Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Dit protocol standaardiseert nieuwe weefselanalysetechnieken, zodat ze op grotere schaal kunnen worden gebruikt door andere groepen die ook aangeboren hartafwijkingen bestuderen. Aangezien zowel kwalitatieve als kwantitatieve analysetechnieken hun voor- en nadelen hebben, gebruikt deze methode beide om het breedste scala aan experimentele vragen aan te pakken. Deze technieken kunnen een positieve invloed hebben op diagnostische methoden voor cardiologie.

Pathologen kunnen bijvoorbeeld onze microscopische hartweefselanalysetechnieken toepassen op de diagnose van menselijke hartziekten uit biopsiemonsters. Dit protocol kan worden gebruikt voor ontwikkelingscardioloog of algemeen cardiologieonderzoek. Echter, deze methoden bieden ook verschillende nuttige technieken die kunnen worden toegepast op elke weefselanalyse.

Om embryonale dag 15 tot 15,5 harten te verzamelen, de ledematen van een zwangere moeder vast te zetten en rond de plasbuis tot aan het borstbeen te beginnen, maak voorzichtig een I-vormige incisie langs de romp. Met behulp van tangen in een scheppende beweging, til voorzichtig de baarmoeder uit de buikholte grijpen de oppervlakkige weefsels van de baarmoeder als dat nodig is met fijne tangen om te helpen bij de extractie. Gebruik een schaar om de baarmoeder uit de buik te bevrijden.

Na het weken van de baarmoeder in ijskoude PBS, speld het orgaan in een dissectieschotel. Snijd met een schaar de baarmoeder in afzonderlijke secties die elk een apart embryo bevatten. Pel met behulp van twee paar fijne tangen de embryo's voorzichtig uit het baarmoederweefsel en plaats ze in een nieuwe petrischaal met vier graden Celsius PBS-EDTA.

Om de harten te verzamelen, plaats de schotel onder een ontledende microscoop en gebruik twee paar fijne tangen om het embryo in de supinepositie te plaatsen. Na het stabiliseren van de toegang tot de borst, gebruik het scherpe punt van een tweede paar fijne tangen om een incisie te maken langs het borstbeen van het embryo dat zich uitstrekt tussen de sleutelbeenderen naar de navel. Het maken van zeer fijne en oppervlakkige incisies terwijl geleidelijk werken naar de binnenkant van de borstholte, open de buik van het embryo.

Wanneer het hart net zichtbaar wordt, gebruik dan een paar tangen om de romp iets vertroeteld naar de ribbenkast te knijpen om de ribben open te pellen. Met behulp van de zijkanten van een paar tangen, voorzichtig pak de longbloedvaten zonder het scheiden van het weefsel en trek het hart uit de holte. Reinig het hart in verse PBS-EDTA gedurende een tot twee minuten voordat u het weefsel in 4% Paraformaldehyde gedurende 45 tot 60 minuten vastbindt.

Was vervolgens het hart drie keer gedurende 5 tot 10 minuten per wasbeurt in PBS aangevuld met glycine. Voor het opslaan van de harten in PBS op vier graden Celsius. Om het hart voor te bereiden op cryosectioning, plaats de monsters in een buis van 30% sacharose en PBS op vier graden Celsius gedurende 24 tot 40 uur.

Wanneer de harten zijn gezonken naar de bodem van de buis, gebruik dan een Pasteur Pipette met een aangepaste tip om zorgvuldig over te dragen elk hart tot een stuk pluisjes gratis doekje. Na een korte luchtdroging, plaats elk monster in individuele optimale snijtemperatuur mallen in de gewenste oriëntaties voor sectie. Dompel de weefsels onder in een optimaal snijtemperatuurmedium zonder bellen.

Bewaar vervolgens de mallen op 20 graden Celsius voor maximaal een paar dagen voor het bevriezen van de weefsels op 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur voordat cryosectioning. Om cryostat secties van de monsters te verkrijgen, gebruik maken van verse optimale temperatuur snijden medium om het weefsel blok van belang hechten aan de chuck van de cryostat en laat het medium te bevriezen totdat het ondoorzichtig wit. Plaats een nieuw mes en pas de afstand tussen het weefselblok en het mes aan om secties te kunnen verkrijgen.

Trim het blok in plakjes van 10 micrometer totdat het punt van belang is bereikt. Wanneer het weefsel kan worden waargenomen, gebruik dan een kleine platte kwast om het plakje voorzichtig tegen de standaard te trekken in een continue snijbeweging. Zodra het weefsel volledig is doorgesneden, gebruik maken van de detail borstel om de slice naar beneden plat tegen het podium dep.

Houd de sectie ongeveer 20 tot 30 seconden op zijn plaats voordat u het gedetailleerde penseel verwijdert en het segment afmaakt. Gebruik beide kwasten om het segment voorzichtig plat tegen het podium te voorkomen dat rollen en houd het weefsel gedeelte tegen het podium. Na 20 tot 30 seconden, draai de sectie en plat het tegen het podium opnieuw voor het plaatsen van een elektrostatisch geladen dia dicht genoeg voor het segment te worden aangetrokken en hechten aan de dia zonder de dia aan te raken aan het podium.

Om de hartweefselsecties te evalueren op de aanwezigheid van veelvoorkomende hartafwijkingen, met behulp van een microscoop uitgerust met een camera, verkrijgen van beelden bij 5 tot 10X en 40X vergrotingen. Voor cardiale spierverdichtingsanalyse, open een weefsel van belang in een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en stel het beeld in op 8-bits. Als u de drempelwaarde van de afbeelding wilt instellen, klikt u op Afbeelding, Aanpassen en Drempelwaarden en verplaatst u de bovenste balk om de drempelwaarde aan te passen totdat alleen de pixels voor de achtergrond zijn geselecteerd.

Gebruik vervolgens het gereedschap veelhoekselecties om een interessegebied rond het weefsel te tekenen en klik vervolgens op Analyseren, Metingen, Gebied en Limiet instellen op drempelwaarde. Klik op Analyseren en meten om het gebied van de gemarkeerde pixels te meten om de waarde van het gebied van de negatieve ruimte te verkrijgen. Als u het gebied van het hele interessegebied wilt meten, klikt u op Analyseren, Metingen instellen en schakelt u Limiet uit tot drempelwaarde.

Selecteer vervolgens Analyseren en meten om het hele gebied van het geselecteerde interessegebied te meten. Als u het gebied van spierweefsel wilt berekenen, trekt u het gebied van negatieve ruimte af van het gebied van de regio van belang. Dan verdelen het gebied van spierweefsel door het gebied van de regio van belang om de spier verdichting en X.The kleuring van weefsel plakjes van geoogste embryonale harten te berekenen, biedt genoeg contrast om uit te maken van de weefselranden, maar is niet zo donker om de cel functies niet te onderscheiden.

In deze representatieve analyse werd de spierverdichting waargenomen dat deze aanzienlijk was verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich onder niet-experimentele omstandigheden ontwikkelden. Deze monsters zijn waardevol en vereisen een lange tijd om te maken. Tijdens necropsies en de cryostat sectie specifiek, zorg ervoor dat opzettelijk over elke actie die u uitvoert.

Het behoud van de weefsels in Paraformaldehyde behoudt de antigeenactiviteit waardoor de monsters kunnen worden gebruikt voor tests zoals aminofluoresceïne-vlekken die helpen bij het identificeren van pathologische oorzaken die tijdens de morfologiebeoordeling zijn gevonden. In ons lab kregen we een kwantitatieve weergave van experimentele behandelingen die ons kunnen helpen om te bepalen in welke mate verschillende behandelingen onze monsters beïnvloeden. Paraformaldehyde kan elk weefsel dat het aanraakt repareren.

Zorg ervoor dat u altijd handschoenen draagt om de blootgestelde huid te minimaliseren en om in een filmkap te werken wanneer u met deze chemische stof werkt.