Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

Dit protocol biedt een methode voor het isoleren van staafvormige cardiomyocyten van elk hartweefsel, die vervolgens kan worden gebruikt om de pleidie- en nucleatiestatus van deze cardiomyocyten te meten zonder handmatige analyse. In vergelijking met andere technieken biedt ons protocol consistentere celopbrengsten en celmorfologie, en in tegenstelling tot flow cytometrie, zijn we in staat om de nucleatie en ploidy status van cardiomyocyten visueel te verifiëren. De visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de verdeling van het hartweefsel en de associatie gemakkelijker te waarderen is.

Begin met het plaatsen van de geëuthanaseerde muis in een supine positie, en taping vaststelling van de verlengde ledematen. Gebruik stomphoofdige schaar te snijden door de borst om het hart bloot te stellen. Snijd vervolgens de dalende aorta en de helse vena cava.

Gebruik een peristaltische pomp bevestigd aan een infuus set met een 23-gauge vlindernaald om het hart te doornemen door het injecteren van drie milliliter kaliumchloride PBS oplossing door de linker ventrikel. Zorg ervoor dat u niet door het septum doorboort. Injecteer vervolgens 10 milliliter van 4%PFA-oplossing gedurende 10 minuten met een snelheid van één milliliter per minuut.

Gebruik een schaar om het hele hart te verwijderen. En indien gewenst, isoleer een specifieke regio. Plaats het weefsel in een 1,5 milliliter centrifugebuis met een milliliter van 4%PFA-oplossing.

Broed het een uur lang uit op een rocker. Plaats het hart in een petrischaaltje met PBS-oplossing. Knijp het om zich te ontdoen van een PFA resterende in de ventrikels en was het in PBS.

Zet het vaste hart in een nieuwe 1,5 milliliter buis met collagenate oplossing. Dan broeden het hart op een rocker op 37 graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, zet het hart in een 35 millimeter petrischaal met collagenate oplossing, en dissociate het in een millimeter stukken met tang of schaar.

Gebruik vervolgens een transferpipet om het gescheiden weefsel gedurende twee minuten verder te tritureren. Als er nog weefseldeeltjes overblijven, gebruik dan een pipet met een smallere punt en blijf trituratie totdat het grootste deel van het weefsel is afgebroken. Plaats een nylon gaas van 200 tot 600 micrometer over een 15 millimeter centrifugebuis.

Voeg vijf milliliter PBS toe aan de gescheiden cellen en filtreer ze door het nylon gaas. Was het nylon gaas door het passeren van een extra vier milliliter PBS. Centrifuge de gefilterde oplossing vervolgens gedurende een minuut op 10 tot 100 keer G.

Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 10 milliliter PBS voorafgaand aan het bevlekken. Na het downloaden van de Fiji-distributie van afbeelding J, open Fiji en klik op help, bijwerken en beheren update sites. Controleer de biomed groep en IFPB plugins.

Klik vervolgens op sluiten en pas wijzigingen toe om de afhankelijkheden plugins, ellips split en morpho lib J.Te downloaden. Download vervolgens RStudio en open deze. Kopieer de code uit het tekstmanuscript naar de opdrachtregel van RConsole en druk op enter.

typ vervolgens Y in reactie op alle aanwijzingen om al onze afhankelijkheden te installeren. Als u beeldkwantificering wilt uitvoeren, opent u Fiji en sleept u denucleatie. py in de statusbalk.

Wanneer het venster voor het bewerken van scripts wordt geopend, klikt u in de linkerbenedenhoek. Er verschijnt een dialoogvenster waarin wordt gevraagd naar de locatie van de uitvoergegevensmap. Selecteer de map waarin alle analysegegevens, cijfers en andere gegevens die door de software worden gebruikt, worden opgeslagen.

Selecteer in de analyseparameters de locatie van de te analyseren afbeeldingen en voer de naamindeling afbeeldingsbestands met behulp van reguliere expressies in. Klik na het selecteren van de gewenste instellingen op OK. Als afbeeldingen uit verschillende stadia van de analysepijplijn op het scherm worden weergegeven, controleert u deze om ervoor te zorgen dat de drempelwaardering en segmentatie correct plaatsvinden. Open analyzemultinucleatedserver.

r in Rstudio. Typ vervolgens naar de naam van de variabele map het bestandspad naar de uitvoergegevensmap die in de laatste stap is geselecteerd zonder de laatste slash. Klik op App uitvoeren in de linkerbovenhoek van het scriptbewerkingsvenster.

Gebruik de schuifregelaars om drempels in te stellen voor de minimale geldige kernintensiteitsdrempel, de minimale geldige kernareaaldrempel en de maximaal geldige minimumfrettendiameter voor cardiomyocyten. Schuif omlaag en klik op geselecteerde drempelwaarden toepassen en klik vervolgens op de verdeling van de plotintensiteit, waardoor een plot van de kernintensiteitsverdeling van het gehele monster wordt weergegeven, evenals afzonderlijke subplots voor elke groeperingsvariabele. Als u rekening wilt houden met intrasample variatie, scroll naar beneden en controleer afzonderlijk normaliseren per groep klik dan op berekenen ploidy en plot geschatte ploidy distributie.

Zodra de genormaliseerde hele voorbeeldgrafiek verschijnt, moeten de twee piekpatronen zichtbaar zijn. Gebruik de schuifregelaars en selecteer drempels om de diploïde en tetraploïde pieken van elkaar en uitschieters te isoleren. Scroll dan naar beneden en klik op berekenen ploidy en nucleation.

Klik tot slot op de knopplot en sla op in de map resultaten. Deze methode kan worden gebruikt om uniform ge singulariseerde cardiomyocyten te isoleren die relatief zuiver zijn zonder cellen te besmetten. Het is eenvoudig te implementeren en biedt consistente cardiomyocyte opbrengsten en kwaliteit uit verschillende isolaties.

Cardiomyocyten geïsoleerd met dit protocol kan worden gekleurd met behulp van antilichamen en fluorochrome geconjugeerde azides. Om het karakteristieke Z-lijn kleuringspatroon van sarcomeres weer te geven, werden de cellen bevlekt met antilichamen die alfa-actinine herkenden. In een apart experiment werd EdU toegediend aan muizen voordat het vaste cardiomyocyten werd geïsoleerd.

Na isolatie werden de mononucleated, binucleated en trinucleated cardiomyocyten ontdekt die S-fase hadden ondergaan. Om individuele kernen te identificeren, werd het oorspronkelijke DNA-gekleurde beeld op basis van intensiteit met drempels geplaatst. Ellipsen waren geschikt voor de nucleaire maskers, segmenteren individuele kernen.

Vervolgens werden de pixels van het beeld verdeeld in gebieden op basis van de ellips waarop ze het meest proximaal zijn, en de grenzen van deze gebieden werden gebruikt om lijnen te trekken door kernclusters. Een soortgelijk segmentatieproces werd gebruikt om cardiomyocyten op te sporen. Deze segmentatiestrategie toonde aan dat de meerderheid van de cardiomyocyten van pasgeboren muizen mononucleated zijn.

De frequentie van mononucleated cardiomyocyten is veel lager in twee weken oude muizen, waar ze ongeveer 25% van de totale cardiomyocytenpopulatie uitmaken. Toen de ploidy status van individuele kernen binnen cardiomyocyten werd gemeten, werd een hogere frequentie van tetraploïde kernen gedetecteerd bij jonge muizen. Bij het isoleren van cardiomyocyten is het belangrijk om te controleren of alle celklontjes hun trituratie hebben afgebroken.