken, zodat ze op grotere schaal kunnen worden gebruikt door andere groepen die ook aangeboren hartafwijkingen bestuderen. Aangezien zowel kwalitatieve als kwantitatieve analysetechnieken hun voor- en nadelen hebben, gebruikt deze methode beide om het breedste scala aan experimentele vragen aan te pakken. Deze technieken kunnen een positieve invloed hebben op diagnostische methoden voor cardiologie.Pathologen kunnen bijvoorbeeld onze microscopische hartweefselanalysetechnieken toepassen op de diagnose van menselijke hartziekten uit biopsiemonsters. Dit protocol kan worden gebruikt voor ontwikkelingscardioloog of algemeen cardiologieonderzoek. Echter, deze methoden bieden ook verschillende nuttige technieken die kunnen worden toegepast op elke weefselanalyse.Om embryonale dag 15 tot 15,5 harten te verzamelen, de ledematen van een zwangere moeder vast te zetten en rond de plasbuis tot aan het borstbeen te beginnen, maak voorzichtig een I-vormige incisie langs de romp. Met behulp van tangen in een scheppende beweging, til voorzichtig de baarmoeder uit de buikholte grijpen de oppervlakkige weefsels van de baarmoeder als dat nodig is met fijne tangen om te helpen bij de extractie. Gebruik een schaar om de baarmoeder uit de buik te bevrijden.Na het weken van de baarmoeder in ijskoude PBS, speld het orgaan in een dissectieschotel. Snijd met een schaar de baarmoeder in afzonderlijke secties die elk een apart embryo bevatten. Pel met behulp van twee paar fijne tangen de embryo's voorzichtig uit het baarmoederweefsel en plaats ze in een nieuwe petrischaal met vier graden Celsius PBS-EDTA.Om de harten te verzamelen, plaats de schotel onder een ontledende microscoop en gebruik twee paar fijne tangen om het embryo in de supinepositie te plaatsen. Na het stabiliseren van de toegang tot de borst, gebruik het scherpe punt van een tweede paar fijne tangen om een incisie te maken langs het borstbeen van het embryo dat zich uitstrekt tussen de sleutelbeenderen naar de navel. Het maken van zeer fijne en oppervlakkige incisies terwijl geleidelijk werken naar de binnenkant van de borstholte, open de buik van het embryo.Wanneer het hart net zichtbaar wordt, gebruik dan een paar tangen om de romp iets vertroeteld naar de ribbenkast te knijpen om de ribben open te pellen. Met behulp van de zijkanten van een paar tangen, voorzichtig pak de longbloedvaten zonder het scheiden van het weefsel en trek het hart uit de holte. Reinig het hart in verse PBS-EDTA gedurende een tot twee minuten voordat u het weefsel in 4% Paraformaldehyde gedurende 45 tot 60 minuten vastbindt.Was vervolgens het hart drie keer gedurende 5 tot 10 minuten per wasbeurt in PBS aangevuld met glycine. Voor het opslaan van de harten in PBS op vier graden Celsius. Om het hart voor te bereiden op cryosectioning, plaats de monsters in een buis van 30% sacharose en PBS op vier graden Celsius gedurende 24 tot 40 uur.Wanneer de harten zijn gezonken naar de bodem van de buis, gebruik dan een Pasteur Pipette met een aangepaste tip om zorgvuldig over te dragen elk hart tot een stuk pluisjes gratis doekje. Na een korte luchtdroging, plaats elk monster in individuele optimale snijtemperatuur mallen in de gewenste oriëntaties voor sectie. Dompel de weefsels onder in een optimaal snijtemperatuurmedium zonder bellen.Bewaar vervolgens de mallen op 20 graden Celsius voor maximaal een paar dagen voor het bevriezen van de weefsels op 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur voordat cryosectioning. Om cryostat secties van de monsters te verkrijgen, gebruik maken van verse optimale temperatuur snijden medium om het weefsel blok van belang hechten aan de chuck van de cryostat en laat het medium te bevriezen totdat het ondoorzichtig wit. Plaats een nieuw mes en pas de afstand tussen het weefselblok en het mes aan om secties te kunnen verkrijgen.Trim het blok in plakjes van 10 micrometer totdat het punt van belang is bereikt. Wanneer het weefsel kan worden waargenomen, gebruik dan een kleine platte kwast om het plakje voorzichtig tegen de standaard te trekken in een continue snijbeweging. Zodra het weefsel volledig is doorgesneden, gebruik maken van de detail borstel om de slice naar beneden plat tegen het podium dep.Houd de sectie ongeveer 20 tot 30 seconden op zijn plaats voordat u het gedetailleerde penseel verwijdert en het segment afmaakt. Gebruik beide kwasten om het segment voorzichtig plat tegen het podium te voorkomen dat rollen en houd het weefsel gedeelte tegen het podium. Na 20 tot 30 seconden, draai de sectie en plat het tegen het podium opnieuw voor het plaatsen van een elektrostatisch geladen dia dicht genoeg voor het segment te worden aangetrokken en hechten aan de dia zonder de dia aan te raken aan het podium.Om de hartweefselsecties te evalueren op de aanwezigheid van veelvoorkomende hartafwijkingen, met behulp van een microscoop uitgerust met een camera, verkrijgen van beelden bij 5 tot 10X en 40X vergrotingen. Voor cardiale spierverdichtingsanalyse, open een weefsel van belang in een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en stel het beeld in op 8-bits. Als u de drempelwaarde van de afbeelding wilt instellen, klikt u op Afbeelding, Aanpassen en Drempelwaarden en verplaatst u de bovenste balk om de drempelwaarde aan te passen totdat alleen de pixels voor de achtergrond zijn geselecteerd.Gebruik vervolgens het gereedschap veelhoekselecties om een interessegebied rond het weefsel te tekenen en klik vervolgens op Analyseren, Metingen, Gebied en Limiet instellen op drempelwaarde. Klik op Analyseren en meten om het gebied van de gemarkeerde pixels te meten om de waarde van het gebied van de negatieve ruimte te verkrijgen. Als u het gebied van het hele interessegebied wilt meten, klikt u op Analyseren, Metingen instellen en schakelt u Limiet uit tot drempelwaarde.Selecteer vervolgens Analyseren en meten om het hele gebied van het geselecteerde interessegebied te meten. Als u het gebied van spierweefsel wilt berekenen, trekt u het gebied van negatieve ruimte af van het gebied van de regio van belang. Dan verdelen het gebied van spierweefsel door het gebied van de regio van belang om de spier verdichting en X.The kleuring van weefsel plakjes van geoogste embryonale harten te berekenen, biedt genoeg contrast om uit te maken van de weefselranden, maar is niet zo donker om de cel functies niet te onderscheiden.In deze representatieve analyse werd de spierverdichting waargenomen dat deze aanzienlijk was verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich onder niet-experimentele omstandigheden ontwikkelden. Deze monsters zijn waardevol en vereisen een lange tijd om te maken. Tijdens necropsies en de cryostat sectie specifiek, zorg ervoor dat opzettelijk over elke actie die u uitvoert.Het behoud van de weefsels in Paraformaldehyde behoudt de antigeenactiviteit waardoor de monsters kunnen worden gebruikt voor tests zoals aminofluoresceïne-vlekken die helpen bij het identificeren van pathologische oorzaken die tijdens de morfologiebeoordeling zijn gevonden. In ons lab kregen we een kwantitatieve weergave van experimentele behandelingen die ons kunnen helpen om te bepalen in welke mate verschillende behandelingen onze monsters beïnvloeden. Paraformaldehyde kan elk weefsel dat het aanraakt repareren.Zorg ervoor dat u altijd handschoenen draagt om de blootgestelde huid te minimaliseren en om in een filmkap te werken wanneer u met deze chemische stof werkt.

analysis-congenital-heart-defects-mouse-embryos-using-qualitative

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Foetale en perinatale sterfte is een gemeenschappelijk kenmerk bij het bestuderen van genetische veranderingen die van invloed cardiale ontwikkeling. Hoogfrequente echografie is verbeterd 2-D resolutie en kan uitstekende informatie te verstrekken over de vroege ontwikkeling van het hart en is een ideale methode om de impact op cardiale structuur en functie te detecteren voorafgaand aan het overlijden.

Murine Foetale echocardiografie

Ultra-hoge frequentie echografie is een krachtige live-imaging tool om cardiale afwijkingen in kleine proefdieren. Zijn noninvasiveness maakt het handhaven van de fysiologische toestand van de embryo's. Hierin tonen we het gebruik van M-mode echo om de hartslag van embryo meten E18.5 in de baarmoeder.

In utero Meting van de hartslag in de Muis door invasieve M-mode echocardiografie

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Echocardiographic onderzoek wordt vaak gebruikt in muizen. Dure high-resolution echografie apparaten zijn ontwikkeld voor dit doel. Dit protocol beschrijft een betaalbare echocardiographic procedure gecombineerd met histologische Morfometrische analyses om te bepalen van cardiale morfologie.

Echocardiographic en histologisch onderzoek van cardiale morfologie in de muis

Hier beschrijven we een protocol voor hele mount immunofluorescentie en beeld-gebaseerde kwantitatieve volumetric analysis van vroege fase muis embryo's. Wij presenteren deze techniek als een krachtige aanpak van kwalitatief en kwantitatief cardiale structuren beoordelen tijdens de ontwikkeling, en voor te stellen dat het wellicht grote schaal aan te passen aan andere orgaansystemen.

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

Hoge-frequentie echografie beeldvorming van de foetale muis kan imaging resolutie is verbeterd en nauwkeurige niet-invasieve karakterisering van cardiale ontwikkeling en structurele gebreken. Het protocol hierin geschetst is ontworpen om uit te voeren real-time foetale muizen echocardiografie in vivo.

Foetale muis cardiovasculaire Imaging met behulp van een systeem van hoge-frequentie echografie (30 / 45MHZ)

We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.

Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

Dit artikel beschrijft de diagnostische methoden voor congenitale hartziekten (CHD) met behulp van foetale echocardiografie, obductie en episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) met behulp van episcopische confocale microscopie (ECM) gevolgd door driedimensionale (3D) reconstructie.

Een pijplijn om structurele hartafwijkingen in de foetale muis te karakteriseren

Hier melden we dubbele etikettering van neurale kuifcellen en bloedvaten met behulp van chickGFP neurale buis intraspecies enting in combinatie met intra-vasculaire DiI injectie. Deze experimentele techniek stelt ons in staat om tegelijkertijd de ontwikkeling van het NCC-afgeleide (enterische) zenuwstelsel en het vasculaire systeem te visualiseren en te bestuderen, tijdens organogenese.

Dual Labeling van neurale kuifcellen en bloedvaten in kippenembryo's met behulp van ChickGFP Neural Tube Enting en Carbocyanine Dye DiI Injection

Hier presenteren we een protocol om echografie microbellen contrastmiddelen in levende, geïsoleerde late zwangerschap stadium muizen embryo's te injecteren. Deze methode maakt de studie van perfusie parameters en vasculaire moleculaire merkers binnen het embryo met contrastmiddel hoogfrequente ultrasone beeldvorming.

Contrast Imaging in muis embryo&#39;s met behulp van hoge-frequentie Ultrasound

Leer gestandaardiseerde weefselanalyse voor congenitale hartafwijkingen in muizenembryo's met kwalitatieve en kwantitatieve methoden. Deze technieken verbeteren cardiologische diagnostiek.

Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Meer video's verkennen