Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Ons protocol beschrijft het gebruik van conventionele BODIPY kleurstoffen voor super-resolutie microscopie met behulp van hun schaarse, rood-verschoven toestanden. Dit stelt ons in staat om organellen en biomoleculen te bestuderen in levende cellen met een resolutie van 30 nanometer. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en de veelzijdigheid van verschillende beschikbare BODIPY conjugaten die een langdurige bron van enkele molecuul signalen bieden.

Onze aangetoonde toepassing kan belangrijk worden om inzichten te krijgen in ziekten zoals leververvetting of diabetes type 2 door lipidedruppels en vetzuur op te lossen onder de diffractielimiet. We krijgen inzicht in vetzuur en lipide druppelbiologie in gist- en zoogdiercellen. Deze techniek is echter van toepassing op alle andere transparante celtypen met een lage achtergrondfluorescentie.

Bij het gebruik van de techniek voor de eerste keer, zorg ervoor dat de di concentraties en laser bevoegdheden te optimaliseren, om heldere enkele molecuul signalen te observeren. Een visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk om te zien hoe de di concentratie en optimalisatie van laserkracht resulteert in heldere signalen van één molecuul. Onderhoud de zoogdier U2OS cellen in niet-fluorescerende DMBM met 10% foetale runder serum vier millimolar glutamine, een millimolar natrium pyruvaat, en een procent penicilline streptomycine antibiotica in een T-25 kolf.

Splits de cellen op 70 tot 80%samenvloeiing tot een tot vijf, en pipet in een enkele put van een acht put plaat. Verander de cellen in de acht putplaat gedurende 12 tot 24 uur. Tien minuten voor de beeldvorming, voeg een BODIPY-C12 Lysotracker groen of en de andere BODIPY conjugaat, voeg een laatste concentratie van 100 nanomolar.

Monteer de juiste filtersets in het emissiepad op basis van de emissiekleur van de gebruikte bodipy. Zet de microscoop aan. Microscoopstadium, 488 nanometer en 561 nanometer lasers, evenals de camera.

Voeg een druppel opkomende olie op de microscoop doelstelling. Open de HAL4000-software die het LED-licht regelt voor heldere veldbeeldvorming, laservermogens, laserluiken en camera-instellingen voor beeldvorming. Stel de EMCCD-versterking in op 30 en de cameratemperatuur op min 68 graden Celsius.

Bereid de camera en bijbehorende software voor om films op 20 Hertz op te nemen. Zet de microscoop podium kachel en zet het op temperatuur van 37 graden Celsius en op een kooldioxide-niveau van vijf procent. Pas de kleur van de objectieve correctie dienovereenkomstig aan.

Monteer het monster op de microscoop fase en focus totdat het scherpstelsysteem in dienst neemt. Verplaats het werkgebied met de fasecontroller totdat gezonde cellen in het gezichtsveld worden weergegeven. Laad laser sluitersequenties voor de excitatie van monumus en dimmers, aan wie laserkracht van de 561 nanometer laser tot tussen 821 kilowatt per vierkante centimeter voor een enkel molecuul lokalisatie microscopie, zodanig dat, enkel molecuul fluorescentie poriën worden gedetecteerd in de rood-verschoven emissiekanaal.

Pas het laservermogen aan tussen punt 035 en punt 07 watt per vierkante centimeter voor de 488 nanometer laser, zodat conventionele fluorescentie in het groene emissiekanaal verschijnt. Kies een doelmap voor films en neem 5000 tot 20000 acquisitieframes op om voldoende lokalisaties te verzamelen voor het reconstrueren van afbeeldingen met een superresolutie. Ga naar verschillende weergavevelden en herhaal om gegevens te verzamelen voor meer cellen.

Laad de film in een enkel molecuul lokalisatie microscopie analyse software. Screen de film visueel en pas contrastinstellingen aan, zodat enkel molecuul fluorescerend knipperen zichtbaar is. Om identificatieparameters van één molecuul in te stellen voor het passen van de 2D Gaussian, PSF's.

Screen visueel door enkele voorbeeldframes om de identificatieparameters te controleren en de afzonderlijke fluorescente uitbarstingen op betrouwbare wijze te detecteren. Persanalyse om single molecule lokalisatie microscopie uit te voeren stel analyse met de geoptimaliseerde identificatie parameters. En dan, maak elk molecuul als een 2D Gaussian waarvan de breedte wordt gewogen door de omgekeerde vierkantswortel van het gedetecteerde aantal fotonen.

Beoordeel de kwaliteit van de gegevens. Gebruik beperkte framebereiken om afzonderlijke molecuulverdelingen in meer specifieke instanties en tijd te observeren. Dit verklaart de organellebeweging tijdens het verwerven van gegevens.

In deze studie presenteerden we een geoptimaliseerde monstervoorbereiding, gegevensverwerving en analyseprocedure met single moleculelokalisatiemicroscopie met behulp van BODIPY-conjugaten. Om een voorbeeld van de workflow voor het verwerven en analyseren van single molecule lokalisatie microscopie gegevens aan te tonen, werd BODIPY in gist gebruikt om lipide druppels op te lossen onder de optische diffractie limiet. Voorbeelden van de verschillende veelkleurige beeldvormende modi van BODIPY in vervoeging met andere sondes zoals GFP en mEos2 worden hier getoond.

BODIPY-C12 gevormd in mobiele niet-lipide druppelclusters in celperiferie bij het vasten, in tegenstelling tot hun integratie in lipidedruppels onder gevoede omstandigheden. Om de single molecule lokalisatie microscopie vermogen van BODIPY conjugaten verder uit te breiden naar zoogdiercellen, bodipy-C12 en Lysotracker groen in levende U2OS cellen werden afgebeeld. Het optimaliseren van de BODIPY-concentratie en het opwekken van de laserkrachten zijn kritieke stappen om heldere signalen van één molecuul te visualiseren en beelden met superresolutie te reconstrueren.

Deze methode kan worden gebruikt met elke andere BODIPY conjugaat om hoge resolutie inzicht te krijgen, in de speciale temporele verdeling van specifieke bio-moleculen in levende cellen. Onze techniek effende de weg, om lipide druppel en vetzuur biologie verder te ondervragen op de nanoscopische lens schaal. Echter, deze toepassing gaat veel verder dan de specifieke philopectetes als gevolg van de beschikbaarheid van verschillende functionele BODIPY conjugaten.

Zorg ervoor dat u de standaard operationele procedures voor de behandeling van de biologische monsters en kleurstoffen te volgen, en ook onze verplicht hedgers en volg de laser veiligheid procedures.