Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Met behulp van dit protocol, elk lab dat een standaard confocale microscoop uitgerust met een 405 nanometer laser heeft kan uitvoeren haarcel voorloper laser ablations en controleren hun regeneratie. In tegenstelling tot elektro-ablatie beperkt deze techniek de beschadiging van omliggende cellen en is deze toegankelijker dan een krachtige gepulseerde UV-laseropstelling. Confocale beeldvorming kan ook onmiddellijk voor en na de ablatie worden uitgevoerd.

Deze techniek stelt ons in staat om het regeneratieve gedrag van sensorische voorouders beter te begrijpen, wat kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën voor menselijk gehoorverlies. Voor de montage, eerste pipet drie tot vier verdoven larven in een kleine druppel E3 tricaine oplossing in het midden van de 35 millimeter schotel, met een 14 millimeter nummer 1,5 cover slip bodem. Verwijder de overtollige oplossing zodat de larven in een kleine druppel blijven die net groot genoeg is om ze te bevatten.

En plaats het gerecht op het podium van een verrekijker stereo microscoop microscoop. Manipuleer de zoom en focus zodat alle larven zich in het gezichtsveld bevinden en gebruik een transferpipet om een dun laagje agro-oplossing aan de afdekslip toe te voegen. Verwijder de overtollige agros totdat de vloeistof gewoon vult de put aan de onderkant van de schotel, waarbij ervoor wordt gezorgd dat geen larven aan te sporen.

En gebruik een haarmes om de larven snel te oriënteren in de agro-oplossing met de rostral kant naar links gericht. Druk de larven voorzichtig tegen het glas aan, zodat de larven in profiel liggen met hun rechterzijde naar beneden gericht. Na ongeveer 60 seconden beginnen de agro's te stollen en kunnen de larven niet geheroriënteerd worden.

Na vijf minuten, gebruik maken van een transfer pipet om de schotel te vullen halverwege met E3 aangevuld met 1X tricaine. Om potentiële doelen te lokaliseren, schakelt u de stroom in voor het confocale microscopiesysteem voor laserscannen en initialiseert u de laser via de geïntegreerde imagingsoftware. Selecteer de 63X Plan-Apochromat olie onderdompeling doelstelling en breng onderdompelingsolie toe op de lens.

Zet de schotel in een cirkelvormig invoegen met het rostralaspect van de larven naar links gericht. Met behulp van helder veld of differentiële interferentie contrastverlichting, selecteert u een van de gemonteerde larven voor beeldvorming en gebruik de focusknop om de huid aan de zijkant van de vis die het dichtst bij de afdekking ligt in beeld te brengen. Schakel over op epifluorescente verlichting in het GFP-kanaal en zoek de achterste laterale lijn door GFP-expressie langs het horizontale myoseptum.

Ringen van fluorescerende cellen zijn indicatief voor de neuromast mantelcellen en langwerpige strengen van cellen zijn de interneuromastcellen. Beginnend met de eerste migrerende primordium neuromast, gebruik de stage control joystick om visueel te scannen caudally langs de horizontale myoseptum. Na de reeks interneuromastcellen tot het gebied tussen de derde en vierde migrerende primordiumneuromasten wordt bereikt.

Als er meerdere larven moeten worden afgebeeld, selecteert u de positie om de positie van de eerste fase in te stellen. Nadat cellichamen in de L3-regio zijn geïdentificeerd, schakelt u over naar de aanschafmodus en gebruikt u een geschikte laser om het GFP-beeldvormingsspoor te activeren. Als u een verzonden lichtkanaal wilt toevoegen aan de geactiveerde lasertrack, klikt u op het vak T-PMT in het vervolgkeuzemenu beeldset.

Om ET20 larven te beelden, selecteert u de 488 nanometer laser, stelt u de laserkracht in op 6% van de pinholegrootte op één gebiedseenheidequivalent en de digitale winst op 750. Pas de winsten zodanig dat de cellichamen verzadigd zijn om anders dimprojecties en filopodia vast te leggen. En stel de framegrootte in op 1, 024 bij 1, 024 pixels, de gemiddelde op twee en de digitale zoom op 0,7.

Schakel het vakje Z-stack in om het vervolgkeuzemenu Z-positie naar boven te brengen. Terwijl snel scannen, focus uit tot de interneuromast cellen zijn gewoon onscherp en stel de eerste slice. Focus door het monster totdat de interneuromastcellen weer onscherp zijn en stel het laatste segment in.

Klik vervolgens op stoppen en klik op startexperiment om een V-stack van voor ablatie vast te leggen. Als de faseposities zijn toegevoegd, activeert u de optie Posities zodat alleen de huidige positie wordt weergegeven en slaat u het bestand op zodra het is vastgelegd. Voor laserablatie van de beoogde cellichamen klikt u op Alle gereedschappen in de acquisitie-interface weergeven en selecteer in het menu voor beeldvormingsinstellingen een nieuw nummer toevoegen.

Klik op kleurstof en selecteer DAPI. Selecteer onder kanalen 405 voor de laserinstelling en verhoog het laservermogen tot 75%Klik op het DAPI-kanaal om de laser uit te schakelen tijdens het scannen op kandidaat-cellichamen voor ablatie. Klik live en met het lichaam van een interneuromast cel gecentreerd in het gezichtsveld, zoom in op het scanframe tot 20 tot 22X.

Stop het live scannen zodra het cellichaam het gezichtsveld vult. Controleer de laser sluiterdoos van 405 nanometer om het spoor te activeren en stel een timer in gedurende 45 seconden. Activeer vervolgens continu scannen en start de timer.

Onmiddellijk stoppen met het scannen op 45 seconden. Voor beeldvorming van de cellichamen na de ablatie, onder de kanalen menu, unclick de DAPI track om de ablatie laser te activeren en open de overname modus menu. Klik op zoomen en verlaag de zoom tot 0,7.

Om het succes van de celablatie te beoordelen, scant u snel het gezichtsveld. Met dezelfde instellingen als die voor de pre-ablatie beeldvorming, vastleggen en opslaan van een post-ablatie afbeelding. Inspecteer het uitgezonden beeld van het fotomultiplierbuiskanaal om de cellulaire schade verder te bevestigen.

Beschadigde cellen vertonen een korrelig uiterlijk en de kernen zullen vaak zwellen of onregelmatig van vorm lijken. Als u het herstel van de postblatiecellichaam wilt beoordelen, activeert u zowel de stadiumpositie als de tijdopties voor time-lapse-beeldopname en stelt u de tijdparameters in op het juiste experimentele tijdspunt en intervallen van 15 minuten. Start vervolgens het experiment om afbeeldingen te verkrijgen en het resulterende bestand op te slaan wanneer het is voltooid.

In dit representatieve experiment werd het gebied van de laterale lijn tussen de derde en vierde migrerende primordiumneuromasten geïdentificeerd en pre-ablatiebeelden vastgelegd. Na de ablatie scan bevestigd dat er geen cel lichamen bleef in de ablated regio. Het verlaten van een kloof tussen de langwerpige projecties van de aangrenzende interneuromast cellen.

Analyse van het uitgezonden licht fotomultiplier buiskanaal na ablatie, onthult beschadigde en stervende cellen. Gekenmerkt door gezwollen en onregelmatig gevormde kernen en een korrelig uiterlijk. De aanwerving van grote amoeboidcellen die waarschijnlijk macrofagen zijn, kan ook worden waargenomen.

In dit experiment creëerde de ablatie van verschillende cellen in de dubbele transgene larven aanzienlijke hiaten in de interneuromastcellenstring, maar had het weinig of geen effect op de zijlijnzenuw. Na laserablatie kunnen de tussengroottes worden gemeten. Variërend van slechts een paar micron tot 100 micron, afhankelijk van de breedte die de individuele neuromastcellen en hoeveel cellen zijn geselecteerd voor ablatie.

Na ablatie herstellen sommige interneuromastcellen binnen de eerste paar uur na beeldvorming. Met de waarschijnlijkheid van gap sluiting negatief correleren met gap grootte. Zelfs in interneuromastcellen die echter niet in staat zijn om te herstellen, kan de vorming van lange projecties van naburige interneuromastcellen, die lijken op het uitbreiden van neuronale groeikegels, worden waargenomen.

Het is belangrijk om het T-PMT-kanaal grondig te inspecteren op beschadigde cellen die onregelmatig gevormde kernen en granulariteit vertonen, en om voldoende tijd te geven voor deze indicatoren van celdood zichtbaar te maken. Verdere analyse van de resulterende time-lapse microscopie gegevens, kan potentieel onthullen nieuwe cellulaire gedrag veroorzaakt door laser ablatie en kan leiden tot de ontwikkeling van experimenten voor het identificeren van regelgevers van regeneratie. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de moleculaire regelgevers van interneuromastcelregeneratie te bestuderen door een snelle en kosteneffectieve methode te bieden om deze cellen selectief te beschadigen.