Colonoscopische geleide pinch-biopsieën bij muizen uitvoeren en daaropvolgende weefselveranderingen evalueren

Deze methode biedt een ideale aanpak voor het bestuderen van colonische wondgenezing en de moleculaire en histologische veranderingen die optreden na letsel. Deze methode kan ook licht werpen op IBD pathogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om de locatie van letsel en de timing van het wondgenezingsproces nauwkeurig te beheersen.

Personen die deze methode voor het eerst uitvoeren, kunnen moeite hebben om de colonoscoop in de dikke darm van de muis in te brengen en consistente wonden te creëren. Het herhaaldelijk beoefenen van deze technieken zou deze problemen moeten overwinnen. Gezien de vele gecoördineerde stappen en nuances die bij deze procedure betrokken zijn, is visuele demonstratie van deze methode van cruciaal belang.

Voordat u met de procedure begint, plaatst u een 1,9 millimeter stijve boor endoscoop in een endoscoophuls. En bevestig de geassembleerde endoscoop volgens de instructies van de fabrikant aan de lichtbron en het videobeeldapparaat. Gebruik de meegeleverde slang om de luchtpomp aan de gasklep aan de linkerkant van de huls naast het werkkanaal te bevestigen.

Zorg ervoor dat het werkkanaal in de open positie staat en steek drie Franse biopsie forceps door het werkkanaal. Schuif de tang naar het einde van de schede zonder uit de huls te steken. Plaats vervolgens de verdoofde muis op een endoscopisch ensceneringsplatform aan de ventrale kant en bevestig het juiste niveau van sedatie door gebrek aan respons op pedaalreflex.

Vul na het aanbrengen van oogzalf een spuit van drie milliliter met een bijgevoegde rattengavagenaald met PBS op kamertemperatuur. En steek de naald ongeveer een centimeter in de anus van de muis. Laat het materiaal voorzichtig doordrenken met PBS totdat het fecale materiaal is verwijderd.

Verschillende fecale pellets moeten de muis verlaten samen met de PBS die is geïnfuseerd. Steek de geassembleerde endoscoop 0,5 centimeter in de anus en breng de biopsie-tang in het gewiste lumen van het rectum totdat de volledige kaken van de tang voorbij het einde van de schede zijn. Draai de tang 90 graden zodat de kaken openen in een oost-west oriëntatie en open de uiteinden en vervroeg de tang ongeveer een centimeter, het sluiten en terugtrekken van de tang in een vloeiende, snelle beweging om de biopsie te oogsten.

Om te voorkomen dat de dikke darm volledig wordt geïnsuffold tijdens het uitvoeren van de biopsie, laat u de rechterkant van de gasklep open. Druk onmiddellijk na de biopsie op het voetpedaal dat aan het colonoscoopopnameapparaat is bevestigd om de video-opname te starten. En druk stevig een wijsvinger tegen de rechterkant van de gasklep om de opening volledig te bedekken, waardoor lucht in de endoscoop en dus in de dikke darm wordt gedwongen.

Trek de tang terug uit de schede en in het rectale lumen terwijl u zich in de gesloten positie bevindt. En plaats de tang tegen de rectale wand direct boven de wond totdat de basis van de kaken is uitgelijnd met de bovenrand van het kijkveld. Blijf de dikke darm volledig insuffleren totdat een duidelijk zicht op de wond kan worden waargenomen.

Om de beste metingen van het wondbed te verkrijgen, moet u geduld hebben en vervolgens de colonoscoop in een precieze hoek plaatsen, zodat u uw beste beeld van het wondbed krijgt. Open de video in een geschikt softwareprogramma en breng de video naar een frame met een tijdstip waarop het wondbed gemakkelijk kan worden gevisualiseerd. En waarbij de gesloten tang zich boven het wondbed en tegen de rectale muur bevindt, en de muur strak is.

Verkrijg op elk moment een momentopname van dit frame en codeer de bestandsnaam om ervoor te zorgen dat de metingen van de wondbedden op een geblindeerde manier worden uitgevoerd. Als u de grootte van het wondbed wilt kwantificeren, opent u de afbeeldingen in ImageJ en gebruikt u het gereedschap Vrije handselecties om een omtrek rond de wond te tekenen. Selecteer onder Analyseren de optie Meten.

En de waarde van die meting wordt automatisch ingevuld in het venster Resultaten. Wanneer alle metingen zijn verkregen, berekent u de grootte van de wond op volgende dagen ten opzichte van de grootte op dag nul in een spreadsheet. Open op het juiste experimentele eindpunt de huid- en buikspierlagen om de lichaamsholte van het experimentele dier bloot te leggen en een gesloten tang onder de dikke darm te plaatsen.

Til voorzichtig de dikke darm op om deze los te maken van de onderliggende mesenterie en snijd het weefsel in het midden en bij de anus om het van de muis te verzamelen. Gebruik een spuit van 20 milliliter gevuld met ijskoude PBS en uitgerust met een rattengavagenaald om de fecale inhoud eruit te spoelen. En plaats de gewiste dubbele punt op een stuk filterpapier.

Open de dikke darm in de lengterichting en zorg ervoor dat de mesenterische kant naar beneden is tegen het filterpapier. En gebruik een Pasteur pipet om het slijmvlies te bedekken met 0,2% methyleenblauw. Laat na een paar seconden de overtollige vlek weglopen en bekijk de dikke darm onder een ontleedmicroscoop om het wondbed te lokaliseren.

Gebruik een micro irisschaar van 4 inch om rond de rand van het bed te snijden en zorg ervoor dat u niet in de spierlaag snijdt. En gebruik een fijn puntpincet om het ontleede weefsel in een buis over te brengen voor snap-bevriezing en of opslag. Open op het juiste experimentele eindpunt de geoogste dikke darm in de lengterichting op een stuk filterpapier, mesenterische kant naar beneden.

Bedek het weefsel voorzichtig met uw fixatief naar keuze. Bedek het weefsel met parafilm in een verzegelde container gedurende 4 tot 6 uur voor opslag in 70%ethanol. Verwijder op de dag van de verwerking de parafilm en voeg 0,2% methyleenblauw toe aan het weefsel, zoals aangetoond.

Nadat u de overtollige vlek hebt afgetapt, plaatst u het weefsel onder een ontleedmicroscoop om het wondbed te lokaliseren. Gebruik een scalpel met een nummer 10-mes, snijd direct door het midden van het wondbed en ga door de rest van de dikke darm in een rechte lijn, zodat de dikke darm in de lengte doormidden wordt gesneden. Voor cryosectioning, embed de dubbele darm stukken zodanig dat de kant die werd gesneden door de scalpel is gezicht naar beneden in een basisvorm half gevuld met weefsel bevriezen medium.

Zet het weefsel vast met een fijn pincet en plaats de basisvorm op een metalen plaat of dikke aluminiumfolie bovenop droogijs om het vriesmedium uit te harden. Zodra het onderste deel van het medium is bevroren, vult u het resterende volume van de basisvorm met het vriesmedium bij kamertemperatuur. En breng de mal terug naar het droogijs totdat het hele weefselblok bevroren is.

Breng vervolgens de mal over in een vriezer van 80 graden Celsius tot het doorsneden is. Hier worden representatieve beelden van acceptabele weergaven van het wondbed getoond voor een nauwkeurige kwantificering van de grootte van het wondbed en de sluitingssnelheid van de wond. In deze ex-vivo weergave van een wondbed kunnen indicatoren van de omtrek van het wondbed en waar het weefsel moet worden gesneden om visualisatie van het wondbed bij doorsnede mogelijk te maken, worden waargenomen.

In dit representatieve beeld kan een H- en E-vlekgedeelte van een wondbed duidelijk worden waargenomen. Het is belangrijk om te allen tijde onmiddellijke beelden van het wondbed te verkrijgen om een nauwkeurige beoordeling van de wondgenezingssnelheid te garanderen. Na de pinch biopsie kunnen verschillende belangenbehartigingsmiddelen in het wondbed worden geïnjecteerd om hun effecten op de wondgenezingssnelheid te testen.