Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

Dit protocol maakt het mogelijk om mogelijke morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels te evalueren die neurochemische en gedragsafwijkingen kunnen onderstrepen. Het is uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructie software onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan neurocognitieve disfunctie te verduidelijken. Begin met het voorbereiden van PVP-oplossing volgens manuscriptaanwijzingen.

Vul de slang met PVP en laat het gedurende 20 minuten. En verdrijving het door het andere uiteinde met een 10 milliliter spuit. Combineer 170 milligram wolfraam microcarrier kralen met 250 microliter van methyleenchloride.

Dan grondig vortex de schorsing. Voeg vervolgens 6 milligram lipofiele DilC18(3)kleurstof toe aan 300 microliter methyleenchloride en vortex. Pipet 250 microliters van de wolfraam kraal schorsing op een glazen glijbaan.

Wacht tot de ophanging aan de lucht droog en voeg 300 microliter van de kleurstof oplossing. Eenmaal gedroogd, gebruik dan een scheermes om het mengsel te splitsen in twee 1,5 milliliter centrifuge buizen en vul de buizen met water. Sonicate het mengsel in een waterbad tot homogeen.

Zorg ervoor dat de sonicator tip direct op de buizen ligt. Combineer de twee mengsels in een 15 milliliter conische buis. En sonicate voor nog eens drie minuten, ervoor te zorgen dat er geen grote bosjes verf gecoate kralen blijven.

Na sonicatie, trek het mengsel in de PVP gecoate slang met een 10 milliliter spuit. En voer de slang in het voorbereidingsstation. Draai de slang gedurende een minuut.

Verwijder voorzichtig al het water met behulp van een spuit. Zet het stikstofgas aan en pas de stikstofstroom aan op ongeveer 0,5 liter per minuut. Draai de slang in het bereidingsstation en droog deze 30 minuten met stikstof.

Haal de slang van het station en snijd deze in 13 millimeter segmenten met een buizensnijder. Zorg ervoor dat de rat niet reageert op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn. Zet het dan vast in de supine positie.

Maak een incisie langs de thoracale middellijn. Scheid het middenrif en open de kist met een schaar. Steek vervolgens een 20-meterige naald van 25 millimeter in de linker ventrikel.

Snijd onmiddellijk het rechteratrium met een schaar en doorsneed 15 milliliter 100 millimolar PBS met een stroomsnelheid van 5 millimeter per minuut. Dan doorsnede 100 milliliter van 4%PFA gebufferd in PBS. Na perfusie, verwijder de hele rat hersenen.

En postfix het met 4% PFA gedurende 10 minuten. Gebruik een rat hersenen matrix te snijden 500 micrometer dikke coronale sectie. Maak een vuist snijden en houd het mes op zijn plaats.

Maak vervolgens een tweede snede met een tweede mes en verwijder verticaal het eerste mes, waardoor het weefsel op het bladoppervlak blijft. Plaats de hersenen plakjes in de 24-put plaat met 1 milliliter PBS in elke put. En herhaal het proces totdat alle plakjes zijn gesneden.

Verwijder PBS van elke gerichte goed. Laad het kraakbeen met een stuk Dil/wolfraambuizen en plaats het in de applicator. Plaats een stukje filterpapier tussen de twee mesh-schermen.

En sluit de applicator aan op de heliumslang. Pas vervolgens de uitgangsdruk van helium aan tot 90 pond per vierkante inch. Plaats de applicator verticaal op het midden van de beoogde put 1,5 centimeter tussen het monster en het mesh-scherm.

Vuur dan de Dil/wolfraambuizen af. Laad het kraakbeen met de volgende slang en continu vuur de kralen uit de slang op de resterende plakjes. Vul de 24-well plaat met 100 millimolar PBS.

En was de plakjes drie keer met 500 microliter verse PBS. Zorg ervoor dat de plakjes niet omdraaien tijdens het wassen. Voeg 500 microliter verse PBS toe aan de plakjes.

En broed ze drie uur lang uit op vier graden Celsius in het donker. Gebruik na de incubatie een fijne borstel om de hersenschijfjes over te zetten op glazen dia's. En voeg onmiddellijk een milliliter antifade montage medium aan elke sectie.

Plaats een 22 bij 15 millimeter coverslip over de secties en droog de dia's in het donker. Zet het confocale microscoopsysteem aan en schakel over naar een 60X-doelstelling. Pas de beeldvormingsinstellingen aan op basis van de handschriftaanwijzing.

En het verkrijgen van Z-stack beelden voor de beoogde neuron type op basis van hersenen regio grenzen en morfologische kenmerken van neuronen. Isoleer primaire corticale neuron van F344/N ratten op postnatale dag een en cultuur ze in een 35 millimeter glazen bodem schotel voor een week. Verfrissende helft van het medium op de derde dag na isolatie.

Was de schotel twee maal met 1 milliliter 100 millimolar PBS. En bevestig de cellen met 4%PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Ballistically etiket de cellen zoals eerder beschreven.

En was ze nog drie keer met 1 milliliter PBS. Voeg 500 microliter PBS toe aan de cellen en broed ze drie uur lang uit bij vier graden Celsius in het donker. Voeg vervolgens 200 microliter antifade montagemedium toe.

En het verkrijgen van Z-stack beelden voor elk gericht neuron. Typische piramidale neuronen in hippocampal regio in de rat hersensecties werden geïdentificeerd met ballistische etikettering technologie gekenmerkt door een grote apicale dendriet en een aantal kleinere basale dendrieten rond de soma. Neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software werd gebruikt om dendritische takken te traceren en stekels te detecteren.

Vervolgens werd de software gebruikt om de dendritische vertakkingscomplexiteit en neuronale arbor complexiteit te beoordelen. Morfologische veranderingen in dendritische stekels werden beoordeeld met behulp van lengte, volume en hoofddiameter. Vervolgens werden stekels ingedeeld in dunne, stompe, en paddestoel stekels.

En de relatieve frequentie van het aantal stekels tussen elke straal werd onderzocht. Verder werd de ballistische etiketteringstechniek gevalideerd op een primair piramidale neuron in celcultuur. Piramidale neuronen werden geïdentificeerd op basis van de driehoekvorm van de soma en grote apicale dendriet.

Vervolgens werd neuronale reconstructie software gebruikt om de verdeling van dunne dendritische stekels en dendritische wervelkolom lengte te analyseren. Bij een poging dit protocol, is het belangrijk om te voorkomen dat grote klonten of clusters van ballistische kleurstof gecoate wolfraam kralen beginnen voorbereiding. Klontjes zou niet toestaan dat individuele neuronen worden onderscheiden.

In combinatie met neuronale reconstructie software deze methode stelt ons in staat om neuronale en dendritische wervelkolom morfologie te onderzoeken in hippocampal piramidale neuronen. Neuronale reconstructie software gebruik maken van een algoritme om automatisch ondersteunde classificatie van dendritische stekels te bieden. De kwantificering van meerdere neuronale parameters biedt een kans om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neuronale cognitieve disfunctie beter te begrijpen.