In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Proximity ligatie test stelt gebruikers in staat om eiwit-eiwit interacties in situ te detecteren, onthullen ruimtelijke en temporele patronen van de interacties. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over regulering van C.elegans ontwikkeling. Deze techniek biedt een vergelijkbare gevoeligheid voor detectie van eiwit-eiwit interacties zonder de complexiteit van andere technieken, zoals FRET en BiFC.

Individuen die nog nooit ontleed wormen om de nagels vrij te geven kunnen worstelen met deze stap. Oefen ontleden wormen, en gebruik ze voor immunofluorescentie om de behandeling en dissectie technieken te perfectioneren voordat u overgaat op PLA. Om te beginnen, kies 30 tot 40 jong volwassen wormen in een horloge glazen schotel met 500 microliter van 1x M9 en levamisole.

Na het verzamelen van de wormen, zorgvuldig verwijderen en weggooien van de meeste van de media om bacteriën die wordt overgedragen samen met de wormen te verwijderen. Voeg verse 500 microliters van 1x M9 en levamisole toe en gebruik de pipet om de media voorzichtig op te stellen en af te geven om de wormen te spoelen. Verwijder en verwijder de meeste media voorzichtig.

Herhaal de was twee tot drie keer. Na de wasbeurten, laat de wormen in ongeveer 100 microliter van de media voor niet langer dan acht minuten. Breng de wormen met behulp van een glas- of polyethyleenpipet over op een 25 millimeter-bij-75-millimeter microscoopdia bekleed met 001%poly-L-lysine.

Verwijder de overtollige media, zodat ongeveer 15 microliter media op de dia blijft. Verwijdering van overtollige buffer is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de ontleed wormen en gonaden zal zich hechten aan de dia. Plaats onder een ontledende microscoop, met twee naalden van 26 1/2 meter, de ene naald over de andere, zodat de uiteinden een schaar vormen.

Met behulp van de naalden georiënteerd op deze manier, snijd de wormen achter de keelholte om de kiemlijnen vrij te geven. Ontleed alle wormen binnen vijf minuten. Nadat alle wormen zijn ontleed, plaats voorzichtig een 22-millimeter-bij-40-millimeter coverslip over de dia, zodat het loodrecht op de dia.

De uiteinden van de coverslip moeten van de glijbaan hangen. Vries de glijbanen op een voorgekoeld aluminiumblok dat minstens 20 minuten op droogijs wordt onderhouden. Plaats voorzichtig een gekoeld potlood op de coverlip om te voorkomen dat de coverslip los raakt als gevolg van ijsuitbreiding.

Wanneer u klaar bent voor fixatie, veeg de coverslips met een potlood, en onmiddellijk duik de dia in een pot met verse, ijskoude methanol voor een minuut. Veeg vervolgens voorzichtig de randen van de dia rond het monster en breng 150 microliter formaldehyde fixatief aan bij kamertemperatuur om vijf minuten vast te stellen. Raak de schuif aan een papieren handdoek in een loodrechte hoek van 90 graden om de fixatieve run van de glijbaan te laten lopen en te absorberen in de papieren handdoek.

Blokkeer de glijbanen twee keer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een Coplin pot met 50 milliliter PBT/BSA. Blokkeer vervolgens de glijbanen met een PBT/BSA-oplossing met 10% normaal geitenserum. Veeg voorzichtig de randen rondom de dia en breng 100 microliter van de oplossing aan op elke dia.

En roer de glijbaan voorzichtig om de oplossing te verspreiden. Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Plaats de glijbaan op een papieren handdoek om de oplossing van de glijbaan te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af.

Als u de dia's wilt blokkeren, past u één druppel van het blokkerende reagens toe op de ruimte van 14 millimeter bij 14 millimeter. Broed de glijbanen een uur lang uit bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Plaats de glijbanen op een papieren handdoek om het blokkeren van reagens van de glijbaan te laten lopen en veeg voorzichtig de randen af.

Gebruik het antilichaamverwijdingsmluent om de primaire antilichamen te verdunnen. Breng 40 microliter van de verdunde primaire antilichaamoplossing per 14-bij-14-millimeter ruimte op de dia's aan. Plaats de glijbanen in een vochtige kamer, en broeden 's nachts op vier graden Celsius.

In de ochtend, was de glijbanen twee keer gedurende vijf minuten, elk met 50 milliliter 1x wasbuffer A bij kamertemperatuur in een Coplin pot. Stel de Coplin-pot in op een orbitale shaker die is ingesteld op 60 rpm. Leg de glijbanen op een papieren handdoek om de wasbuffer van de glijbaan te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af.

Bereid een 40-microliter oplossing met plus- en minsondes. Voeg de oplossing toe aan elke ruimte van 14 bij 14 millimeter. Broed de glijbanen een uur lang in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius.

Was de glijbanen twee keer gedurende vijf minuten elk met 50 milliliter 1x wasbuffer A bij kamertemperatuur in een Coplin-pot. Stel de Coplin-pot in op een orbitale shaker die is ingesteld op 60 rpm. Verdun de ligatiebuffer één tot vijf met ultrazuiver water.

Gebruik deze buffer om de ligase één tot 40 te verdunnen om een werkende voorraad ligatieoplossing voor te bereiden. Plaats de glijbaan op een papieren handdoek om de wasbuffer van de zijkanten te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af. Voeg 40 microliter van de ligatieoplossing toe aan elke ruimte van 14 bij 14 millimeter.

Broed de glijbanen in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na het wassen en drogen van de dia's zoals eerder beschreven, voeg 40 microliter vers bereide versterking oplossing, beschermd tegen licht, aan elke 14-bij-14-millimeter ruimte. Broed de glijbanen in de vochtige, donkere kamer gedurende een uur en 40 minuten bij 37 graden Celsius.

Was de glijbanen twee keer gedurende 10 minuten elk met 50 milliliter 1x wasbuffer B, en was de dia's een keer gedurende een minuut met 50 milliliter 01x wasbuffer B.Na het drogen van de epoxy-gecoate omtrek van de dia, voeg 10 microliter van montagemedium aan elk monster, en leg voorzichtig een coverslip op de top, waardoor de montage medium verspreid. Verf rond de rand van coverslip met nagellak om de coverslip en schuif te verzegelen. Vermijd het verplaatsen van de coverslip.

Laat de nagellak minstens 20 minuten uitharden bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Co-immunostaining van de kiemlijnen met FLAG en GFP antilichamen onthulden hun expressiepatroon in de kiembaan. Terwijl GFP werd uitgedrukt in de kiembaan, OMA-1:GFP expressie was beperkt tot de late pachytene en eicellen.

FLAG immunostaining toont aan dat 3xFLAG:DLC-1 werd uitgedrukt in de kiembaan in beide stammen. Het gebied van belang voor PLA kwantificering in de kiembaan omvatte de late pachytene door de eicellen in alle kiemlijnen. Dit is de regio van OMA-1 expressie.

3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP kiemlijnen bleken een grotere hoeveelheid PLA foci te hebben in deze regio in vergelijking met de 3xFLAG:DLC-1, GFP kiemlijnen. Zorg ervoor dat er voldoende water is om de luchtvochtigheid in de kamer te verhogen. Zorg er ook voor dat dia's vlak zijn in de kamer om afvloeiing van reagentia te voorkomen.

Na nabijheid ligatie test, kunnen de geëxtrudeerde klederen worden afgebeeld op een confocale microscoop en gekwantificeerd met behulp van Fiji, ImageJ workflow. Deze kwantificering kan helpen om te bepalen of de interactie statistisch significant is. PLA stelde ons in staat om in situ interacties tussen kritische regelgevers van nematode kiembaanontwikkeling te beoordelen.