Name: Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Ontdek hoe u bloedvaten in muizenlever in drie dimensies kunt visualiseren met behulp van multiphotonenmicroscopie en Rhodamine B-isothiocyanaat-dextran. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor leveronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), het Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), het Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 2019030107).

Alle dierenverzorging en procedures waren in overeenstemming met het beleid van het China Nanfang Hospital voor heide en welzijn (aanvraagnr: NFYY-2019-73).
1. Voorbereiding van de muis
<ol><li>Verdoof de muis.<ol>
<li>Bereid natriumpentobarbital (50 mg/kg) voor in een spuit.</li>
		<li>Pak de muis (8 weken oude mannelijke C57BL/6) met de linkerhand zodat zijn buik naar boven is gericht en zijn hoofd lager is dan zijn staart. Desinfecteer de buikhuid met 75% alcohol.</li>
		<li>Houd de spuit in de rechterhand en doorboor de witte lijn van de buik met de naald iets naar de rechterkant van de huid met 3-5 mm. Zorg ervoor dat de spuitnaald en de huid zich in een hoek van 45° bevinden, injecteer het pentobarbital langzaam in de buikholte.  Na het scheren, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing.</li>
		<li>Controleer of de anesthesie succesvol was door het ontbreken van een juiste reflex.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteer Rhodamine B isothiocyanaat–dextran in de staartader.<ol>
<li>Bereid 100 μL rhodamine B isothiocyanaat-dextran van 10 mg/ml in een spuit.</li>
		<li>Veeg de staart van de muis af met 75% alcohol.</li>
		<li>Houd de staart met de linkerhand vast, houd de spuit in de rechterhand met de naald evenwijdig aan de ader en injecteer de kleurstof van 100 μL.</li>
		<li>Stop het bloeden met een wattenstaafje na de injectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Week de buikvacht van de muis met gaas bevochtigd met steriel water en scheer de buik van de muis met een scheermes, waarbij hij slagen maakt in de richting van de vacht. Na het scheren, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing.</li>
	<li>Na het afvegen van een verwarmingskussen met 75% alcohol, opent u het verwarmingskussen en plaatst u de muis op zijn rug in het verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.</li>
</ol>2. Het bevestigen van de muislever met het beeldvormingsframe van het lichaamsorgaan
OPMERKING: Het commerciële beeldvormingsframe voor orgels is nog niet vrijgegeven.
<ol><li>Plaats een schone zuignap in een vaste positie.</li>
	<li>Installeer een orgaanbeeldvormingsarmatuur(aanvullende figuur 1)en veeg het verwarmingskussen en de zuignap af met 75% alcohol.</li>
	<li>Sluit de zuignap (5 mm diameter) aan op de vacuümpompslang en schakel de vacuümpomp in.</li>
	<li>Op een steriele tafel gesteriliseerd met 75% alcohol, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing, desinfecteert vervolgens rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing, gebruikt vervolgens een chirurgische schaar om 2 cm huid van de onderste sternale rand van de muis af te snijden en de lever bloot te stellen.</li>
	<li>Plaats de muis samen met het verwarmingskussen op de houdervoet.</li>
	<li>Stel de orgelbeeldvormingsarmatuur zo in dat de zuignap de lever vasthoudt. Gebruik vervolgens een onderdruk van 30-35 kPa voor de zuigkracht, zodat de lever zich aan de zuignap hecht (Aanvullende figuur 2).</li>
</ol>3. Het aanpassen van de multiphoton laser scanning microscoop
<ol><li>Schakel de multifotonmicroscoop in en selecteer het objectief van 60x/1,00 W.</li>
	<li>Bevestig het frame en de muis onder de objectieve lens.</li>
	<li>Voeg een druppel normale zoutoplossing toe die de hele lens kan bedekken, die het midden van de zuignap is, en pas de objectieve lens aan om gewoon de normale zoutoplossing aan te raken.</li>
	<li>Dubbelklik op het computerpictogram om de lasersoftware in te schakelen en de schakelaar in te schakelen. Houd vervolgens de aan/uit-knop en de sluiter 3 s ingedrukt.</li>
	<li>Stel de golflengte in op 800 nm.</li>
	<li>Start de besturingssoftware van de microscoop met behulp van de computer.</li>
	<li>Stel laser 800 invoor de aanschafinstelling.</li>
</ol>4. Observatie met behulp van multiphoton laser scanning microscoop
<ol><li>Klik voor Besturingselement voor het verkrijgen vanafbeeldingen op de schakelaar Fluorescerend.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de verlichting van de ruimte en apparatuur is uitgeschakeld. Gebruik de microscoop in een verduisterde omgeving om het geluidsniveau te verminderen.</li>
	<li>Open de sluiter van het lichtpad op de microscoop.</li>
	<li>Draai het fluorescentiefilter naar de vierde versnelling en trek aan de twee hendels van de optische schakelaar.</li>
	<li>Als u door het oculair kijkt, gebruikt u de grove en fijne scherpstel quasispiralen om de brandpuntsafstand aan te passen en gebruikt u de X/Y-assen om het gezichtsveld aan te passen om het doelgebied te vinden.</li>
</ol>5. Multiphoton laser scanning micrografie
<ol><li>Schakel de fluorescerende schakelaar op de software uit, schakel het fluorescerende filter naar de tweede versnelling (tweede versnelling is RXD1) en druk op de twee hendels van de optische schakelaar.</li>
	<li>Klik op Focus ×2 om een voorbeeld van het doelgebied te bekijken en de parameters voor acquisitie en beeldverwerving aan te passen (beeldresolutie: 1024).</li>
	<li>Druk op Control + C en pas de hoogspanning, versterking en offset aan (om het geluidsniveau te verminderen).</li>
	<li>Klik op Stoppen om het voorbeeld te stoppen, klik op de XY-knop om in twee dimensies te scannen en sla op na voltooiing ( Figuur1).</li>
	<li>Selecteer een gebied, klik op Diepteen vervolgens op Voorbeeld om de eindset en startset te selecteren (zie het volledige vereiste deel van het bloedvat) in de microscoopinstelling. Scan 3D-afbeeldingen en sla op na voltooiing (Figuur 2).</li>
	<li>Selecteer een regio, klik op Tijden pas andere parameters voor acquisitie- en beeldverwervingsbeheer aan (stapgrootte: 1 μm; Plakjes: 10; Tijd scan nummer: 40). Scan verschillende segmenten en sla op na voltooiing om bewegende beelden te verkrijgen (Video 1). OPMERKING: Laat iemand de muizen verzorgen tijdens de scan en voeg dienovereenkomstig anesthesie toe.</li>
	<li>Offer de muis op door nekdissectie.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+vascular+imaging+techniques+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomed Research International. 2015, 783983(2015).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het observeren van een specifiek levend weefsel is een effectief middel om de veranderingen, lokalisatie en biologische effecten van het materiaal in het weefsel te begrijpen17. In dit experiment zijn de belangrijke stappen het fixeren van de lever met een orgaanbeeldvormingsarmatuur, dat het probleem van bewegingsartefacten als gevolg van ademhaling en hartslagen kan oplossen, en het gebruik van een multifotonmicroscoop voor observatie. Met behulp van deze methode worden de interne weefsels van d...

Bloedvaten kunnen voedingsstoffen leveren voor verschillende orgaanweefsels van het menselijk lichaam en stoffen uitwisselen. Tegelijkertijd functioneren veel cytokinen, hormonen, medicijnen en cellen ook via vasculair transport naar specifieke locaties. Het observeren van vasculaire veranderingen in leverweefsel kan helpen bij het begrijpen van de verdeling van de bloedstroom in leverweefsel en het transport van stoffen, en helpen bij de analyse van bepaalde vasculaire gerelateerde ziekten1,2.
Er zijn veel manieren om de bloedvaten van de lever bij muizen te observeren. Onder hen heeft optische microscopie veel beperkingen bij het observeren van ondoorzichtig vasculair weefsel3. Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om de bloedvaten van levende levers met niet-invasieve hoge resolutie 4 in beeld tebrengen. Niet alleen kunnen driedimensionale beelden van bloedvaten worden verkregen, maar de techniek kan ook worden gebruikt om het weefsel te helpen organiseren om biologische effecten daarin te observeren; bovendien kan het hele weefsel worden afgebeeld in plaats van alleen de microvessels zoals in computertomografie en magnetische resonantiebeeldvorming5.
Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om verspreide fluorescerende signalen in diep levend weefsel effectief te detecteren, met minder fototoxiciteit6. Daarom kan de activiteit van levend weefsel worden gegarandeerd en kan de hoeveelheid schade worden verminderd. Multifotonenmicroscopie heeft een beter doordringend vermogen dan confocale microscopie, waardoor diepere lagen kunnen worden waargenomen7,wat unieke 3D-beeldvorming biedt. Multifotonenmicroscopie wordt nu vaak gebruikt bij beeldvorming van hersenzenuwen8 en is uitgebreid tot de studie van neuronale dynamica bij levende muizen9,10,11.
In dit experiment, na fluorescerende etikettering van muisbloedvaten, wordt de lever in een frame gefixeerd en is de dynamiek van bloedvaten in levend leverweefsel te zien met behulp van multifotonenmicroscopie. Dit experiment demonstreert hoe specifieke stoffen te markeren, multifotonenmicroscopie te gebruiken om een locatie in het weefsel te observeren, cellulaire gebeurtenissen in het intercellulaire weefsel te observeren, fotochemische metingen te doen12,13,14en de materiaaldynamiek in het levende weefsel te observeren15. Tumor endotheelmarker 1 (TEM1) is bijvoorbeeld geïdentificeerd als een nieuwe oppervlaktemarker die op de bloedvaten en stroma in veel solide tumoren wordt gereguleerd, waardoor eenketenig variabel fragment (scFv) 78 tegen TEM1 wordt gemarkeerd, en vervolgens kan multifotonenmicroscopie worden gebruikt voor de locatie van muis hemangioom en evaluatie van tumoren16.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit x 2</td><td>Hunan Pinan Medical Devices Technology</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>5 W verwarmingskussentje</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% absoluut ethanol</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Absorbeerbare wattenbol</td><td>Healthy Sanitation Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis chirurgisch instrument</td><td>RWD Life Science</td><td>SP0001-G</td><td>Inclusief schaar en pincet</td></tr><tr><td>Multifotonmicroscopie</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Orgaanbeeldbewerkingsbevestiging</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td>Inclusief zuignap, slang, negatief drukpompen en beugel</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&ndash;Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Scheerapparaat</td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Natrium pentobarbital</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Het observeren van de intravasculaire dynamiek van leverweefsel van muizen stelt ons in staat om verdere diepgaande observaties en studies uit te voeren naar weefselgerelateerde ziekten van de muizenlever. Een muis wordt geïnjecteerd met een kleurstof die bloedvaten kan bevlekken. Om de muizenlever in vivo te observeren, wordt deze blootgesteld en in een frame bevestigd. Twee- en driedimensionale beelden van de bloedvaten in het leverweefsel worden verkregen met behulp van een multifotonenmicroscoop. Beelden van de weefsels op de geselecteerde locaties worden continu verkregen om veranderingen op lange termijn waar te nemen; de dynamische veranderingen van bloedvaten in de leverweefsels worden ook waargenomen. Multifotonenmicroscopie is een methode voor het observeren van cel- en celfunctie in diepe weefselsecties of organen. Multifotonenmicroscopie heeft gevoeligheid voor weefselmicrostructuur en maakt beeldvorming van biologische weefsels met een hoge ruimtelijke resolutie in vivo mogelijk, waardoor de biochemische informatie van de organisatie kan worden vastgelegd. Multifotonenmicroscopie wordt gebruikt om een deel van de lever te observeren, maar het fixeren van de lever om het beeld stabieler te maken is problematisch. In dit experiment wordt een speciale vacuümzuignap gebruikt om de lever te fixeren en een stabieler beeld van de lever onder de microscoop te verkrijgen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om dynamische veranderingen van specifieke stoffen in de lever waar te nemen door dergelijke stoffen met kleurstoffen te markeren.

De verdeling van bloedvaten in de lever is te zien in figuur 1, verkregen met behulp van multifotonenmicroscopie. Het bloedvat is verdeeld in een pluraliteit van takken die uit een stam komen en verdeeld naar de omringende ruimte. De buitenste omtrek van het bloedvat is rood, de binnenholte is donker en er zijn veel dingen binnenin. Hoe duidelijker het beeld, hoe dichter bij het observatievlak het is. Er zijn ook enkele rode vlekken in de buurt, waarschijnlijk omdat de kleurstof het omliggen...

In dit experiment wordt een muis in zijn staartader geïnjecteerd met Rhodamine B isothiocyanaat-dextran die bloedvaten kan bevlekken. Nadat de lever is blootgesteld en gefixeerd, kan een specifiek deel van de lever worden geselecteerd om het diepe weefsel in het levende lichaam te observeren met behulp van multifotonenmicroscopie.

Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Deze methode kan ons helpen om de bewegingen van bloedvaten in de muizenlever te visualiseren langs de evolutie van de dynamiek van de lever in meerdere dimensies. Met deze methode kunnen we de dynamiek van bloedvaten in de lever in drie dimensies visualiseren. We hebben het gebruik van vasculaire kleurstof aangetoond, maar u kunt de vaatkleuring met uw stof van belang uitvoeren vóór microscopische visualisatie.Na het bevestigen van een gebrek aan het rechttrekken van reflex in een verdoofde acht weken oude mannelijke C 57 zwarte zes muis. Veeg de staart van de muis af met 75% alcohol en gebruik een spuit met één microliter uitgerust met een naald van 30 gauge om 10 milligram per milliliter vers bereide Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran in 100 microliter Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran in de staartader te injecteren. Wanneer alle oplossing is geleverd, gebruikt u een wattenstaafje om druk uit te oefenen op de punctieplaats en gebruikt u gaas nat met steriel water om de buikvacht te weken.Gebruik een scheermes om de buik te scheren, slagen te maken in de richting van de vacht en plaats de muis op een 37 graden Celsius, met alcohol gedesinfecteerd verwarmingskussen. Om de muislever te fixeren met een beeldvormingsframe van het lichaamsorgaan, plaatst u eerst een schone zuignap met een diameter van vijf millimeter in een vaste positie en veegt u de verwarmingskussen en zuignap af met 75% alcohol. Sluit de zuignap aan op de vacuümpompslang en schakel de pomp in.Gebruik op een 75% alcohol gesteriliseerde tafel een chirurgische schaar om twee centimeter huid van de onderste sternale rand van de muis te knippen en de lever bloot te stellen. Plaats de muis en het verwarmingskussen op de houderbasis van het lichaamsframe en pas de orgelbeeldvormingsinrichting aan zodat de zuignap de lever kan vasthouden. Gebruik vervolgens een negatieve druk van 30 tot 35 kilopascal voor zuiging, zodat de lever zich aan de beker hecht.Als u de multifotolenscanmicroscoop wilt instellen, schakelt u de microscoop in en selecteert u het 60 X-objectief. Bevestig het frame en de muis onder het doel en voeg een druppel normale zoutoplossing toe aan de beker die groot genoeg is om de lens te bedekken. Pas het objectief zo aan dat de lens gewoon de normale zoutoplossing raakt en schakel de lasersoftware in.Schakel de laser in en houd de aan/uit-knop en de sluiter drie seconden ingedrukt. Start vervolgens de microscoopbesturingssoftware en stel de laser in op 800 nanometer. Als u de besturingselement voor het verkrijgen van afbeeldingen wilt instellen, klikt u op de fluorescerende schakelaar en schakelt u de ruimte- en apparatuurlampjes uit.Open de lichtpadsluiter op de microscoop en draai het fluorescentiefilter naar het vierde tandwiel. Trek aan de twee hendels van de optische schakelaar en kijk door het oogstuk, gebruik de koers en fijne scherpstellen quasi spiralen om de brandpuntsafstand aan te passen. Gebruik vervolgens de X Y-assen om het gezichtsveld aan te passen om het doelgebied te lokaliseren.Voor beeldvorming schakelt u de fluorescerende schakelaar in de software uit en schakelt u het fluorescerende filter naar de tweede versnelling. Druk op de twee hendels van de optische schakelaar en klik op scherpsteltijden twee om een voorbeeld van het doelgebied te bekijken, pas de acquisitie-instellingen en de parameters voor beeldverwervingsbesturing aan en druk op control plus C om de hoogspanningswinst en -offset aan te passen. Klik op stoppen om het voorbeeld te stoppen, klik op de X Y-knop om in twee dimensies te scannen en klik op opslaan.Selecteer een gebied en klik op diepte en voorbeeld om de eind- en startsets in de microscoopinstellingen te selecteren. Scan 3D-afbeeldingen en sla op. Selecteer na het scannen een regiokliktijd en pas de andere acquisitie-instellingen en gecontroleerde parameters voor beeldverwerving aan.Scan vervolgens door de verschillende segmenten en sla op om de resulterende afbeeldingsfilm te verkrijgen. Hier kan visualisatie van de verdeling van bloedvaten in de lever met behulp van multi-foton microscopie zoals aangetoond, worden waargenomen. Dit bloedvat is verdeeld in een pluraliteit van takken die uit een stam komen en verdeeld in de omringende ruimte.De buitenste omtrek van het bloedvat kan rood worden waargenomen terwijl de binnenholte donker is, zoals waargenomen in de video kunnen niet-rode objecten die zich in de bloedvaten bewegen cellen zijn. De duisternis van het weefsel dat in deze video wordt waargenomen, is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de lever niet goed in de loop van de tijd is gefixeerd. Het is belangrijk om te onthouden dat hoe littekenloze lever is gefixeerd, de stabiliteit van het beeld beïnvloedt.Deze methodologie kan ook worden toegepast op de positie van andere structuren in de lever voor de directe observatie van de verdeling of veranderingen in specifieke arbeidsstructuren van belang.

multiphoton-microscopic-observation-of-vessels-in-mouse-liver-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een optisch systeem ontwikkeld lever microcirculatie visualiseren met FITC-gelabelde erythrocyten en de partiële zuurstofdruk in de microvaatjes meten laser-assisted phosphorimetry. Deze methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen onderzoeken te analyseren microvasculaire structuur diameter snelheid van de bloedstroom en zuurstofspanning.

Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

This video describes an imaging procedure to observe and study intravascular dynamics of a mouse liver tissue using multiphoton microscopy following stabilization of the organ. Multiphoton microscopy enables the imaging of biological tissue at high spatial resolution in vivo.

Imaging Fixture Supported Mouse Liver Staging for Multiphoton Microscopy Based Vascular Visualization: A Stabilization Device-assisted Imaging Technique to Obtain Multi-dimensional Images of Blood Vessels in Mouse Liver

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.

Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Hier beschrijven we een eenvoudig en economisch protocol om onbevooroordeelde kwantificering van de pulmonale microvasculaire dichtheid voor longweefsel van hele muizen uit te voeren met behulp van enkelvoudige kleuring van isolectine B4.

Kwantificering van pulmonale microvasculaire dichtheid bij muizen over lobben

Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) met een hoge ruimtelijke resolutie (100 μm) en gevoeligheid is een geschikte niet-invasieve beeldvormingsmodaliteit voor het verkrijgen van een uitgebreid kwalitatief overzicht van de levervasculatuur. UFUS faciliteert ook kwantitatieve metingen van de microvasculatuur, met als doel ons begrip van vaatziektemechanismen te vergroten.

Beeldvorming en kwantificering van het levervaatstelsel van muizen met behulp van ultrasnelle Doppler-echografie

Ontdek hoe u bloedvaten in muizenlever in drie dimensies kunt visualiseren met behulp van multiphotonenmicroscopie en Rhodamine B-isothiocyanaat-dextran. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor leveronderzoek.

Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen

Meer video's verkennen