Name: Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Leer live cell imaging van het microtubule cytoskelet in het Arabidopsis shoot apicaal meristeem met micromechanische manipulatie. Deze methode biedt kwantitatieve inzichten in mechanische responsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Plantengroei
<ol><li>Zaai Arabidopsis zaden uitdrukken microtubbule binding domein versmolten met groene fluorescerende eiwitten (MBD-GFP)10 op de bodem en houden in lange dag (16 uur dag / 8 uur nacht), 20 °C / 6 ° C voorwaarden voor 1 week voor ontkieming.</li>
	<li>Breng na het ontkiemen zaailingen over naar nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken. Houd planten op korte dag (8 uur per dag /16 uur 's nachts), 20 °C/16 °C voorwaarden gedurende 3-5 weken.</li>
	<li>Breng planten over op lange dag (16 uur dag /8 uur nacht), 20 °C/16 °C voorwaarden en bewaar tot planten bout (2-3 weken). Laat de bloeiwijze tot 2-5 cm lang worden.</li>
</ol>2. Gemiddelde voorbereiding
<ol><li>Bereid de ontleedschotels door kleine petrischaaltjes (ongeveer 5,5 cm breed, 1,5 cm diep) te vullen tot ongeveer de helft van hun diepte met 2% agarose. De ontledende gerechten kunnen ook worden gebruikt voor single time point imaging.</li>
	<li>Bereid het groeimedium voor.<ol>
<li>Bereid 50 mL van een 1.000x vitaminevoorraadoplossing met 5 g myo-inositol, 0,05 g nicotinezuur, 0,05 g pyridoxinehydrochloride, 0,5 g thiaminehydrochloride en 0,1 g g glycine.</li>
		<li>Bereid het groeimedium, samengesteld uit 1/2 Murashige en Skoog medium, 1% sacharose, 1,6% agar, 1x vitamines, pH = 5,8. Autoclave en laat het afkoelen.</li>
		<li>Steriliseer op een steriele, schone bank scharnierende plastic dozen (ongeveer 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) door 15 minuten lang 70% ethanol onder te dompelen.</li>
		<li>Op een steriele, schone bank, zodra het medium is op draaglijke warmte, voeg N6-benzyladenine aan een uiteindelijke concentratie van 200 nM, en 1/1.000 PPM (plant conserveermiddel mengsel) en meng goed. Vul de steriele dozen tot ongeveer de helft van hun diepte met het medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissectie van de SAM
<ol><li>Snijd de bloeiwijze en verwijder de oudere bloemknoppen met scherpe tangen door de bloemen aan de basis van de peduncles te pellen totdat het moeilijk is om ze met het blote oog te zien.</li>
	<li>Maak een spleet in de agarose in de ontleden schotel met tangen en plant de bloeiwijze basis in de dikke agar. Dit geeft goede solide ondersteuning voor verdere fijne dissectie van jongere bloemen om de SAM bloot te leggen.</li>
	<li>Verwijder de resterende bloemknoppen door ze naar beneden te duwen met de tangen te beginnen met de oudste en sequentiële vordert naar de jongere stadia onder een ontleden microscoop totdat de SAM zichtbaar is. De SAM wordt meestal blootgesteld wanneer oudere bloemen tot fase 6 tot 7 worden verwijderd. Zodra de SAM is blootgesteld, vermijd uitdroging van het monster door snel naar de volgende stap te gaan.</li>
</ol>4. Overdracht en groei van gekweekte SAM's
<ol><li>Plant het vers ontleed monster zoals beschreven in sectie 1 in het groeimedium in de rechthoekige plastic scharnierende kweekdoos met de SAM net boven het middenoppervlak. Voeg een paar druppels steriel gedeïsiliseerd water toe aan de randen van de kweekdozen en sluit het deksel om de vochtigheid in de doos te behouden. Zorg ervoor dat het toegevoegde water de SAM niet bedekt.</li>
	<li>Sluit het deksel en wikkel de doos met micropore tape. Plaats de groeibox in lange dag- of continue dagomstandigheden op 22 °C en groei 12-24 uur om de SAM in staat te stellen zich van de ontledingsprocedure te herstellen en zich aan te passen aan de kweekomstandigheden.</li>
</ol>5. Beeldvorming van de SAM
<ol><li>Vul de kweekdoos met de SAM met steriel gedeïmiseerd water om het monster te bedekken. Controleer onder de ontleedmicroscoop en verwijder eventuele luchtbellen door met een pipet van 1 mL krachtig water op het monster te spuiten.</li>
	<li>Plaats de kweekdoos op een rechtopstaand confocale microscoopstadium. Zorg ervoor dat de kweekdoos geen contact maakt met de microscoopdoelstellingen. Gebruik een lange afstand 40x of 60x water dompelen lens van numerieke diafragma 0.8-1 die optimaal is voor beeldvorming zonder een cover glas.</li>
	<li>Verlaag het doel in het water en controleer op luchtbellen gevormd op de voorste lens van het doel. Verwijder eventuele bubbels door het verlagen van het podium en voorzichtig afvegen van de lens met een optisch weefsel en het toevoegen van een kleine hoeveelheid water aan de voorste lens van het doel met een Pasteur pipet voor reimmersion in het water.</li>
	<li>Stel met behulp van het GFP-filter en de epi-verlichtingsmodule van de confocale microscoop de XY-controller aan om het monster te lokaliseren. Het aanpassen van de positie van de oculair, zet de SAM direct onder de lichtbron en focus langs de Z-as totdat de top zich bevindt. LET OP: Kijk niet direct naar het ultraviolette licht.</li>
	<li>Zodra het monster is gevonden, verlichten met behulp van een laser geschikt voor spannende GFP (dat wil zeggen, een 488 nm of 496 nm laserbron). Pas de optische zoom van de microscoop zo aan dat de gehele SAM en de stage 1 floral primordia in het gezichtsveld zijn. Pas de kracht van de laseroutput verder aan en verkrijg de instellingen om een optimale signaal-ruisverhouding te garanderen. OPMERKING: De hoge intensiteit van de laser zal resulteren in fotobleken van het monster. Het onder- en overbelichtingspalet zorgt voor een betere aanpassing van deze instellingen.</li>
	<li>Laat het monster 2-5 min tot rust komen. Verkrijg confocale Z-stapels van het monster met een segmentintervallen van 0,25 μm-0,5 μm Z met een resolutie van ongeveer 0,3 μm pixelgrootte. Zorg ervoor dat de totale beeldtijd die nodig is voor het verwerven van Z-stapels voor één monster niet meer dan 10 minuten bedraagt vanaf het moment dat het monster tot de voltooiing van de overname in water wordt ondergedompeld.</li>
	<li>Verwijder onmiddellijk het water en breng de kweekdoos terug naar de groeikamer. Het houden van de monsters voor een lange tijd onder water zal invloed hebben op de osmotische status van de cellen.</li>
</ol>6. Micromechanische verstoring van de SAM
<ol><li>Stel de beeldvorming voorwaarden zoals beschreven in sectie 5 en verwerven preablatie beeld stapels van de corticale microtubule organisatie.</li>
	<li>Decanteer het water in de kweekschotel. Voer de ablatie uit met een schone spuitnaald (0,4 mm x 20 mm).<ol>
<li>Houd met behulp van een ontledenmicroscoop de naald voorzichtig vast en benader de SAM langzaam. OPMERKING: Adem vasthouden en het hanteren van de naald met een ontspannen grip helpt te voorkomen dat schudden.</li>
		<li>Neem kort contact op met de SAM-koepel met de naaldpunt om te bevestigen dat de ablatie is gedaan. Voer bij voorkeur de ablatie uit aan de periferie van de SAM, die visualisatie van het gedrag en de overgang van ongeorganiseerde corticale microtubuli in het centrale gebied van de koepel mogelijk maakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul de kweekschaal bij met steriel gedeïmiseerd water en voeg propidium idodide (10 μg/mL) toe. Naast het monitoren van het Corticale microtubbulesignaal van de GFP, kan het visualiseren van de propidiumjodide met behulp van een apart kanaal gebieden van ablated cellen duidelijk markeren. Propidium jodide wordt verlicht met behulp van de 561 nm of een andere geschikte laser met emissie geregistreerd tussen 600-650 nm.</li>
	<li>Verwerf beeldstapels direct na ablatie (zie sectie 6) en herhaal het acquisitieproces om de 2 uur voor een periode van 6 uur. Breng de kweekschotel samen met het monster na elk keer weer terug in de incubatiekamer. Zorg ervoor dat er nog wat water over is op de kweekmedia en wikkel het kweekschotel met microporetape om uitdroging te voorkomen.</li>
</ol>7. Datavisualisatie en kwantificering
<ol><li>Genereer oppervlakteprojecties met behulp van vrij beschikbare software zoals MORPHOGRAPHX11, FIJI12of macro SurfCut13.</li>
	<li>Voer extractie van corticale microtubuli anisotropie uit met FibrilTool14 macro in FIJI. OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor softwaregebruik kunnen worden verkregen uit de respectievelijke citaties.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beoordeling van mechanische signaaltransductiegebeurtenissen is cruciaal om moleculaire regelgevers te identificeren die betrokken zijn bij de mechano-waarnemings- en transductietrajecten. Het hier beschreven protocol geeft een kwantitatief beeld van dergelijke gebeurtenissen door de corticale microtubulirespons te gebruiken als uitlezing voor een dergelijk proces in Arabidopsis SAMs. De hier beschreven procedure wordt routinematig gebruikt in verschillende studies in verschillende weefseltypen<sup class="xre...

Plantencellen worden omgeven door een extracellulaire matrix van polysacchariden en glycoproteïnen die mechanisch lijkt op een vezelversterkt composietmateriaal dat zijn mechanische eigenschappen dynamisch kan veranderen1. De groei van plantencellen wordt gedreven door de opname van water in de cel, wat resulteert in een gelijktijdige opbouw van trekkrachten op de celwand. In reactie op dergelijke krachten, wijzigingen in de fysieke toestand van de celwand zorgt voor celuitzetting. Cellen met primaire wanden zijn in staat om een snelle groei te ondergaan in vergelijking met secundaire celwand met cellen voornamelijk als gevolg van verschillen in de chemische samenstelling van de polysaccharides binnen. Primaire wandcellen zijn samengesteld uit cellulose, hemicellulose en pectine in aanvulling op glycoproteïnen, en gebrek aan lignine, een component die aanwezig is in de secundaire celwand2. Cellulose, een glucosepolymeer dat via β-1,4-bindingen is gekoppeld, is de belangrijkste component van de celwanden. Het is georganiseerd in fibrillar structuren die bestand zijn tegen hoge trekkrachten ervaren tijdens celgroei3. Naast het weerstaan van trekkrachten, mechanische versterking langs een preferentiële richting resulteert in turgor-gedreven expansie langs een as loodrecht op de netto oriëntatie van de cellulose microfibril. De organisatie van de cellulose microfibrils wordt beïnvloed door het corticale microtubulicytoskelet, omdat ze de richtingsbeweging van de cellulosesynthese-synthetiserende complexen op het plasmamembraan4begeleiden. Daarom dient het monitoren van corticale microtubuli organisatie met behulp van een microtubuli-geassocieerd eiwit of tubuline versmolten met een fluorescerend molecuul als een proxy voor de observatie van bovenmatige patronen van cellulose in plantencellen.
De patronen van de corticale microtubulicytoskelet is onder de controle van cel- en weefselmorfologie afgeleide mechanische krachten. Corticale microtubuli organisatie heeft geen preferentiële organisatie na verloop van tijd in cellen gelegen aan de top van de SAM, terwijl cellen in de periferie en de grens tussen de SAM en het opkomende orgaan hebben een stabiele, zeer georganiseerde supracellulaire array van corticale microtubuli5. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de mechanische status van de cellen fysiek te verstoren. Veranderingen in de osmotische status, evenals de behandeling met farmacologische en enzymatische verbindingen die de stijfheid van de celwand beïnvloeden, kunnen leiden tot latere veranderingen in de trekkrachten die door de cel6,7 wordenervaren . Het gebruik van constructies die het mogelijk maken voor de geleidelijke toename van de compressieve krachten ervaren door weefsels is een ander alternatief8. Toepassing van centrifugale krachten is ook aangetoond dat de mechanische krachten beïnvloeden zonder enig fysiek contact met de cellen9. Echter, de meest gebruikte middelen van het veranderen van directionele krachten in een groep cellen profiteren van het feit dat alle epidermale cellen onder spanning staan en fysieke ablatie van cellen zal elimineren turgor druk lokaal evenals verstoren cel-tot-cel hechting, waardoor het wijzigen van de trekkrachten ervaren door de naburige cellen. Dit wordt uitgevoerd door het richten van een high-powered gepulseerde ultraviolette laser of door middel van een fijne naald.
Hier gaan we dieper in op het proces van beeldvorming en het beoordelen van corticale microtubuli gedrag voor mechanische verstoring bij de SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>micropore tape</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benzyladenine</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>nicotinic acid</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>plastic hinged box</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td><td>Plant Cell Technology</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>pyridoxine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>thiamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging van microtubule cytoskeleton en micromechanische manipulatie van de arabidopsis shoot apical meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Inzicht in cel- en weefselniveauregulatie van groei en morfogenese loopt al tientallen jaren voorop in biologisch onderzoek. Dankzij de vooruitgang in moleculaire en beeldvormende technologieën konden we inzicht krijgen in hoe biochemische signalen morfogenetische gebeurtenissen beïnvloeden. Het wordt echter steeds duidelijker dat naast biochemische signalen, mechanische signalen ook invloed hebben op verschillende aspecten van cel- en weefselgroei. Arabidopsis ontspruit apical meristem (SAM) is een koepel-vormige structuur verantwoordelijk voor de generatie van alle bovengrondse organen. De organisatie van het corticale microtubulicytoskelet dat apoplastische cellulosedepositie bemiddelt in plantencellen is ruimtelijk verschillend. Visualisatie en kwantitatieve beoordeling van patronen van corticale microtubuli zijn noodzakelijk voor het begrijpen van de biofysische aard van cellen in de SAM, omdat cellulose de stijfste component van de plantencelwand is. De stereotiepe vorm van corticale microtubuli organisatie is ook een gevolg van weefsel-brede fysieke krachten bestaande in de SAM. Verstoring van deze fysieke krachten en de daaropvolgende monitoring van corticale microtubuli organisatie maakt het mogelijk voor de identificatie van kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij het bemiddelen van mechano-perceptie en transductie. Hier beschrijven we een protocol dat helpt bij het onderzoeken van dergelijke processen.

Figuur 1 toont typische projectiebeelden verkregen uit MBD-GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel met ongeorganiseerde corticale microtubuli, en cellen aan de periferie met een omtrekverdeling(figuur 1A,B), terwijl de grensdomeincellen corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd. Deze waarnemingen tonen verschillen in de ruimtelijke verdeling van corticale mic...

Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Dit protocol helpt ons te begrijpen hoe Microtubule Cytoskeleton gedrag optreedt in planten. Tegelijkertijd helpt het ons ook te begrijpen hoe deze structurele componenten die de cel- en orgaanvorm beïnvloeden, reageren op veranderingen in mechanische krachten. Hoewel deze methode weinig verfijning vereist, biedt het robuuste, kwantitatieve read-after, de mechanische responsverschillen tussen verschillende genotypes en omstandigheden.Begin met het kweken van arabidopsis zaden uitdrukken microtubuli bindende domeinen versmolten met groene fluorescerende eiwitten in de bodem, op 20 en 6 graden Celsius onder lange dag omstandigheden voor een week. Breng na het ontkiemen de zaailingen over in nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken en plaats de planten op 20 en 16 graden Celsius onder korte dagomstandigheden. Na drie tot vijf weken, breng de planten terug naar lange dag omstandigheden op dezelfde temperatuur tot de planten bout, waardoor de bloeiwijze te groeien tot twee tot vijf centimeter lang.Voor Shoot Apical Meristem dissectie, putt de bloeiwijze, en gebruik scherpe tangen om de bloemen te schillen aan de basis van de peduncles, totdat het moeilijk is om de peduncles te zien met het blote oog om de oudere bloemknoppen te verwijderen. Gebruik de tangen om een spleet in de agros te creëren in een ontleden schotel, en plant de bloeiwijze basis in de dikke Augur. Plaats de schotel onder een ontledenmicroscoop.Te beginnen met de oudste bloemknop, duw met de tang om de bloemknop te verwijderen uit de plant. De shoot apicale meristem wordt meestal blootgesteld wanneer oudere bloemen tot fase zes tot zeven worden verwijderd. En gebruik de tangen om elke bloemknop naar beneden te duwen totdat de shoot apicale meristem zichtbaar is.Zodra de shoot apicale meristem is blootgesteld, laat de vers ontleed monster in groeimedium in een ethanol-gesteriliseerde rechthoekige plastic scharnierende cultuur doos met de shoot apicale meristem net blootgesteld boven het medium oppervlak. Voeg een paar druppels steriel gedeïsiliseerd water toe aan de randen van de kweekdoos en sluit het deksel om de vochtigheid in de doos te behouden. Wikkel de doos met micropore tape en plaats de groeibox onder lange of continue dagomstandigheden op 22 graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur.Wanneer de plant is hersteld van de ontledingsprocedure, bedek het monster met steriel gedeïoniseerd water en controleer op luchtbellen onder de ontledenmicroscoop. Breng de kweekdoos over naar een rechtopstaande confocale microscoopfase en selecteer de 40 of 60X waterdip lens. Laat het doel in het water zakken en controleer op luchtbellen op de voorste lens van het object.Om bellen te verwijderen, lager het podium en veeg de lens voorzichtig met een optisch weefsel. Gebruik vervolgens een Pasteur pipet om een klein volume water toe te voegen aan de voorste lens van het doel voordat u de lens opnieuw onderdompelt in het water. Gebruik vervolgens het GFP-filter en de epi-verlichtingsmodule van de confocale microscoop om de XY-controller aan te passen om het monster te lokaliseren.Het aanpassen van de positie van de oculair, plaats de shoot apicale meristem direct onder de lichtbron, en focus langs de Z-as totdat de top zich bevindt. Gebruik een laser in staat van spannende GFP om het monster te verlichten, en de optische zoom van de microscoop aan te passen, zodat de hele shoot apicale meristem en het podium een florale primordia zijn in het gezichtsveld. Pas vervolgens de kracht van de laseroutput en de gain-instellingen aan om een optimale signaal-ruisverhouding te verkrijgen.Nadat het monster twee tot vijf minuten heeft kunnen worden gedrenk, verwerft u confocale Z-stapels van het monster met 0,25 tot 0,5 micrometer Z-segmentintervallen, wat een pixelgrootteresolutie van ongeveer 0,3 micro meter toevoegt. Verwijder aan het einde van de overname onmiddellijk het water en breng de kweekbox terug naar de groeikamer. Voor Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, verwerven pre-ablatie beeld stapels van de corticale microtubule organisatie zoals net aangetoond, en decaf het water uit de cultuur doos in een cultuur schotel.Breng de shoot apicale meristem onder een ontledenmicroscoop, en langzaam benaderde de shoot apicale meristem met een schone 0,4 bij 20 millimeter spuitnaald. Neem kort contact op met de periferie van de koepel van de schietapicale meristem met de naaldpunt om te bevestigen dat de ablatie is voltooid. En vul de kweekschotel bij met steriel gedeïsized water.Voeg vervolgens 10 microgram per milliliter propidium jodide toe aan de schotel en verwerf onmiddellijk beeldstapels zoals aangetoond om de twee uur gedurende zes uur, het terugbrengen van de kweekschotel naar de incubatie tussen elk keerpunt. Voor gegevensanalyse genereert u oppervlakteprojecties van de beeldstapels met behulp van een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en voert u extractie uit van de corticale microtubbule-anisotropie met behulp van de Fibril Tool Macro in Fiji. Hier kunnen typische projectiebeelden worden verkregen uit microtubbule bindingsdomein GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel die ongeorganiseerde corticale microtubuli bevatten, cellen aan de periferie, met een omtrekverdeling en grensdomeincellen die corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd.Time-lapse imaging, toont corticale microtubuli uitlijning veranderen van een zeer wanordelijke array naar een meer georganiseerde array binnen zes uur na ablatie. Tensors kunnen worden bovenop de corticale microtubuli beelden, en de geëxtraheerde informatie kan worden vertegenwoordigd door het plotten van de gemiddelde anisotropie na verloop van tijd. Bij het aanpassen van laservermogen en gain-instellingen moeten we ervoor zorgen dat de filamenten duidelijk worden geobserveerd en proberen overbelichting te voorkomen, omdat over verzadigde signalen de trekrichting in latere analyse kunnen beïnvloeden.Atoomkracht microscopie kan ook worden uitgevoerd om te beoordelen hoe de veranderingen in de mechanische krachten daadwerkelijk van invloed op de fysieke status van de celwand.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Dit artikel laat zien hoe cultuur Arabidopsis thaliana zaailingen in een twee-laag microfluidic platform dat de belangrijkste wortel en root haren op een interne optische vlak beperkt. Dit platform kan worden gebruikt voor real-time optische beeldvorming van fijne wortel morfologie alsook wat betreft hoge resolutie beeldvorming door andere middelen.

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Dit protocol presenteert hoe te leven van beeld en analyseren van de shoot apicale meristems van verschillende plantensoorten met behulp van laser scanning confocal microscopie.

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer live cell imaging van het microtubule cytoskelet in het Arabidopsis shoot apicaal meristeem met micromechanische manipulatie. Deze methode biedt kwantitatieve inzichten in mechanische responsen.

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Meer video's verkennen