Name: Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Leer een in vivo fagocytose-assay om het fagocytische vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te evalueren. Deze methode kwantificeert fagocytische gebeurtenissen in individuele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health R03 AG061484-02 en het UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

<ol><li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+DNA%2FRNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).</li>
<li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+aging%3A+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li>
<li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li>
<li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+innate+immunosenescence%3A+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li>
<li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence%3A+emerging+challenges+for+an+ageing+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li>
<li>Min, K. -J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li>
<li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+a+fundamental+process+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li>
<li>Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+haemocyte-specific+protein%2C+hemolectin%2C+similar+to+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).</li>
<li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardin%2C+a+Drosophila+collagen%2C+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li>
<li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li>
<li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li>
<li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand%2C+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol is een betrouwbare manier om verschillende aspecten van fagocytose te kwantificeren, onder gecontroleerde experimentele omstandigheden. We merken op dat we deze procedure alleen hebben getest met gramnegatieve bacteriële deeltjes en dat de resultaten kunnen verschillen als grampositieve bacteriële deeltjes worden gebruikt. Inderdaad, het zou interessant zijn om de fagocytische reacties op zowel gram negatieve en gram positieve bacteriën in verschillende experimentele omstandigheden te vergelijken. Het gebruik van een nano-injector zorgt voor nauwkeurige controle over injectievolumes, zodat elke vlieg wordt geïnjecteerd met hetzelfde volume van deeltjes. Een beperking van het protocol komt van inconsistenties in deeltjespreparaten. Deeltjes zullen aggregeren eenmaal bevroren, dus kleine variaties in verdunningsvolumes, of gebrek aan vortexen, kan de deeltjesconcentratie tussen experimenten beïnvloeden. Om mogelijke variaties in deeltjesconcentraties tussen leeftijden te minimaliseren, is het nuttig om 1- en 5-weekse vliegen op dezelfde dag te injecteren, met dezelfde naald- en deeltjesoplossing. Een ander mogelijk nadeel is dat tijdens dissecties het dorsale vat en/of de cuticula gemakkelijk kunnen worden beschadigd als pinnen niet goed worden behandeld. Om te voorkomen dat het dorsale vat wordt verstoord, moet u het aantal pinnen dat per dissectie wordt gebruikt, minimaliseren. Het voordeel van deze dissectiemethode is dat alle fixatie-, was- en kleuringsstappen kunnen worden uitgevoerd in de dissectieplaat. Omdat de nagelriemen zijn vastgepind, voorkomt dit dat de nagelriemen tussen de treden verloren gaan.
In vergelijking met de bestaande methoden18,19,25,26,27,28,29heeft het beschreven protocol zijn voordelen en beperkingen. Door het dorsale vat te ontleden, zijn we in staat om individuele hemocyten op deze locatie te visualiseren en te kwantificeren. Dit maakt het mogelijk om subtiele variaties in fagocytische activiteit tussen experimentele groepen te detecteren. Andere methoden visualiseren fluorescerend gelabelde deeltjes door hemocyten te verzamelen met behulp van een Bleed/Scrape-test19,25,26,27, of via een intacte ventrale cuticula18,19,28,29; individuele hemocyten kunnen echter niet worden beoordeeld wanneer ze door de dorsale nagelriem worden gevisualiseerd. Het voordeel van dit protocol, in vergelijking met de Bleed / Scrape methode is dat onze methode stelt ons in staat om alleen die hemocyten geassocieerd met de dorsale vat te beoordelen, en houdt rekening met circulerende cellen of die langs de lichaamswand, die functioneel verschillend kan zijn. Ontleden van het dorsale vat verwijdert ook de noodzaak om een tweede ronde van injecties met een fluorescentie quencher, zoals Trypan blauw19,26. Dit komt omdat alle deeltjes die niet gebonden zijn aan of overspoeld door een cel zullen worden weggespoeld tijdens wasstappen. Omgekeerd kunnen alternatieve methoden gemakkelijker uit te voeren zijn omdat ze geen dissecties vereisen. Hoewel het ontleden van het dorsale vat gemakkelijk te leren is, voegt deze stap een niveau van complexiteit toe dat mogelijk niet haalbaar is in sommige experimentele ontwerpen.
Hoewel het beschreven gebruik van deze in vivo fagocytosetest is om fagocytische gebeurtenissen tussen verschillende leeftijden te beoordelen en te kwantificeren, is dit protocol zeer aanpasbaar en kan het worden gebruikt om verschillende aspecten van fagocytose tussen genotype, geslacht of weefseltype te analyseren. Omdat fagocytose van centraal belang is voor de meeste meercellige dieren, kan het begrijpen hoe dit proces afneemt met de leeftijd leiden tot betere therapeutische behandelingen voor de vergrijzende bevolking. Deze aanpak biedt op lange termijn potentieel voor het ophelderen van aspecten van leeftijdsgebonden veranderingen in de immuunrespons, met speciale aandacht voor fagocytose.

Het aangeboren immuunsysteem, dat bestaat uit fysieke en chemische barrières voor infectie en cellulaire componenten, is evolutionair bewaard over meercellige organismen1,2. Als eerste verdedigingslinie speelt het aangeboren immuunsysteem een cruciale rol bij de bestrijding van binnenvallende ziekteverwekkers bij alle dieren1,2,3. De componenten van de aangeboren immuunrespons omvatten een breed scala aan celtypen die worden ingedeeld op basis van het feit dat ze specificiteit en immunologisch geheugen2,3,4missen . Bij mensen omvatten deze celtypen fagocytische monocyten en macrofagen, neutrofielen en cytotoxische natuurlijke killercellen4,5. Hoewel het hebben van een functioneel immuunsysteem noodzakelijk is voor de overleving van de gastheer, is het duidelijk dat de functie van immuuncellen afneemt met de leeftijd, een fenomeen dat bekend staat als immunosenescentie5,6. In staat zijn om leeftijdsgebonden veranderingen in de immuunrespons te beoordelen, inclusief verschillende aspecten van het proces van fagocytose, zou kunnen helpen bij ons begrip van immunosenescentie. De procedure die we hier beschrijven biedt een effectieve en herhaalbare aanpak om fagocytische voorvallen te evalueren en te kwantificeren door hemocyten in Drosophila melanogaster.
Drosophila is een ideaal model voor het bestuderen van de immuunrespons om vele redenen. Voor een, er is een uitgebreide set van genetische instrumenten beschikbaar die het mogelijk maken om gemakkelijk te manipuleren genexpressie in een weefsel-afhankelijke manier7. Deze tools omvatten een verzameling mutanten, RNA interferentie voorraden, GAL4 / UAS voorraden, en de Drosophila Genetic Reference Panel dat 205 verschillende inteelt lijnen bevat waarvoor de gehele genomen sequenties zijn gecatalogiseerd8. De korte levenscyclus van Drosophila en het grote aantal geproduceerde individuen stellen onderzoekers in staat om meerdere individuen te testen in een gecontroleerde omgeving, in een korte periode van tijd. Dit verbetert sterk het vermogen om subtiele verschillen in immuunrespons op infectie bij genotypen, tussen geslachten of over leeftijden te identificeren. Belangrijk is dat veel genetische componenten en functies van de aangeboren immuunrespons, waaronder fagocytose, evolutionair worden bewaard tussen Drosophila en zoogdieren1,2.
In Drosophila wordt het proces van fagocytose dat volgt op infectie uitgevoerd door fagocytische hemocyten genaamd plasmatocyten, die gelijkwaardig zijn aan macrofagen van zoogdieren9. Hemocyten zijn essentieel voor het herkennen van een breed scala aan deeltjes en het opruimen van microbiële pathogenen9,10,11,12,13. Deze cellen drukken een verscheidenheid aan receptoren uit die zich moeten onderscheiden van niet-zelf en signaleringsgebeurtenissen moeten initiëren die nodig zijn om het fagocytische proces uit te voeren10,11,12,13,14,15. Zodra een deeltje is gebonden, begint het te worden geïnternaliseerd door reorganisatie van de actine cytoskelet en remodelleren van het plasmamembraan uit te breiden rond het deeltje, de vorming van een fagocytische beker11,12,13,14. Tijdens dit proces, een andere set van signalen vertelt de cel om het deeltje verder te internaliseren door het sluiten van de fagocytische beker, de vorming van een membraan-gebonden fagosoom11,12,13,14,15. Het fagosoom ondergaat vervolgens een rijpingsproces, dat zich vergezelt met verschillende eiwitten en fuseert met lysosomen, waardoor een zure fagolyssom zos is11,12,13,14,15. Op dit punt kunnen deeltjes efficiënt worden afgebroken en geëlimineerd11,12,13,14,15. Drosophila studies hebben aangetoond dat oudere vliegen (4 weken oud) hebben een verminderd vermogen om een infectie te wissen in vergelijking met jongere vliegen (1 weken oud), waarschijnlijk te wijten, althans gedeeltelijk, aan een daling in sommige aspecten van fagocytose16,17.
De hier beschreven methode maakt gebruik van twee afzonderlijke fluorescerende e. coli-deeltjes met fluoresceren, een met een standaard fluorofofore en een die pH-gevoelig is, om twee verschillende aspecten van fagocytose te beoordelen: de eerste engulfment van deeltjes en de afbraak van deeltjes in het fagosomale. In deze test is fluordeeltjesfluorescentie waarneembaar wanneer de deeltjes gebonden en overspoeld worden door hemocyten, terwijl pH-gevoelige deeltjes alleen fluoresceren in de lage pH-omstandigheden van het fagosoom. Fluorescerende gebeurtenissen kunnen dan worden waargenomen in hemocyten die langs het dorsale vat lokaliseren. We richten ons op hemocyten gelokaliseerd op het dorsale vat, die een anatomisch oriëntatiepunt bieden om hemocyten te lokaliseren waarvan bekend is dat ze bijdragen aan bacteriële klaring, en om ze consequent te isoleren. Echter, hemocyten in andere delen van het lichaam en de hemolymph zijn ook belangrijk voor de klaring. Hoewel we deze celpopulatie niet hebben bestudeerd, kan onze algemene procedure ook van toepassing zijn op fagocytische testen van deze cellen. Een voordeel van onze aanpak is dat we fagocytische gebeurtenissen binnen individuele hemocyten kunnen kwantificeren, waardoor we subtiele variatie in fagocytische processen kunnen detecteren. Andere studies die fluorescerende gebeurtenissen visualiseren door middel van de cuticula18,19 niet goed voor verschillen in het aantal aanwezige hemocyten, die vooral belangrijk is om te overwegen in ons geval als totale hemocyte telt zal naar verwachting veranderen met de leeftijdvan 17.

<table><tbody><tr><td>0.10 mm Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Hier: de pinnen worden doormidden gesneden en het scherpe uiteinde wordt gebruikt</td></tr><tr><td>1 mL steriele spuiten</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Gevuld met minerale olie om de naald te laden</td></tr><tr><td>15% Foetaal Rundserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>voor dissectiemedia</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>EM-kwaliteit, 4% werkoplossing, verdund in 1X PBS</td></tr><tr><td>1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Overdrachtpipet</td><td>Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>3.5" glazen capillairen</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td>1.14mm O.D X 3.5" lengte X 0.53" I.D</td></tr><tr><td>35x10 mm Petri-schalen</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td>Gebruikt als dissectieplaat, half gevuld met Sylgard</td></tr><tr><td>6x penicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>voor dissectiemedia</td></tr><tr><td>70% Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Analoge Vortexmixer</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Biologische punttang, Dumont Nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Verdund 1:1000 in 1x PBST</td></tr><tr><td>Drosophila-stam</td><td></td><td></td><td>w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 stam) BioParticles&trade;, Alexa Fluor&trade; 594 conjugaat</td><td>Life Technologies</td><td>E23370</td><td></td></tr><tr><td>Glazen objectglazen</td><td>Premiere</td><td>D17026102</td><td></td></tr><tr><td>Live cell imaging-oplossing</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>Voorkeursbuffer voor bereiding en verdunning van deeltjes</td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>Mpbio</td><td>194836</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II automatische nanoliter-injector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Smalle polystyreen Drosophila-vialen Super Bulk</td><td>Genesee</td><td>32-116SB</td><td>Grootte: 25 X 95 mm</td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td>Gebruikte snelheid: 20 rpm</td></tr><tr><td>pHrodo&trade; Red E. coli BioParticles&trade; Conjugaat voor fagocytose</td><td>Life Technologies</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila-celcultuurmedia (1x)</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>Dissectiemedia, combineer: Schneiders, FBS en pen/strep; filter steriliseren</td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>2mM (of 20%) werkoplossing</td></tr><tr><td>Springschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconen elastomeer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>Bereid volgens het verstrekte protocol</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Voor PBS + 0.1% tween</td></tr><tr><td>Verticale Pipet Puller Model 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td>812368</td><td>Verwarmer: 55? Solenoïde: 45</td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager.Z1 fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Hier: Apotome structureel interferentiesysteem met Zeiss Zen-beeldvormingssoftware</td></tr></tbody></table>

beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster hemocyten met behulp van een in vivo phagocytosis assay

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytose is een essentiële functie van de aangeboren immuunrespons. Dit proces wordt uitgevoerd door fagocytische hemocyten waarvan de primaire functie is om een breed scala aan deeltjes te herkennen en microbiële pathogenen te vernietigen. Naarmate organismen ouder worden, begint dit proces te dalen, maar er is weinig bekend over de onderliggende mechanismen of de genetische basis van immunosenscentie. Hier wordt een injectie gebaseerd op vivo fagocytosetest gebruikt om leeftijdsgerelateerde veranderingen in verschillende aspecten van fagocytose te beoordelen, zoals binding, engulfment en afbraak van geïnternaliseerde deeltjes, door phagocytische voorvallen in hemocyten bij volwassen Drosophila te Drosophila kwantificeren. Voor een, veel genetische componenten en functies van de aangeboren immuunrespons, met inbegrip van fagocytose, zijn evolutionair bewaard gebleven tussen Drosophila en zoogdieren. Daarom zijn de resultaten van het gebruik van dit protocol waarschijnlijk op grote schaal relevant voor het begrijpen van de leeftijdsgerelateerde veranderingen in de immuunfunctie in een verscheidenheid van organismen. Bovendien merken we op dat deze methode kwantitatieve schattingen van hemocyte fagocytische vermogen biedt, die nuttig kunnen zijn voor een verscheidenheid van onderzoeksonderwerpen, en hoeft niet te worden beperkt tot studies van veroudering.

Ter illustratie van de beschreven injectiemethoden toont figuur 1A de injectieplaats op Drosophila melanogaster, evenals hoe voedselkleurstof een visuele bevestiging mogelijk maakt dat de vlieg is geïnjecteerd(figuur 1B). De toevoeging van voedselkleurstof helpt ook bij de herkenning van een verstopte naald. Injecties kunnen worden uitgevoerd in de buik, maar houd de injectieplaats consistent over experimenten. Dit zal helpen bij het minimaliseren van mogelijke variaties tussen elk experiment.
Om de fluorescerende deeltjes in ingezeten hemocyten langs het rugvat te visualiseren, ontleedden we het dorsale vat en de bijgevoegde buikslijfbeen. Figuur 2A-F schetst de ontledingsmethoden.
Om het leeftijdsspecifieke vermogen van jonge en oude vliegen om fagocytose uit te voeren te beoordelen, worden hemocyten langs het dorsale vat gevisualiseerd met behulp van een fluorescerende microscoop. Om ervoor te zorgen dat alleen cellen langs het dorsale vat worden geteld, kunnen antilichamen of GFP-gelabelde genen voor bepaalde bloedcelmarkers of hartspecifiek collageen, zoals Hemese en Hemolectine, of Pericardin (figuur 3), respectievelijk22,23,24worden gebruikt . Fluorescerend gelabeld E. coli deeltjes zijn 1 mm lang, terwijl hemocyten zijn 10 mm in diameter17. Alleen fluorescerende gebeurtenissen binnen een diameter van 10 mm gecentreerd op een DAPI-positieve kern worden geteld(figuur 4). Om fluorescerende gebeurtenissen te kwantificeren, wordt ImageJ-software gebruikt(figuur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figuur 1: Injectieplaats en visuele verificatie. (A) Laterale zijde van thorax wordt doorboord met een getrokken capillaire naald. (B)Injecties worden visueel gecontroleerd door het toevoegen van groene kleurstof voor deeltjes aan deeltjesoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figuur 2: Dorsale vaartuigdissectie. (A) Pinnen worden geplaatst in de thorax en achterste buik (zwarte pijlen). (B-C) Twee horizontale insnijdingen (groene pijlen) worden gemaakt aan het achterste uiteinde van de buik(B), en voorste einde(C). (D) Een verticale incisie (groene pijl) wordt gemaakt in het midden van de buik, het aansluiten van de twee horizontale sneden. (E) Optionele pinnen (*) worden gebruikt om de buikholte te openen, waardoor inwendig weefsel wordt blootgesteld. (F) Inwendig weefsel (gewas, darmen, baarmoeder, eierstokken, vetlichamen) wordt verwijderd, waardoor het dorsale vat wordt blootgesteld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figuur 3: Ventrale weergave van een ontleed dorsale vat van een 5 weken oud vrouwtje geïnjecteerd met pH-gevoelige deeltjes, gekleurd met antilichaam gericht tegen Pericardin (A) . Gestippelde witte lijn schetst de zijdelingse kant van het rugvat, met pijl die naar het voorste gebied wijst. (B) Vergrote afbeelding van (A): clusters van hemocyten (blauwe pijl) die actief vernederende bacteriën waren, binnen de eerste aortakamer van het dorsale vat. (C) Vergrote afbeelding van (A) waarin de extracellulaire matrix (ECM) collageen-achtig eiwit, Pericardin (groene pijl), dat het dorsale vat op plaats24houdt . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figuur 4: Ontleed dorsale vat en bijbehorende hemocyten van een vrouwelijke vlieg geïnjecteerd met pH gevoelige deeltjes, of fluor-deeltjes. (A) Het dorsale vat en de bijbehorende hemocyten met verzwolgen pH-gevoelige E. coli-deeltjes (rood), of (E) fluor-geëtiketteerde E. coli-deeltjes (rood), geïsoleerd van een 1 weken oude vlieg, na het herstellen van 60 min. (B,F) Vergroot inzet van (A) en (E) (witte doos), respectievelijk, met twee individuele hemocyten met telbare gebeurtenissen. (C) Het dorsale vat en de bijbehorende hemocyten met verzwolgen pH-gevoelige E. coli-deeltjes(rood), of ( G)fluor-geëtiketteerde E. coli-deeltjes (rood), geïsoleerd van een 5 weken oude vlieg, na het herstellen van 60 min. (D,H) Vergroot inzet van (C) en (G) (witte doos), respectievelijk, met twee individuele hemocyten met telbare gebeurtenissen. Gestippelde witte lijn schetst de zijdelingse kant van het rugvat, met pijl die naar het voorste gebied wijst. Kernen bevlekt met DAPI (blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figuur 5: Het kwantificeren van fagocytische gebeurtenissen binnen een 10 mm hemocyten met behulp van de celteller in ImageJ. (A) Na het openen van afbeelding(en) in ImageJ kan het gereedschap Melding van de celteller worden gebruikt om fagocytische gebeurtenissen per cel bij te houden. (B)Dit gereedschap wijst een andere kleur toe aan elke cel die is geselecteerd om te worden geteld, waarbij elke stip overeenkomt met een fluorescerende gebeurtenis in die cel. Als u op 'alt+y' drukt, wordt een tabel weergegeven met het aantal gebeurtenissen dat per cel wordt geteld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Ons protocol biedt een effectieve en herhaalbare aanpak om fagocytische voorvallen in hemocyten te evalueren en te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we fagocytische gebeurtenissen binnen individuele hemocyten kunnen kwantificeren, waardoor we variaties in fagocytische processen tussen genotypes bij individuele vliegen kunnen detecteren. Het uitvoeren van dissecties kan een uitdaging zijn, dus bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer, oefen dissecties zoveel mogelijk voordat u de volledige procedure uitvoert.Begin met het voorbereiden van glazen naalden voor injectie. Vul een spuit van een millimeter met minerale olie en bevestig de 30-meter hypodermische naald die is voorzien van de nano-injector. Steek de 30-meter naald in het stompe uiteinde van een getrokken capillaire naald en vul deze met minerale olie.Verwijder langzaam de 30-meter naald om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden gevormd. Verwijder de collet en plaats de verzegelde O-ring met de inkeping naar boven. Plaats de grotere O-ring op de metalen zuiger en sluit de collet opnieuw aan zonder aan te spannen.Steek de metalen zuiger in het stompe uiteinde van de met olie gevulde glazen naald en duw hem voorzichtig naar beneden en plaats hem in de grotere O-ring. Draai vervolgens de collet vast tot ze veilig zijn. Na het vullen van de naald met fluor- of pH-gevoelige deeltjes, injecteer je de vliegen in de sternopleurale plaat van de thorax.De injectie is succesvol als de groene kleurstof gaat in de vlieg. Plaats de geïnjecteerde vliegen in een nieuw voedsel flesje vaststellend op de tijd dat de eerste en laatste vlieg werden geïnjecteerd. Leg de flacon op zijn kant totdat alle vliegen zijn hersteld om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in het voedsel.Oriënteer de fly ventrale kant omhoog onder een ontleden stereomicroscoop. Steek vervolgens een insectenspeld in de thorax en een andere door het meest achterste uiteinde van de buik in de buurt van de genitaliën. Zodra alle vliegen zijn vastgemaakt, gebruik maken van een transfer pipet om genoeg dissectie media toe te voegen aan de vliegen te dekken.Verwijder het hoofd met cuticula schaar, en maak een horizontale incisie direct boven de achterste pin in de buik, dan nog een op de meest voorste einde van de buik. Maak een verticale incisie die de twee horizontale insnijdingen verbindt die de buikholte zullen openen. Gebruik tangen om de inwendige organen en weefsel te verwijderen, om ervoor te zorgen dat het dorsale vat te vermijden.Gebruik indien nodig extra pinnen om de snijuiteinden van de cuticula vast te stellen. Verwijder vervolgens de thorax met de cuticula schaar. Gooi de dissectiemedia weg en vervang deze door een milliliter van 4%PFA, waardoor de dissecties zoveel mogelijk tegen licht worden beschermd.Bevestig de dissecties gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur terwijl u schommelt bij 20 tpm. Verwijder vervolgens de fixatieve en voeg een milliliter van 1X PBST. Bevlek desverzuim des voorkomendheden met antilichamen.Na het monteren van de nagelriemen op een microscoop dia, gebruik tangen te oriënteren ventrale kant omhoog, en zorg ervoor dat de dorsale schip zichtbaar is. Jonge en oude vliegen werden beoordeeld op leeftijdsspecifieke vermogen om fagocytose uit te voeren door fluorescerende beeldvorming van hemocyten langs het dorsale vat. Een antilichaam tegen pericardine werd gebruikt om ervoor te zorgen dat alleen cellen langs het rugvat werden geteld.Aangezien fluorescerend gelabelde E.coli-deeltjes één micrometer lang zijn en hemocyten 10 micrometer in diameter hebben, werden alleen fluorescerende gebeurtenissen binnen een diameter van 10 micrometer, gecentreerd op een DAPI-positieve kern geteld. ImageJ-software werd vervolgens gebruikt om de gebeurtenissen te kwantificeren. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te visualiseren dat de vlieg daadwerkelijk werd geïnjecteerd en om te onthouden dat de timing is van cruciaal belang.Het tijdig invullen van injecties en dissecties zal helpen bij het minimaliseren van experimentele fouten en mogelijke variaties in fagocytische snelheid. Deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om een verscheidenheid van onderzoeksonderwerpen te verkennen, waaronder vragen met betrekking tot cellulaire immuniteit, verschillende populaties van bloedcellen of het onderscheiden van fagocytose van AMP-productie tijdens een succesvolle immuunrespons.

assessing-age-specific-phagocytic-ability-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.

Cuticula disruptie: een methode om hemolymph te verzamelen van Drosophila larven

This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Drosophila bloedcellen, of hemocyten, circuleren tussen residente locaties en circulatie.  In de larve lokaliseren residente (sessile) hemocyten zich in inductief micro-omgevingen, de hematopoietische zakken, terwijl circulerende hemocyten vrij bewegen in de hemolymf. Het doel van dit protocol is de gestandaardiseerde isolatie en kwantificering van deze twee, gedragsmatig verschillende maar onderling uitwisselbare, hemocytpopulaties.

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Leer een in vivo fagocytose-assay om het fagocytische vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te evalueren. Deze methode kwantificeert fagocytische gebeurtenissen in individuele cellen.

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Meer video's verkennen