Veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem

De praktijk van het gebruik van plantaardige producten om de gezondheid te verbeteren dateert van duizenden jaren. De laatste tijd heeft de toegenomen vraag, in combinatie met niet-duurzame oogstpraktijken en klimaatverandering, de supply chain onder druk gezet. Hierdoor wordt botanische vervalsing een groeiende zorg, waardoor botanische identificatie een steeds belangrijker onderdeel wordt van kwaliteitscontrole.

Idealiter wordt identificatie zo dicht mogelijk bij de bron uitgevoerd, zodat resources efficiënt kunnen worden toegewezen aan het materiaal van de juiste identiteit. Er zijn een aantal benaderingen voor botanische identificatie. Traditioneel, botanische identificatie wordt uitgevoerd door middel van morfologische beoordeling en chemische analytische methoden.

Morfologische identificatie is gebaseerd op verschillen in macroscopische en microscopische kenmerken van plantaardige materialen. Echter, het vereist een goed opgeleide botanicus en de toepassing ervan op botanische poedervormige materialen is beperkt. Chemische analysemethoden worden veel gebruikt in farmacopee en laboratoria, maar zijn niet ideaal voor veldtesten vanwege de grootte van instrumenten en milieuvereisten.

Onlangs zijn genomische methoden naar voren gekomen als een alternatieve techniek voor botanische soorten identificatie als gevolg van de hoge trouw en specificiteit van genomische informatie in plantaardige materialen. Met moleculaire diagnostische instrumenten die nu beschikbaar zijn in een vorm van draagbare apparaten, wordt deze aanpak mogelijk voor veldtoepassing. Het doel van dit protocol is om een methode voor botanische identificatie in te voeren in situaties waarin de toegang tot de laboratoriumapparatuur en expertise beperkt is, zoals de boerderij die het botanische materiaal levert, met behulp van een draagbaar qPCR-systeem.

Matricaria chamomilla, algemeen bekend als Duitse kamille, is gebruikt als een kruidenmedicijn ter bevordering van de gezondheid voor eeuwen. Om de specificiteit van de huidige methode aan te tonen, wordt de differentiatie van de Duitse kamille van een andere veelgebruikte kamillebloem, bekend als Romeinse kamille, opgenomen voor vergelijking. De veldidentificatieprocedure wordt gedemonstreerd in het midden van een Duitse kamilleboerderij.

Stel een testgebied in het veld in met een vlak en horizontaal oppervlak. Identificeer een representatieve plant die de kenmerken van de meerderheid van de planten in het kamillebloemveld weerspiegelt. Kies een bloemkop van de representatieve plant met behulp van steriele handschoenen.

Doe het monster in een opvangbuis van 2,0 milliliter. Herhaal en verzamel een bijsluiter van ongeveer 0,5 tot 0,7 centimeter lang van dezelfde plant. Verwarm de droge badbrocuse voor op 95 graden Celsius.

Voeg aan elke opvangbuis 100 microliter van de extractieoplossing uit de DNA-extractiekit van de plant toe. Voor een betere DNA-extractie-efficiëntie, maal het monster met behulp van een weefsel stamper. Sluit de buis.

Zorg ervoor dat het botanische weefsel gedurende het hele extractieproces door de extractieoplossing wordt gedekt. Plaats de opvangbuizen in een voorverwarmde droogbadinubuse en ontcubeer de opvangbuizen 10 minuten na 10 minuten uit de droogbadinubuse. Voeg 100 microliter van de verdunningsoplossing uit de DNA-extractiekit toe en meng de oplossing door meerdere keren op en neer te pipetten.

Herhaal dezelfde stap voor folderextractie. Schud om de oplossing verder te mengen. Het probleem van de plant lijkt meestal niet te worden afgebroken na deze behandeling.

De vloeibare kleur kan veranderen en troebel worden. Configureer de thermocycling-omstandigheden van het qPCR-instrument volgens tabel één, die begint met een constante temperatuurstap voor de eerste denaturatie, gevolgd door 25 cycli van versterking en eindigt met temperatuurhelling om een smeltcurve met hoge resolutie te verkrijgen. Ontdooi de qPCR master mix en primers vermeld in tabel twee bij kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik.

Plan de reactie die in elke put geladen zal worden. Putten met positieve controles met de doelsoorten, positieve controles met niet-doelsoorten, monsters en negatieve controles. In dit voorbeeld worden 10 putten gebruikt, vijf voor de Duitse kamille-identificatietest en nog eens vijf voor de Romeinse kamille-identificatietest.

Voor elk type soort identificatie test, een put bevat een positieve controle met DNA gewonnen uit de beoogde soort referentiemateriaal, een put bevat een positieve controle met DNA gewonnen uit niet-gerichte soorten referentiemateriaal, twee putten zijn gevuld met bloem en blad DNA monsters gewonnen uit het veld, en een put wordt toegewezen voor een negatieve controle. Tabel drie beschrijft elk goed type. Bereid een reactie master mix volgens tabel vier voor elke botanische soort identificatie test.

Een typische reactiemastermix bevat universele qPCR master mix, twee keer, vooruit en achteruit soorten specifieke primers, en nuclease-vrij water. Grondig gemengd de reactie master mix door pipetting voor gebruik. Plaats de PCR-reactiecartridge naar boven op een plat en stabiel oppervlak.

Laad 18 microliters van de reactie master mix geconfigureerd in de vorige stap in de cartridge putten volgens de putten hier gedefinieerd. Voor deze demonstratie, voeg de Duitse kamille identificatie test reactie meester mix in putten gelabeld voor GC-test, GCT in putten een, drie, vijf, zeven, negen, en de Romeinse kamille identificatie test reactie meester mix in putten gelabeld voor RC test, RCT in putten twee, vier, zes, acht, 10. Breng twee microliter monster-DNA over van de supernatant van de DNA-extractiebuizen en vooraf geëxtraheerde DNA-positieve controles in cartridgeputs die vooraf zijn geladen met qPCR-mastermix.

Nadat u elke DNA-sjabloon aan de qPCR-mastermix hebt toegevoegd, mengt u de oplossing voorzichtig door pipetting. Sluit de cartridge voorzichtig af met plakfolie. Laad de cartridge op de thermocyclingkamer en sluit deze.

Stel het qPCR-instrument in om uit te voeren. In het huidige protocol wordt intercalating dye gebruikt om de versterking van doelfragmenten in real-time te meten. De Ct-waarde wordt gedefinieerd als het aantal cycli dat nodig is om het fluorescerende signaal over de vooraf gedefinieerde drempel te kunnen overschrijden.

Een Ct-waarde van minder dan 25 cycli werd beschouwd als positieve versterking. In dit cijfer werd de Romeinse positieve controle alleen versterkt in de Romeinse kamille-identificatietest, maar niet in de Duitse kamille-identificatietest. De Duitse kamille positieve controle en veld monsters werden alleen versterkt in de Duitse kamille identificatie test, maar niet in de Romeinse kamille identificatie test.

De negatieve controle werd niet versterkt in beide tests. Om specifieke versterking in positieve controles en monsters verder te bevestigen, werden fracties van PCR en producten van elke put uitgevoerd op 2%agarose gel in het laboratorium. Alle putten met een Ct-waarde van minder dan 25 leverden amplicons op bij hun verwachte grootte, die verschillen tussen Duitse kamille en Romeinse kamille.

De rest van de rijstroken toonde geen specifiek versterkingsproduct, in overeenstemming met de afwezigheid van fluorescerend signaal voor deze putten zoals waargenomen in veldtesten. Na PCR-versterking werd een smeltcurveanalyse uitgevoerd met dezelfde software die werd gebruikt om het fluorescerende signaal te controleren. Met de toename van de temperatuur beginnen de dubbelstrengamplicons te scheiden, wat resulteert in de afname van de fluorescentieintensiteit.

De fluorescentieintensiteitsveranderingen werden verder omgezet in smeltende piekkrommelingen voor verdere differentiatie van Duitse kamille van Roman kamille door hun kenmerkende smeltende pieken. In dit cijfer, de smeltende piek van de Duitse kamille positieve controle is 85,6 graden Celsius en het is onderscheiden van de smeltende piek van de Romeinse kamille positieve controle. De PCR amplicons van veldmonsters produceren smeltpieken dicht bij de Duitse kamille positieve controle.

De identiteit van het veldmonster wordt bepaald op basis van specifieke versterking en karakteristieke smelttemperatuur die overeenkomt met de regelaars. In dit voorbeeld worden zowel bloem als blad verzameld in het veld geïdentificeerd als Matricaria chamomilla, Duitse kamille. Romeinse kamille testresultaten voor deze twee monsters zijn negatief.

Het protocol toont de identificatie van de Duitse kamille in het veld met behulp van een draagbare qPCR-systeem. Soortgelijke methoden kunnen we ontwikkelen om het portfolio van plantaardige producten uit te breiden die getest kunnen worden. We hopen dat deze video waardevolle trainingsmaterialen zal bieden voor wetenschappers, zelfs niet-experts om botanische identificatie uit te voeren in het veld of in een omgeving met beperkte laboratoriumapparatuur.

DNA-gebaseerde veldidentificatietesten leveren niet alleen zeer nauwkeurige resultaten op die overeenkomen met laboratoriumanalyse, maar verminderen ook de tijd en kosten die gepaard gaan met traditionele methoden die in een laboratorium worden uitgevoerd.