Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel
6 mei 2020
Het huidige protocol stelt een rigoureuze en reproduceerbare methode voor kwantificering van morfologische gewrichtsveranderingen die gepaard gaan met artrose. Toepassing van dit protocol kan waardevol zijn bij het monitoren van ziekteprogressie en het evalueren van therapeutische interventies bij artrose.
Ons protocol gaat in op een onvervulde behoefte aan een robuuste en reproduceerbare methode voor kwantitatieve analyse van gewrichtsveranderingen in de ontwikkeling en progressie van artrose. Onze techniek schetst specifieke en reproduceerbare parameters voor de kwantitatieve analyse van veranderingen in meerdere gewrichtsweefsels bij artrose. Aangezien deze techniek zorgt voor kwantitatieve analyse van artrose, kan het worden gebruikt om de effecten van specifieke behandelingen op meerdere gewrichtsweefsels te vergelijken om hun therapeutische werkzaamheid te evalueren.
Ons protocol kan ook worden toegepast op andere artrose modellen of gebieden van bewegingsapparaat onderzoek waarin kwantificering van kraakbeen en bot nodig is. Hoewel het systeem eenvoudig en intuïtief is, zijn trainingssessies nog steeds nodig om het verkrijgen van metingen op een herhaalde manier te oefenen om reproduceerbaarheid te bereiken. Vengadeshprabhu Karuppagounder, een postdoctoraal geleerde uit ons laboratorium zal nu onze procedure demonstreren.
Begin met het inschakelen van de microscoop, camera, computer en touchscreen monitor. Selecteer de doelstelling 4X en klik op het softwarepictogram om het softwareprogramma te starten. Plaats de dia op het microscoopstadium en centreer het monster in het meetvenster, zodat het meetraster op de juiste vergroting is ingesteld om aan de doelstelling te voldoen, omdat zowel het scheenbeen- als het dijbeengewrichtsoppervlak en het scheenbeen subchondrale bot in de beeldgebieden van belang zijn opgenomen.
Selecteer vervolgens onder het menu Bestand de optie Leesinstellingen. Selecteer in het venster Instellingen het juiste instellingenbestand voor de te meten parameters. Om het totale kraakbeengebied te meten, selecteert u de Tib TC-functie en traceert u langs de superieure rand van het scheenbeenoppervlak waar het kraakbeen de gewrichtsruimte en langs de chondro-osseous-kruising ontmoet waar verkalkt kraakbeen het subchondrale bot ontmoet.
Om het verkalkte kraakbeengebied te meten, selecteert u de Tib CC-functie en traceert u een lijn langs het getijmerk, een natuurlijk voorkomende lijn die de verkalkte en niet-gecalceerde kraakbeengebieden scheidt en langs de chondro-osseous-kruising waar het verkalkte kraakbeen het subchondrale bot ontmoet. Om het niet-gecalcificeerde kraakbeengebied te bepalen, trekt u het verkalkte kraakbeengebied af van het totale kraakbeengebied. Om het chondrocyte-getal te bepalen, maakt u afzonderlijke telfuncties binnen de instellingen in de histomorphometry-software om de matrixproducerende en matrix niet-producerende chondrocyten te onderscheiden.
Gebruik vervolgens de stylus om een kleine stip te maken over elke chondrocyte die het opgegeven fenotype uitdrukt om het aantal matrixen te bepalen dat al dan niet chondrocyten produceert. Om de totale scheenbeen articulaire oppervlakteparameter te meten, traceer een lijn over het oppervlak van het scheenbeen om de individuele fibrillaties zorgvuldig te definiëren. Teken vervolgens een tweede lijn langs het getijmarkering om te dienen als een interne controle voor het vlak van elke sectie en verdeel de scheeniële articulaire oppervlakteparameter door de parameter getijmarkering om de cibial articulaire illusbrilleringsindex te berekenen.
Als u het subchondrale mergruimtegebied wilt meten, selecteert u de functie Merggebied. Teken vervolgens lijnen rond de parameter van deze gebieden om het totale gebied van beenmergruimte binnen het scheenbeen subchondrale bot te bepalen. Om het totale subchondrale gebied te meten, selecteert u de subchondrale botfunctie en schetst u het gebied tussen de chondro-osseous-verbinding in de superieure rand van de groeiplaat die zich zijdelings uitstrekt tot de gebieden van de voorste en achterste osteofyten.
Trek vervolgens het subchondrale beenmergoppervlak af van het totale subchondrale gebied om het subchondrale botgebied te berekenen. Om het osteofytgebied te meten, selecteert u de voorste osteofytenfunctie en traceert u de voorste osteofyt van het proximale scheenbeen. Selecteer vervolgens achterste osteofyt en traceer de achterste osteofyt van het proximale scheenbeen.
Om de voorste dijbeensynoviale dikte te meten, klikt u op Anterior Femur Synovium Meniscus en trekt u één lijn van de binneninbrengende punt van het voorste synovium op het dijbeen naar het bevestigingspunt op de meniscus en één regel van de buitenste invoeging van het synovium op het dijbeen naar de bevestiging aan de meniscus. Verdeel vervolgens het totale synoviale gebied door de synoviale parameter om de synoviale dikte te berekenen. DMM geïnduceerde artrose resulteert in een verhoogde Artrose Research Society International score in vergelijking met sham muizen.
Duidelijk gekenmerkt door oppervlakteerosie en kraakbeen verloren. Dit histomorphomemetrie protocol kan worden gebruikt om verschillende artrose geassocieerde veranderingen, waaronder een afname van het totale kraakbeen en niet-calcified kraakbeen gebieden op te sporen. Een vermindering van het totale chondrocyte aantal en nog belangrijker, een verlies in het aantal matrix producerende chondrocyten.
Veranderingen in het gewrichtsoppervlak, indicatief voor de ernst van erosie, worden ook waargenomen, waaronder een algehele toename van de fibrillatie-index. Artrose omvat ook een toename van het subchondrale botgebied en een vermindering van het gebied van de beenmergruimte in DMM-muizen die subchondrale botsclerose aangeven. Zowel de voorste en achterste osteofyten gebieden ook toegenomen in DMM muizen, wat suggereert een voortdurende subchondrale bot remodelleren dat fungeert als een compenserend mechanisme om veranderingen in de gezamenlijke belasting op de plaats van letsel te behandelen.
Histomorfometrische analyse van het synovium toont een toename van de synoviale dikte bij DMM muizen. Een typische uitkomst van artrose geassocieerd synoviale ontsteking en de verspreiding van inflammatoire cytokinen in de gewrichtsruimte. Bovendien wordt geen significante variabiliteit tussen de gebruikers waargenomen tussen de histomorfometrische analyse van het niet-gecalcificeerde kraakbeengebied in de Artrose Research Society International-score.
Na histomorfometrische analyse kunnen sequentiële dia's en immunofluorescentievlekken worden gebruikt om veranderingen in eiwitexpressie tussen monsters te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van morfologische veranderingen in gewrichten die geassocieerd zijn met artrose. Het is ontworpen om de progressie van de ziekte te monitoren en therapeutische interventies effectief te evalueren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Onderzoek naar artrose
- Analyse van geweefsel in gewrichten
- Evaluatie van therapeutische effectiviteit
Achtergrond
- Artrose wordt gekenmerkt door gewrichtsdegeneratie.
- Kwantitatieve analyse van gewichtsveranderingen is cruciaal voor het begrijpen van de ziekte.
- Bestaande methoden kunnen een gebrek aan reproduceerbaarheid vertonen.
- Dit protocol heeft tot doel dat gat te vullen met een gestandaardiseerde aanpak.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode vast te stellen voor de kwantificering van gewrichtsveranderingen.
- Om de monitoring van de progressie van artrose te faciliteren.
- Om de effecten van therapeutische interventies op gewrichtsweefsels te evalueren.
Gebruikte methoden
- Kwantitatieve analyse van meerdere geweefseltypen van het gewricht.
- Specifieke parameters voor het meten van veranderingen in kraakbeen en bot.
- Trainingssessies voor reproduceerbaarheid van metingen.
- Toepassing op diverse osteoarthritismodellen.
Belangrijkste resultaten
- Een betrouwbare methode gedemonstreerd voor het beoordelen van gewichtsveranderingen.
- Vergelijking van behandelingseffecten op gewevens van het gewricht mogelijk gemaakt.
- Een kader geboden dat toepasbaar is op ander onderzoek naar het bewegingsapparaat.
- Het belang van training voor de nauwkeurigheid van metingen aangetoond.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol instrument voor onderzoek naar artrose.
- Het ondersteunt de evaluatie van de therapeutische effectiviteit.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere gebieden van onderzoek naar het bewegingsapparaat.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve histomorfometrische evaluatie voorziet in de kritieke behoefte aan een reproduceerbare, objectieve beoordeling van artrosepathologie in preklinische modellen. Door de subjectiviteit die inherent is aan semikwantitatieve scoringssystemen te verminderen, verhoogt deze benadering het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets en de evaluatie van therapeutische effectiviteit. Het ondersteunt datagedreven go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase door een sensitieve detectie van subtiele structurele veranderingen in het kraakbeen, het bot en het synovium mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van kwantitatieve meting van kraakbeendegeneratie en remodellering van het subchondrale bot.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare parameters voor het beoordelen van target engagement in meerdere geweves van het gewricht.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicovermindering door vroege veranderingen in het aantal matrix-producerende chondrocyten en fibrillatie van het gewrichtsoppervlak te detecteren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor het kraakbeenoppervlak, de ratio tussen verkalkt en niet-verkalkt kraakbeen en de vorming van osteofyten.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van de assay door gedefinieerde traceerprotocollen en interne controles zoals de getijdenlijn (tide mark).
- Schaalbaarheid: Maakt toepassing over verschillende modellen heen mogelijk voor andere systemen van artrose waarbij kwantificatie van kraakbeen en bot vereist is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt structurele eindpunten met ziekterelevantie door toenames in synoviale dikte en subchondrale botverharding vast te leggen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt preklinische besluitvorming door het osteofytareaal te kwantificeren als biomarker voor compensatoire remodellering.
- Mechanistisch inzicht: Maakt correlatie van histomorfometrische veranderingen met downstream immunofluorescentiekleuring voor eiwitexpressieanalyse mogelijk.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, door kwantitatieve read-outs op weefselniveau te leveren die bijdragen aan beoordelingen van de therapeutische effectiviteit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen via de meting van kraakbeenverlies, verschuivingen in het chondrocytenfenotype en synoviale ontsteking.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde tracering van het tibiale kraakbeen, het subchondrale bot en de grenzen van osteofyten.
- Analytiek: Maakt vergelijkende analyse mogelijk via afgeleide indices, zoals de fibrillatie-index van het tibiale gewrichtsoppervlak en berekeningen van de synoviale dikte.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door structurele veranderingen te kwantificeren die voorspellend zijn voor functionele gewrichtsachteruitgang.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Functioneert als een herbruikbaar histomorfometrieplatform dat toepasbaar is op diverse modellen van musculoskeletale aandoeningen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door de inter-gebruikersvariabiliteit in kraakbeengebietsmetingen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door semiautomatische software en gestandaardiseerde instellingsbestanden.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van ineffectieve verbindingen mogelijk te maken via gevoelige structurele eindpunten.
- Impact op portfolio: Informeert risicogebaseerde prioritering via kwantificeerbare veranderingen in osteofyten en subchondraal bot.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist training in histomorfometrie-software om een consistente tracering van weefselgrenzen te bereiken.
- Afhankelijk van de infrastructuur van de microscoop, camera, computer en het touchscreen voor beeldacquisitie.
- Maakt standaardisatie van instellingsbestanden tussen gebruikers en laboratoria noodzakelijk voor vergelijkbaarheid tussen studies.
- Omvat aanpassingsfactoren bij het toepassen van parameters op verschillende gewrichtsregio's of osteoarthritis-modellen.
- Beperkt door de noodzaak van handmatige tracering, ondanks ondersteuning door semiautomatische software.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Histomorphometric Analysis Setup
1:59
Total, Calcified, and Uncalcified Cartilage Area Measurements
2:47
Chondrocyte Number and Phenotype Evaluation
3:17
Tibial Articular Surface Perimeter Measurement
3:47
Subchondral Bone and Marrow Space Area Measurement
4:30
Anterior and Posterior Osteophyte Area and Synovial Thickness Measurement
5:21
Results: Representative Histomorphometric Osteoarthritis (OA) Evaluation in Destabilization of the Medial Meniscus (DMM) and Sham Mice
7:06
Conclusion
