Name: In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer de proximity ligation assay voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans germline. Deze methode onthult ruimtelijke en temporele patronen essentieel voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sommige nematoden stammen gebruikt in deze studie werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center gefinancierd door de NIH (P40OD010440). Confocale microscopie werd uitgevoerd in de Universiteit van Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory uitgevoerd met ondersteuning van NIH Awards P20GM103546 en S10OD021806. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH-subsidie GM109053 aan E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 aan X.W., en Montana Academy of Sciences award aan X.W. De financiers waren niet betrokken bij het ontwerpen van studies of het schrijven van het rapport. Wij danken M. Ellenbecker voor de discussie.

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Bij het bestuderen van PPR's in de C. elegans kiembaan, de hogere resolutie aangeboden door PLA in vergelijking met co-immunostaining maakt visualisatie en kwantificering van locaties waar interacties optreden in de kiembaan. Eerder werd gemeld dat DLC-1 rechtstreeks intera-1 met behulp van een in vitro GST pulldown test26; deze interactie werd echter niet hersteld door een in vivo pulldown. De fluorescerende co-immunostaining van 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP kiemlijnen vertoont een...

Meer dan 80% van de eiwitten wordt geschat op interacties met andere moleculen1, die benadrukt hoe belangrijk PPR's zijn voor de uitvoering van specifieke biologische functies in de cel2. Sommige eiwitten functioneren als hubs die de assemblage van grotere complexen vergemakkelijken die nodig zijn voor celoverleving1. Deze hubs bemiddelen meerdere PPR's en helpen eiwitten te organiseren in een netwerk dat specifieke functies in een cel3faciliteert. Vorming van eiwitcomplexen wordt ook beïnvloed door biologische context, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van specifieke interactiepartners4,celsignaleringsgebeurtenissen en ontwikkelingsfase van een cel.
C. elegans wordt vaak gebruikt als een model organisme voor een verscheidenheid van studies, met inbegrip van ontwikkeling. De eenvoudige anatomie van dit dier bestaat uit verschillende organen, waaronder de gonad, darm en transparante nagelriem, die de analyse van wormontwikkeling vergemakkelijkt. De kiembaan die in de gonad is een geweldig hulpmiddel om te bestuderen hoe kiembaan stamcellen rijpen in gameten5 die zich ontwikkelen tot embryo's en uiteindelijk de volgende generatie van nakomelingen. Het distale tipgebied van de kiembaan bevat een pool van zelfvernieuwende stamcellen (Figuur 1). Als stamcellen de niche verlaten, gaan ze verder naar de meiotische pachytene en ontwikkelen ze zich uiteindelijk tot eicellen in het stadium van de jonge volwassene (Figuur 1). Dit programma van ontwikkeling in de kiembaan is strak geregeld door middel van verschillende mechanismen, met inbegrip van een post-transcriptie regelgevend netwerk vergemakkelijkt door RNA-bindende eiwitten (RBPs)6. PPR's zijn belangrijk voor deze regelgevende activiteit, omdat rbp's associëren met andere cofactoren om hun functies uit te oefenen.
Er zijn verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt om te sonde voor PPR's in de worm, maar elk heeft unieke beperkingen. In vivo immunoneerslag (IP) kan worden gebruikt om eiwit-eiwitcomplexen te isoleren uit hele wormextracten; Deze aanpak geeft echter niet aan waar de PPI in de worm voorkomt. Bovendien kunnen eiwitcomplexen die van voorbijgaande aard zijn en zich alleen vormen tijdens een specifiek ontwikkelingsstadium of in een beperkt aantal cellen, moeilijk te herstellen zijn door co-immunoprecipitatie. Ten slotte moeten IP-experimenten de zorgen van eiwitcomplex reassortiment na lyse en niet-specifieke retentie van eiwitten op de affiniteitsmatrix aanpakken.
Alternatieve benaderingen voor in situ detectie van PPR's zijn co-immunostaining, Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC). Co-immunostaining is gebaseerd op gelijktijdige detectie van twee eiwitten die van belang zijn voor vast wormweefsel en het meten van de mate van signaalcolokalisatie. Het gebruik van super-resolutie microscopie, die meer detail biedt dan standaard microscopie7, helpt om eiwitcolokalisatie strenger te testen voorbij de diffractie-beperkte barrière van 200-300 nm8. Co-immunostaining met zowel conventionele als superresolutiemicroscopie werkt echter het beste voor eiwitten met goed gedefinieerde lokalisatiepatronen. Daarentegen wordt het veel minder informatief voor diffuus gedistribueerde interactiepartners. Het meten voor co-lokalisatie van signalen op basis van overlap geeft geen nauwkeurige informatie over de vraag of de eiwitten in complex met elkaar9,10.
Bovendien zijn co-immunoneerslag en co-immunostaining van eiwit-eiwitcomplexen niet kwantitatief, waardoor het moeilijk is om te bepalen of dergelijke interacties significant zijn. FRET en BiFC zijn beide fluorescerende technieken. FRET vertrouwt op het taggen van eiwitten die van belang zijn met fluorescerende eiwitten (FPs) die spectrale overlap hebben waarbij energie van de ene FP (donor) wordt overgedragen naar een andere FP (acceptor)11. Deze niet-stralingsoverdracht van energie resulteert in fluorescentie van de acceptor FP die kan worden gedetecteerd op de respectieve golflengte van de emissie. BiFC is gebaseerd op de reconstructie van een fluorescerend eiwit in vivo. Het houdt in dat GFP wordt opgesplitst in twee complementaire fragmenten, zoals helices 1-10 en helix 1112, die vervolgens worden samengevoegd tot twee eiwitten van belang. Als deze twee eiwitten op elkaar inwerken, worden de complementaire fragmenten van GFP dicht genoeg in de nabijheid om te vouwen en te monteren, waardoor de GFP-fluorophore opnieuw wordt samengesteld. Gereconstitueerde GFP wordt dan direct geobserveerd als fluorescentie en geeft aan waar een PPI is opgetreden.
Als zodanig zijn zowel FRET als BiFC afhankelijk van grote fluorescerende tags die de functie van het gelabelde eiwit kunnen verstoren. Daarnaast hebben FRET en BiFC een overvloedige en vergelijkbare expressie van de gelabelde eiwitten nodig om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. FRET is mogelijk niet geschikt voor experimenten waarbij de ene partner groter is dan de andere, wat kan leiden tot een hoge achtergrond13. Overexpressie in BiFC-experimenten moet ook worden vermeden, omdat dit niet-specifieke assemblage kan veroorzaken14 die resulteert in een verhoogde achtergrond. Beide technieken vereisen optimalisatie van expressie en beeldvorming svan de gelabelde eiwitten, die de tijd die nodig is om experimenten te voltooien kan verlengen.
De nabijheidsligatietest (PLA) is een alternatieve benadering die de beperkingen van de hierboven genoemde technieken kan aanpakken. PLA maakt gebruik van primaire antilichamen die de eiwitten van belang (of hun tags) herkennen. Deze primaire antilichamen worden dan gebonden door secundaire antilichamen die oligonucleotidesondes bevatten die met elkaar kunnen hybridiseren wanneer binnen een afstand van 40 nm (of kortere)15. Het resulterende gehybridiseerde DNA wordt versterkt door middel van een PCR-reactie, die wordt gedetecteerd door sondes die het DNA aanvullen. Dit resulteert in foci die worden gevisualiseerd door een microscoop. Deze technologie kan PPR's in situ detecteren in complexe weefsels (d.w.z. de wormgonad), die is georganiseerd als een assemblagelijn met cellen in verschillende stadia van ontwikkeling en differentiatie. Met PLA kunnen PPR's direct worden gevisualiseerd in een vaste wormgonad, wat voordelig is om te onderzoeken of PPR's optreden tijdens een specifieke ontwikkelingsfase. PLA biedt een betere resolutie van PPR's in tegenstelling tot co-lokalisatie-gebaseerde testen, die ideaal is voor het maken van nauwkeurige metingen. Indien gebruikt, super-resolutie microscopie heeft het potentieel om fijnere details over de locatie van PLA foci in een cel. Een ander voordeel is dat de foci als gevolg van PLA reacties kan worden geteld door een ImageJ-gebaseerde analyse workflow, waardoor deze techniek kwantitatief.
De LC8 familie van dynein lichtketens werd voor het eerst beschreven als een subunit van de dynein motor complex16 en veronderstelde om te dienen als een lading adapter. Sinds de eerste ontdekking is LC8 gevonden in meerdere eiwitcomplexen naast het dynein motorcomplex17,18,19,20. Scannen op eiwitsequenties die het LC8-interactiemotief19 bevatten, suggereert dat LC8 veel interacties kan hebben met een breed scala aan verschillende eiwitten17,18,19,20,21,22. Als gevolg hiervan worden LC8-gezinseiwitten nu beschouwd als hubs die de assemblage van grotere eiwitcomplexen helpen bevorderen19,22, zoals samenstellingen van intrinsiek ongeordende eiwitten21.
Een C. elegans LC8-familie eiwit, dynein licht keten-1 (DLC-1), wordt op grote schaal uitgedrukt in vele weefsels en niet verrijkt in specifieke subcellulaire structuren23,24. Bijgevolg is de identificatie van biologisch relevante in vivo partners van DLC-1 in C. elegans om een aantal redenen een uitdaging: 1) co-immunoneerslag geeft niet de weefselbron aan waar de interactie plaatsvindt; 2) een beperkte expressie van bepaalde partners of tijdelijke interacties kan het vermogen belemmeren om een interactie door co-immunoneerslag op te sporen; en 3) diffuse distributie van DLC-1 leidt tot niet-specifieke overlap met potentiële partnereiwitten door co-immunostaining. Op basis van deze uitdagingen is PLA een ideale aanpak voor het testen van in vivo interacties met DLC-1.
Eerder werd gemeld dat DLC-1 rechtstreeks interageert met en dient als een cofactor voor de RNA-bindende eiwitten (RBPs) FBF-223 en GLD-125. Ons werk ondersteunt het model van DLC-1 dat als hub-eiwit fungeert en suggereert dat DLC-1 een interactienetwerk faciliteert dat zich uitstrekt tot voorbij dynein19,22. Met behulp van een GST pulldown test, een nieuwe DLC-1-interactie RBP genaamd OMA-1 is geïdentificeerd26. OMA-1 is belangrijk voor de groei van de eicellen en de menotische rijping27 en functioneert in combinatie met een aantal translationele repressors en activators28. Hoewel FBF-2 en GLD-1 worden uitgedrukt in respectievelijk de stamcellen en meiotische pachytenegebieden, wordt OMA-1 diffuus uitgedrukt in de kiembaan van de meiotische pachytene via de eicellen27 (figuur 1). Dit suggereert dat DLC-1 complexen vormt met RBPs in verschillende regio's van de gonad. Ook is gebleken dat de directe interactie tussen DLC-1 en OMA-1 waargenomen in vitro niet wordt hersteld door een in vivo IP. De PLA is met succes gebruikt als een alternatieve aanpak om deze interactie verder te bestuderen in de C. elegans kiembaan, en de resultaten suggereren dat PLA kan worden gebruikt om vele andere PPR's in de worm sonde.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyde oplossing</td><td>Elektronenmicroscopiediensten</td><td>15710</td><td>wordt gebruikt om 4% werkoplossing te maken</td></tr><tr><td>1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Maak een 1M werkvoorraad</td></tr><tr><td>1x M9</td><td>verschillende</td><td>verschillende</td><td>bereid als 10x voorraad, gebruikt bij 1x; zie wormbook.org voor protocol</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>verschillende</td><td>verschillende</td><td>zie wormbook.org voor protocol</td></tr><tr><td>26.5 Gauge Naald</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>Naalden gebruikt voor dissectie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>50ml Oak ridge centrifugebuis gebruikt voor synchronisatie</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas om Monster te Bevriezen</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm, No. 1</td></tr><tr><td>Dekglas om Dia te Verzegelden</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22mm, No. 1.5</td></tr><tr><td>DAPI Montage Medium voor Immunofluorescentie</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligase, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>Amplificatie rode buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x Amplificatie Rode buffer, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>Ligatie Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>Duolink 5x Ligatie buffer, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>Antilichaam Diluent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Duolink antilichaam diluent,Komt met DUO92004 en DUO92002, Opmerking: Een 1x PBS/1% BSA oplossing kan ook worden gebruikt als alternatief om het antilichaam te verdunnen.</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Duolink blokkeringsoplossing, Komt met DUO92004 en DUO92002</td></tr><tr><td>Montage Medium voor PLA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>Duolink In Situ montage medium met DAPI</td></tr><tr><td>MINUS Probe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situ Probe Anti-Muis MINUS</td></tr><tr><td>PLUS Probe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situ Probe Anti-Konijn PLUS</td></tr><tr><td>Wash Buffer A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink In Situ wash Buffer A</td></tr><tr><td>Wash Buffer B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink In Situ wash Buffer B</td></tr><tr><td>Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink Polymerase, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>Epifluorescente Microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G camera, DM5500B microscoop</td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>Gebruik bij 1:500</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>Gebruik bij 1:200</td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>Glas Pipet</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>ACROS Organics</td><td>187870100</td><td>Bereid een 250mM werkvoorraad</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Gebruik bij 1:1000 voor immunofluorescentie en PLA, pre-blokkeren met normaal geitenserum aanbevolen</td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>L.A. colors</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>Nematoden Groei Medium (NGM)</td><td>verschillende</td><td></td><td>Zie wormbook.org voor protocol</td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen Pasteur Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>Bereid als 0.1% voorraadoplossing in water, bewaard bij -20C, en verdund 1:100 in water om dia's te coaten</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>60 mm diameter</td></tr><tr><td>Konijn anti-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>Gebruik bij 1:200 voor immunofluorescentie, 1:4000 voor PLA</td></tr><tr><td>Dia's</td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>Driehoekige 14x14mm autoclaveerbare dia's met staven worden op maat besteld via Fisher Scientific. Poly-L-Lysine wordt in het lab toegevoegd aan dia's</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorietoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>task wipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>4.4x8.4 inch task wipes</td></tr><tr><td>Schalen (242x241x20mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>Gebruikt om vochtige kamer te maken</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazuiver water</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Ultrazuiver water verkregen van Milli-Q Integral Water Purification System</td></tr><tr><td>Waagschaal</td><td>Carolina Biological</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 stam E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitale Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lint</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematodenstammen gebruikt in deze studie (beide beschikbaar op aanvraag)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::d

in situ detectie van ribonucleoprotein complex assembly in de c. elegans germline met behulp van proximity ligation assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Begrijpen waar en wanneer eiwit-eiwit interacties (PPR's) optreden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfunctie in de cel en hoe bredere processen zoals ontwikkeling worden beïnvloed. De Caenorhabditis elegans kiembaan is een geweldig modelsysteem voor het bestuderen van PPR's die gerelateerd zijn aan de regulering van stamcellen, meiose en ontwikkeling. Er zijn een verscheidenheid van goed ontwikkelde technieken die het mogelijk maken eiwitten van belang te worden gelabeld voor erkenning door standaard antilichamen, waardoor dit systeem voordelig voor nabijheid ligatie assay (PLA) reacties. Als gevolg hiervan is het PLA in staat om effectiever aan te tonen waar PPR's op een ruimtelijke en tijdelijke manier voorkomen in kiemlijnen dan alternatieve benaderingen. Hier beschreven is een protocol voor de toepassing en kwantificering van deze technologie om PPR's te sonde in de C. elegans kiembaan.

Co-immunostaining van beide 3xFLAG::DLC-1; GFP en 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-kiemlijnen met FLAG- en GFP-antilichamen onthulden hun expressiepatronen in de kiembaan (figuur 3Aii-iii,3Bii-iii). Terwijl GFP werd uitgedrukt in de kiembaan (figuur 3Aiii), OMA-1::GFP expressie was beperkt tot de late pachytene en eicellen (Figuur 3Biii)27...

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Proximity ligatie test stelt gebruikers in staat om eiwit-eiwit interacties in situ te detecteren, onthullen ruimtelijke en temporele patronen van de interacties. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over regulering van C.elegans ontwikkeling. Deze techniek biedt een vergelijkbare gevoeligheid voor detectie van eiwit-eiwit interacties zonder de complexiteit van andere technieken, zoals FRET en BiFC.Individuen die nog nooit ontleed wormen om de nagels vrij te geven kunnen worstelen met deze stap. Oefen ontleden wormen, en gebruik ze voor immunofluorescentie om de behandeling en dissectie technieken te perfectioneren voordat u overgaat op PLA. Om te beginnen, kies 30 tot 40 jong volwassen wormen in een horloge glazen schotel met 500 microliter van 1x M9 en levamisole.Na het verzamelen van de wormen, zorgvuldig verwijderen en weggooien van de meeste van de media om bacteriën die wordt overgedragen samen met de wormen te verwijderen. Voeg verse 500 microliters van 1x M9 en levamisole toe en gebruik de pipet om de media voorzichtig op te stellen en af te geven om de wormen te spoelen. Verwijder en verwijder de meeste media voorzichtig.Herhaal de was twee tot drie keer. Na de wasbeurten, laat de wormen in ongeveer 100 microliter van de media voor niet langer dan acht minuten. Breng de wormen met behulp van een glas- of polyethyleenpipet over op een 25 millimeter-bij-75-millimeter microscoopdia bekleed met 001%poly-L-lysine.Verwijder de overtollige media, zodat ongeveer 15 microliter media op de dia blijft. Verwijdering van overtollige buffer is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de ontleed wormen en gonaden zal zich hechten aan de dia. Plaats onder een ontledende microscoop, met twee naalden van 26 1/2 meter, de ene naald over de andere, zodat de uiteinden een schaar vormen.Met behulp van de naalden georiënteerd op deze manier, snijd de wormen achter de keelholte om de kiemlijnen vrij te geven. Ontleed alle wormen binnen vijf minuten. Nadat alle wormen zijn ontleed, plaats voorzichtig een 22-millimeter-bij-40-millimeter coverslip over de dia, zodat het loodrecht op de dia.De uiteinden van de coverslip moeten van de glijbaan hangen. Vries de glijbanen op een voorgekoeld aluminiumblok dat minstens 20 minuten op droogijs wordt onderhouden. Plaats voorzichtig een gekoeld potlood op de coverlip om te voorkomen dat de coverslip los raakt als gevolg van ijsuitbreiding.Wanneer u klaar bent voor fixatie, veeg de coverslips met een potlood, en onmiddellijk duik de dia in een pot met verse, ijskoude methanol voor een minuut. Veeg vervolgens voorzichtig de randen van de dia rond het monster en breng 150 microliter formaldehyde fixatief aan bij kamertemperatuur om vijf minuten vast te stellen. Raak de schuif aan een papieren handdoek in een loodrechte hoek van 90 graden om de fixatieve run van de glijbaan te laten lopen en te absorberen in de papieren handdoek.Blokkeer de glijbanen twee keer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een Coplin pot met 50 milliliter PBT/BSA. Blokkeer vervolgens de glijbanen met een PBT/BSA-oplossing met 10% normaal geitenserum. Veeg voorzichtig de randen rondom de dia en breng 100 microliter van de oplossing aan op elke dia.En roer de glijbaan voorzichtig om de oplossing te verspreiden. Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Plaats de glijbaan op een papieren handdoek om de oplossing van de glijbaan te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af.Als u de dia's wilt blokkeren, past u één druppel van het blokkerende reagens toe op de ruimte van 14 millimeter bij 14 millimeter. Broed de glijbanen een uur lang uit bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Plaats de glijbanen op een papieren handdoek om het blokkeren van reagens van de glijbaan te laten lopen en veeg voorzichtig de randen af.Gebruik het antilichaamverwijdingsmluent om de primaire antilichamen te verdunnen. Breng 40 microliter van de verdunde primaire antilichaamoplossing per 14-bij-14-millimeter ruimte op de dia's aan. Plaats de glijbanen in een vochtige kamer, en broeden 's nachts op vier graden Celsius.In de ochtend, was de glijbanen twee keer gedurende vijf minuten, elk met 50 milliliter 1x wasbuffer A bij kamertemperatuur in een Coplin pot. Stel de Coplin-pot in op een orbitale shaker die is ingesteld op 60 rpm. Leg de glijbanen op een papieren handdoek om de wasbuffer van de glijbaan te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af.Bereid een 40-microliter oplossing met plus- en minsondes. Voeg de oplossing toe aan elke ruimte van 14 bij 14 millimeter. Broed de glijbanen een uur lang in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius.Was de glijbanen twee keer gedurende vijf minuten elk met 50 milliliter 1x wasbuffer A bij kamertemperatuur in een Coplin-pot. Stel de Coplin-pot in op een orbitale shaker die is ingesteld op 60 rpm. Verdun de ligatiebuffer één tot vijf met ultrazuiver water.Gebruik deze buffer om de ligase één tot 40 te verdunnen om een werkende voorraad ligatieoplossing voor te bereiden. Plaats de glijbaan op een papieren handdoek om de wasbuffer van de zijkanten te laten lopen en veeg de randen voorzichtig af. Voeg 40 microliter van de ligatieoplossing toe aan elke ruimte van 14 bij 14 millimeter.Broed de glijbanen in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na het wassen en drogen van de dia's zoals eerder beschreven, voeg 40 microliter vers bereide versterking oplossing, beschermd tegen licht, aan elke 14-bij-14-millimeter ruimte. Broed de glijbanen in de vochtige, donkere kamer gedurende een uur en 40 minuten bij 37 graden Celsius.Was de glijbanen twee keer gedurende 10 minuten elk met 50 milliliter 1x wasbuffer B, en was de dia's een keer gedurende een minuut met 50 milliliter 01x wasbuffer B.Na het drogen van de epoxy-gecoate omtrek van de dia, voeg 10 microliter van montagemedium aan elk monster, en leg voorzichtig een coverslip op de top, waardoor de montage medium verspreid. Verf rond de rand van coverslip met nagellak om de coverslip en schuif te verzegelen. Vermijd het verplaatsen van de coverslip.Laat de nagellak minstens 20 minuten uitharden bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Co-immunostaining van de kiemlijnen met FLAG en GFP antilichamen onthulden hun expressiepatroon in de kiembaan. Terwijl GFP werd uitgedrukt in de kiembaan, OMA-1:GFP expressie was beperkt tot de late pachytene en eicellen.FLAG immunostaining toont aan dat 3xFLAG:DLC-1 werd uitgedrukt in de kiembaan in beide stammen. Het gebied van belang voor PLA kwantificering in de kiembaan omvatte de late pachytene door de eicellen in alle kiemlijnen. Dit is de regio van OMA-1 expressie.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP kiemlijnen bleken een grotere hoeveelheid PLA foci te hebben in deze regio in vergelijking met de 3xFLAG:DLC-1, GFP kiemlijnen. Zorg ervoor dat er voldoende water is om de luchtvochtigheid in de kamer te verhogen. Zorg er ook voor dat dia's vlak zijn in de kamer om afvloeiing van reagentia te voorkomen.Na nabijheid ligatie test, kunnen de geëxtrudeerde klederen worden afgebeeld op een confocale microscoop en gekwantificeerd met behulp van Fiji, ImageJ workflow. Deze kwantificering kan helpen om te bepalen of de interactie statistisch significant is. PLA stelde ons in staat om in situ interacties tussen kritische regelgevers van nematode kiembaanontwikkeling te beoordelen.

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

This video demonstrates the visualization of protein-protein interactions at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) using Proximity Ligation Assay (PLA). After isolating the body walls, interacting proteins are probed with primary antibodies and PLA-conjugated secondary antibodies. The proximity of the interacting proteins facilitates the ligation of probes with connector oligonucleotides, forming circular DNA, which is then amplified by rolling circle amplification. Fluorescent probes...

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila Larvae Using a Proximity Ligation Assay

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

We presenteren een immunofluorescentie-imaging methode voor ruimtelijke en temporele lokalisatie van actieve ERK in de ontleed C. elegans gonade. De hier beschreven protocol kan worden aangepast voor visualisatie van elke signalering of structurele eiwit in het C. elegans gonade, mits een geschikt antilichaam reagens beschikbaar is.

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Leer de proximity ligation assay voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans germline. Deze methode onthult ruimtelijke en temporele patronen essentieel voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Meer video's verkennen