Name: Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Leer een verbeterde nierorganoïde-cultuurmethode met CAM-vascularisatie voor ontwikkelingsbiologie. Dit protocol verhoogt de overleving van nieranlagen en maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de Suomen Akatemia (Academie van Finland) (206038, 121647, 250900, 260056; Centre of Excellence grant 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finse Kidney and Liver Association, de Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, The Swedish Cultural Foundation in Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (KP7/2007-2013; grant FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) en H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENTRACTALALAL" Project ID 642937. De auteurs danken Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias en Hannele Härkman voor technische bijstand.
Figuren 3, 4 en Film 2 worden herdrukt met toestemming van Development.

De verzorging en procedures van dieren waren in overeenstemming met de Finse nationale wetgeving voor het gebruik van proefdieren, het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (ETS 123) en EU-Richtlijn 86/609/EEG.
1. Vervaardiging van minireservoirs voor de teelt van embryonale nieren van muizen en nierorganoïden op kipCAM en het opzetten van xenotransplantatie-experimenten
<ol><li>Gebruik transwell cel cultuur inserts ontworpen voor 6 goed of 12 goed platen. LET OP: Afhankelijk van het specifieke experiment kunnen grote of kleine minireservoirs worden gebruikt. Het beste is om kleine minireservoirs te gebruiken voor xenografting tot acht embryonale nieren of wanneer meerdere minireservoirs op hetzelfde kippenembryo worden geplaatst (bijvoorbeeld experiment- en controlemonsters op dezelfde kipCAM).</li>
	<li>Snijd de zijkanten van de wisselplaten met behulp van een roterende multitool met een cirkelzaagblad of een handzaag om een 2 mm hoge plastic ring te creëren met een doorlaatbaar membraan eraan bevestigd.</li>
	<li>Poets de randen van deze minireservoirs met een scalpel of een scherp mes.</li>
	<li>Steriliseer de minireservoirs in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Was de minireservoirs in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in een laminaire kap.</li>
	<li>Spoel de minireservoirs af in PBS en kweekmedium (hoogglucose DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine).</li>
	<li>Plaats het reservoir in een petrischaaltje, bovenop een druppel (600 μL/400 μL) van kweekmedium met het membraan naar boven gericht.</li>
	<li>Schik ontleed ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipet of een glazen capillaire buis. Vermijd het verlaten van veel vloeistof rond de nieren.</li>
	<li>Laat de monsters zich hechten aan het membraan voor 2-24 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. OPMERKING: Tot acht E11.5 embryonale muisnieren of nierorganoïden kunnen op de kleine insert worden gerangschikt. De grote wisselplaat wordt aanbevolen als grotere stukken embryonaal weefsel worden gebruikt voor xenotransplantatie of een celhydrogelmengsel op een groter gebied van de CAM.</li>
	<li>Neem 8-dagen oude ex ovo gekweekte embryonale kippen bereid volgens eerder gepubliceerde methoden uit de cel kweek incubator12,13.</li>
	<li>Breng de minireservoirs naar de CAM, zodat de grafts zijn gericht op de CAM, en het membraan overlays hen. Plaats de minireservoirs in de periferie van de CAM, zodat ze het kippenembryo niet bedekken. LET OP: Bij het gebruik van de kleinere minireservoirs vervaardigd uit transwell inserts voor 12 putplaten, kunnen maximaal drie minireservoirs op één CAM worden geplaatst.</li>
	<li>Voeg 500 μL (6 put insert) of 300 μL (12 put insert) van cultuurmedium toe aan de minireservoirs.</li>
	<li>Cultiveren van de monsters op kip CAM voor een maximum van 9 dagen. Vervang dagelijks het kweekmedium in de minireservoirs. OPMERKING: Vascularisatie van de monsters kan worden waargenomen zodra 24-48 uur na transplantatie.</li>
</ol>2. Fabricage van op maat ontworpen platen en het opzetten van FiZD-culturen
<ol><li>Boor gaten met een diameter van 20 mm in de bodem van een 6-putplaat. OPMERKING: Gebruik voor FiZD-experimenten 6 putplaten met een diepte van 16 mm (gespecificeerd in Tabel van materialen).</li>
	<li>Poets de velgen van de gaten (vooral aan de bovenzijde) met behulp van een elektrische boor met een countersink boor bit, een scalpel, of een scherp mes.</li>
	<li>Steriliseer de platen in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Was de platen in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in steriele omstandigheden.</li>
	<li>Grondig wassen 22 mm x 22 mm glas afdekkingen met 70% ethanol of reinig ze volgens het gepubliceerde protocol van Saarela et al.11.</li>
	<li>Lijm de coverslips aan de bovenkant van de gaten in 6 putplaten met behulp van een niet-toxische weefsellijm. Breng lijm rond het gat en plaats voorzichtig de coverslip om het te bedekken. Laat de lijm drogen.</li>
	<li>Inspecteer de platen onder een stereomicroscoop en verwijder overtollige gedroogde lijm van het oppervlak van de coverslips indien nodig. LET OP: Controleer of er geen lijm boven de coverslip om zelfs compressie van de monsters te garanderen.</li>
	<li>Meng polystyreenkralen (70 μm deeltjesgrootte) met een gelijk volume hydrogel. Een volume van 50-100 μL per put is voldoende. LET OP: Houd het mengsel van hydrogel en polystyreen kralen op ijs.</li>
	<li>Plaats een transwell insert onder een ontleden microscoop met het membraan omhoog.</li>
	<li>Schik de monsters (bijvoorbeeld ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden) gelijkmatig op het membraan.</li>
	<li>Voeg het hydrogel/polystyreenkraalmengsel voorzichtig naast de monsters toe om schade aan breekbare weefsels te voorkomen.</li>
	<li>Draai de transwell insert, zodat het membraan met de monsters gemonteerd op het naar beneden.</li>
	<li>Plaats de insert voorzichtig in een put van de aangepaste 6 putplaat en druk deze voorzichtig naar beneden zodat de monsters op het niveau van de kralen worden samengedrukt. LET OP: Volg de voortgang van de compressie met behulp van een microscoop.</li>
	<li>Houd de insert lichtjes met één hand op de put gedrukt en bevestig deze aan de plaat door plastic te smelten met een soldeerbout op drie punten aan de rand van de wisselplaat.</li>
	<li>Wanneer de wisselplaat aan de plaat is bevestigd, voegt u 2 mL kweekmedium (DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine) toe aan de put en blijft u de resterende putten in de plaat op dezelfde manier monteren.</li>
	<li>Breng de afgewerkte plaat over naar een incubator op het podium van een omgekeerde microscoop voor time-lapse imaging.</li>
	<li>Voer time-lapse beeldvorming van de monsters uit met behulp van geschikte experimentele instellingen. OPMERKING: Het veranderen van het kweekmedium in de putten van de plaat tijdens time-lapse experimenten is niet nodig, maar kan gemakkelijk worden gedaan door de gaten aan de zijkanten van de wisselplaat.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er worden twee gedetailleerde protocollen gepresenteerd die de klassieke nierorganotypic-kweekmethode verfijnen en vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en optimale 4D-beeldvorming (d.w.z. 3D-beeld en tijd) van ex vivo embryonale nieren en organoïden mogelijk maken. In deze sectie worden de kritieke stappen in de methoden belicht en worden probleemoplossingbesproken.
Het belangrijke verschil tussen andere CAM-kweekmethoden en deze verbeterde kipCAM-kweekmethode is het gebruik van op maat ge...

Organotypic cultuur van embryonale nieren werd een belangrijk model om nefrogenese decennia geleden te bestuderen1,2,3. Nierorganoïden vertegenwoordigen een geavanceerd modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling van gezonde en zieke nieren4. Het belangrijkste nadeel voor beide methoden is echter dat geen van beide methoden de belangrijkste functie van de nier recapituleert: bloedfiltratie. Nefrons en niervabulatuur ontwikkelen zich in nierorganoïden en organotypic culturen op dezelfde manier als vroege stadium in vivo ontwikkeling; echter, de glomeruli gevormd in vitro blijven avasculaire5. Vascularisatie van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden werd eerder in transplantatie-experimenten alleen onder in vivo omstandigheden aangetoond. Bijvoorbeeld, transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide nier-organoïden onder een muis niercapsule maakt de ontwikkeling van de nefron in de organoïde naar een functionele fase6.
Een tussenbenadering tussen zuiver in vitro culturen en in vivo transplantatiemethoden is xenotransplantatie naar de CAM van vogelembryo's. Vascularisatie van intacte muis nier primordia is eerder aangetoond met behulp van dit systeem7,8. Er werd echter ook aangetoond dat de niervasculatuur in de xenotransplanted murinenier was afgeleid van het gastheerendotheel, niet het transplantaat9. Deze observatie verminderde het potentieel van chimaerige (aviaire zoogdieren) modellen van embryonale nieren aanzienlijk om de ontwikkeling van de niervasculatuur te bestuderen, omdat de experimentele omstandigheden niet tolerant waren voor het overleven van donor-afgeleide endotheelcellen.
Gepresenteerd in het eerste deel van dit protocol is een verbeterde methode voor de teelt van muis embryonale nieren op CAM van vogeleieren, een combinatie van micromilieuomstandigheden van organotypic cultuur en xenotransplantatie. De belangrijkste verbetering ten opzichte van eerdere methoden is dat in plaats van het plaatsen van de muis embryonale nieren en nierorganoïden direct op de CAM, de implantatie gebied is bedekt met doorlatende minireservoirs gevuld met cultuur medium dat de getransplanteerde weefsel te leveren met voedingsstoffen en te beschermen tegen het drogen. Het slagingspercentage van de experimenten neemt aanzienlijk toe en de voorwaarden voor de ontwikkeling van vasculatuur van donoren verbeteren. Toepassing van deze methode op xenotransplant culturen resulteert in de ontwikkeling van glomeraire vasculatuur bestaat uit endogene endotheelcellen uit donornieren.
Gedetailleerde analyse van cellulaire morfogenese is een andere belangrijke toepassing van niercultuur modellen. Eerder gerapporteerde methoden voor time-lapse beeldverwerving van nierculturen zijn alleen voldoende voor analyse van de algehele morfologie en patronen van embryonale nieren, maar niet voor het bijhouden van individuele cellen10. Onlangs werd een nieuwe Fixed Z-Direction (FiZD) methode gericht op hoge resolutie confocale 3D time-lapse beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen beschreven11. Bij deze methode worden de organoïden en embryonale organen voorzichtig samengeperst tussen een glazen afdekkingsslip en een doorlaatbaar membraan van een transwellinsert in een op maat ontworpen plaat totdat de dikte van het monster 70 μm bereikt, wat optimale optische omstandigheden voor beeldvorming biedt. In het tweede deel van de methoden wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de fabricage van een op maat gemaakte plaat en de opstelling van FiZD-experimenten voor organoïde beeldvorming op lange termijn.

```html
<table><tbody><tr><td>Adjustable Spade Drill Bit</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>Voor het boren van gaten met een diameter van 20 mm</td></tr><tr><td>Automatic Egg Turner</td><td>OLBA B.V., Netherlands</td><td>AT-42</td><td>Voor het incuberen van eieren vóór ex ovo setup.</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Temperatuur ingesteld op 37&deg; C, 90% vochtigheid, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Chicken CAM-cultuur incubator. Temperatuur ingesteld op 37&deg; C, 90% vochtigheid, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cellstar 6-well Plate</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Putjes met een diepte van 16 mm om overeen te komen met de inserts</td></tr><tr><td>Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Voor 6-well platen. Poriegrootte van 40 &micro;m</td></tr><tr><td>Countersink Drill Bit</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Voor polijsten (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Disposable Glass Capillary Tube</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Drilling Machine</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Professional</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td>Hoge glucose</td></tr><tr><td>Egg Incubator Compact S84</td><td>Grumbach, Germany</td><td>8012</td><td>Voor het incuberen van eieren vóór ex ovo setup. Temperatuur ingesteld op 38&deg; C met relatieve vochtigheid ingesteld boven 60%</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized Eggs</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland</td><td></td><td>Hy-Line White en Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forceps DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Menzel-Gläser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoacryl Glue</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>On-stage Incubator</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, op maat gemaakt</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Wassen van de mini reservoirs.</td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Beads</td><td>Corpuscular</td><td>1000263-10</td><td>70 &micro;m in diameter</td></tr><tr><td>Rotary Multi Tool System</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>Verwarmde glazen capillair kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 &micro;m-pore Polystyrene Membrane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 &micro;m-pore Polystyrene Membrane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>
```

optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonale nier organotypic culturen, en vooral pluripotente stamcel-afgeleide nier organoïden, zijn uitstekende instrumenten voor het volgen van ontwikkelingsprocessen en modellering nierziekte. De modellen worden echter beperkt door een gebrek aan vascularisatie en functionaliteit. Om dit aan te pakken, werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de methode van xenografting cellen en weefsels aan het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo om vascularisatie en herstel van de bloedstroom te krijgen. De grafts zijn bedekt met op maat gemaakte minireservoirs die de monsters vast te stellen aan de CAM en hen te voorzien van cultuur medium dat de grafts beschermt tegen het drogen. De verbeterde cultuurmethode maakt het mogelijk xenografts tot 9 dagen te laten groeien. Het manuscript beschrijft ook hoe optimale omstandigheden te bieden voor langdurige confocale beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen met behulp van de eerder gepubliceerde Fixed Z-Direction (FiZD) methode. Deze methode comprimeert voorzichtig een embryonaal orgaan of organoïde tussen een glazen afdekking en membraan in een grote hoeveelheid medium en biedt uitstekende omstandigheden voor beeldvorming voor maximaal 12 dagen. Samen maken deze methoden vascularisatie en bloedtoevoer naar nierorganoïden en organotypic nierculturen mogelijk met verbeterde confocale beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn zeer gunstig voor het bestuderen van fundamentele en toegepaste functies van nieren ex vivo. Beide methoden zijn van toepassing op verschillende soorten weefsels en organoïden.

Het hier gepresenteerde CAM-cultuurprotocol maakte een zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk als gevolg van xenotransplantatie op kip CAM(figuur 1, film 1). Minireservoirs met kweekmedium leverden voedingsstoffen aan donorweefsel en beschermden het tegen het drogen gedurende de periode voorafgaand aan de juiste vascularisatie. Deze methode voorzag in tolerante voorwaarden voor donor-afgeleide endotheelcellen om te groeien. Daarom wer...

Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.

Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Nierorgaancultuur en organellen die zijn afgeleid van geprogrammeerde stamcellen bieden uitstekende manieren om mechanismen achter nierontwikkeling en -ziekte te bestuderen. Het huidige orgaancultuursysteem zorgt echter niet voor een bloedtoevoer naar de nier. Als gevolg van deze reden zijn de huidige modellen onvolledig en slagen er niet in om de belangrijkste functie van de nier samen te vatten, namelijk bloedfiltratie.In deze publicatie presenteren we een verbeterd protocol voor de teelt en visualisatie van embryonieren en organoïden op het chorioallantoïsche membraan van kippenembryo. In onze nieuwe experimentele set-up bedekken we de nierbeginselen die op CAM zijn getransplanteerd met doorlatende betekenis reservoirs die gevuld zijn met cultuurmedium. Dit protocol verhoogt aanzienlijk de overleving van nier rudiments en ook de intrinsieke endotheelcellen.De methode maakt de bloedtoevoer naar de zich ontwikkelende glomerulus. Onlangs publiceerden we ook een nieuwe vaste set richting orgelcultuur methode die hoge resolutie confocale 3D time-lapse imaging biedt. De methode voorzag in optimale omstandigheden voor confocale beeldvorming op lange termijn van de organoïden en orgaan rudiments.In de aanpak comprimeren we het weefsel voorzichtig tussen een glazen afdekbrief en een doorlaatbaar membraan. Hier laten we zien hoe de op maat ontworpen platen worden gemaakt en hoe de cultuurexperimenten worden opgezet. Zo presenteren we in deze publicatie een verbeterde nierorgelslangcultuurtechniek.Deze methode biedt een betere manier om organelle genesis model en voeren hoge resolutie beeldvorming om embryonale nieren en nierorganoïden ex vivo studie. Afhankelijk van uw experiment nemen overdracht cel contra-inserts ontworpen voor zes-put of 12-well platen. Snijd de zijkanten van de wisselplaat met behulp van een Dremel gereedschap om een twee millimeter hoge plastic ring te maken met een doorlaatbaar membraan eraan vast.Poets de randen van de ring van swarf met een scalpel of een scherp mes. Steriliseer de minireservoirs minstens een uur in 70%ethanol. Was vervolgens de minireservoirs in autoclave door gedestilleerd water en droog ze in een laminaire kap.Spoel de minireservoirs af in PBS en cultuurmedium. Plaats het reservoir op een petrischaaltje bovenop ons valmedium met het membraan naar boven gericht. Schik ontleed ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden op het membraan.Vermijd het verlaten van veel vloeistof rond de monsters en laat ze bevestigd van twee tot 24 uur in een cel cultuur incubator. Exenal transplantatie wordt gedaan om het chorioallantoïsche membraan van acht dagen oude ex ovo embryonale kip. Breng de minireservoirs zo over dat het membraan het transplantaat bedekt.Plaats ze in de periferie van de CAM, zodat ze het embryo niet bedekken. Voeg vervolgens cultuurmedium toe aan de minireservoirs. Cultiveren van de monsters op kip CAM voor maximaal.Vervang dagelijks het kweekmedium in de minireservoirs. Vascularisatie van de monsters kan al 24 tot 48 uur na transplantatie worden waargenomen. Om de op maat ontworpen zes-put platen voor de vaste cultuur te maken.Je moet beginnen met het boren van 20 millimeter gaten in de bodem van de plaat met behulp van een boormachine met een geschikte boorbit. Poets vervolgens de velgen van de gaten aan de bovenzijde van de plaat. Steriliseer ten slotte de platen gedurende ten minste een uur in 70%-ethanol.Was vervolgens de platen in autoclave door gedestilleerd water en droog ze in lemiar kap. Was de 22x22 millimeter afdekking in 70% ethanol en laat ze volledig drogen. Lijm de cover slip op de top van een gat in de bodem van een put met behulp van weefsellijm.Inspecteer na het drogen de platen onder steriele microscoop en verwijder de overtollige lijm. Meng eerst een aliquot van polystyreenkralen met een gelijk volume waterstof. Plaats de doorvulinzet onder een ontledenmicroscoop met membraan naar boven en schik de nieren op het membraan.Voeg een druppel hydro-gel kraal mengsel naast de nieren zorgvuldig. Draai de transfill insert zodat het membraan en de nieren naar beneden gericht zijn. Plaats vervolgens voorzichtig de insert in onze put van op maat ontworpen zes-put plaat.Duw de wisselplaat heel voorzichtig in de put. Volg de mate van afvlakking van de microscoop tot de nier op het niveau is met de kralen. Houd de wisselplaat lichtjes ingedrukt op de put met een hand en bevestig het aan de plaat door het smelten van plastic op drie punten aan de periferie van de insert met een soldeerbout.Voeg twee milliliter cultuurmedium in de put door middel van een opening aan de zijkant. Bij het starten van een time-lapse beeldvorming, breng de plaat in de on-stage incubator van een omgekeerde microscoop. Ons gemodificeerd CAM capture protocol maakt zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk.Veel reservoirs met kweekmedium levert donorweefsel en beschermen het tegen drogen tijdens de eerste periode van tijd die het vascularizaton voert. Deze film toont de stroom van kippenbloedcellen in een embryonale muis niercentrum geënt om kip CAM en gekweekt voor zeven dagen. Dit cijferpaneel laat zien dat onze verbeterde CAM-kweekmethode tolerante omstandigheden biedt voor de nierafgeïnlaten endotheelcellen.Cijfers A en B tonen embryonale nieren geteeld voor vijf dagen op dagen interval cultuur werden centrum geënt om kip CAM voor vijf dagen. Vlekken met muisspecificaties CD-31-antilichaam toont aan dat het endotheelcelnetwerk van het niercentrum geënt is aan CAM uitgebreider is dan in de controle aan de linkerkant. In figuur C zien we dat muisbloedvaten bevlekt met muisspecifieke CD-31 antilichaam en dat is het meest met kip bloedvaten.Figuren D en E tonen cryosections van muis embryonale nieren geteeld op reiscultuur of kip CAM voor vijf dagen en gekleurd met CD-31 en Hoechst. De glomeruli vasculatuur is rijper in nieren gekweekt op kip CAM dan in controleculturen. Figuur F toont zeven dagen lang een embryonale nier van een muis die op CAM van een transgene GFP-kip wordt gekweekt.De muis endotheelcellen zijn gekleurd met CD-31 antilichaam en we kunnen vaststellen dat de vasculatuur in xenotransplantatie muis nieren is meestal maar niet uitsluitend muis afgeleid. De nieuwe vaste reeksrichtingscultuur maakt het kweken van embryonale nieren en organoïden in een beperkte vastgestelde afstand mogelijk. In een traditionele reiscultuur worden de gekweekte organen op een filter geplaatst dat door een metalen raster in een luchtmediuminterface wordt bewaard.Deze methode zorgt voor goede omstandigheden voor de ontwikkeling en groei, maar is niet optimaal voor beeldvorming. In de vaste richting cultuur, wordt het gekweekte orgaan gedrukt tussen een glazen bodem van de schotel en een membraan en de dikte ervan wordt gecontroleerd door de polystyreen kralen werken als afstandhouders hier. De zich ontwikkelende organen kunnen direct door het afdekglas worden afgebeeld, waardoor het zicht op het orgel wordt verbeterd.Dit cijferpaneel laat zien dat de embryonale nieren en nierorganoïden kunnen worden gekweekt in de vaste richting cultuurmethode. Heldere veldbeelden van embryonale nieren en nierorganoïden op dag zeven laten een normale ontwikkeling zien. In figuur C is de GFB-expressie geactiveerd in de zich ontwikkelende nefrons van een nierorganoïde door figuur D toont een nier met trauma één kleuring op de euretric knop en zes twee kleuringen die de nephron voorloper cellen markeren.De cijfers E en F presenteren de muisnier die 12 dagen wordt gekweekt. Trauma één en nephron het bevlekken tonen de eurethric knop en podocites. De film ook, presenteert een embryonale nier van MTMG, Taiwan cree oorsprong, waar de Taiwan cree induceert GFB expressie in endotheelcellen.We kunnen zien dat de nierendotheelcellen aanwezig zijn in de zich ontwikkelende embryonale nier en het endotheelnetwerk zich ook in de kweekmethode kan ontwikkelen. In het paneel aan de rechterkant u zien hoe endotheelcellen migreren naar de vasculaire spleet van een S-vormige faseneveron. Hier hebben we het verbeterde protocol voor xenotransplantatie van nierorganoïden en embryonale nieren gepresenteerd aan kip CAM.Dit protocol verhoogt aanzienlijk de overleving van nier rudiments en ook hun intrinsieke endotheelcellen. De methode maakt de bloedtoevoer naar de zich ontwikkelende glomerulus. Het andere protocol dat hier wordt gepresenteerd is de vaste richting orgaancultuur methode die de beeldkwaliteit verbetert en helpt om organelle genesis studie op het niveau van eencellige.De hoge resolutie beelden zijn geschikt voor geautomatiseerde celsegmentatie en computergebaseerde studie van cellulair gedrag in nierorganoïden en nierculturen.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes a method for studying organ development using an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos. This method allows for the development of fully vascularized cultured embryonic organs and organoids.

Renal Organotypic Culture on Chicken CAM: A Technique for Transplantation of Murine Kidney Explants on Chicken CAM to Induce Formation of Renal Vascular Architecture

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Hier beschrijven we een protocol om nierorganoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's). Dit protocol genereert nierorganoïden binnen twee weken. De resulterende nierorganoïden kunnen worden gekweekt in grootschalige spinnerkolven of magnetische roerplaten met meerdere bronnen voor parallelle medicijntestbenaderingen.

Een vereenvoudigde methode voor het genereren van nierorganoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.

Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's

Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het produceren van nierorganoïden uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van suspensiekweekomstandigheden. De primaire nadruk van deze studie ligt op de bepaling van de initiële celdichtheid en de WNT-agonistconcentratie, wat ten goede komt aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nierorganoïde-onderzoek.

Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.

Vroege ongeleide menselijke hersenorganoïde neurovasculaire nichemodellering in het toegeeflijke kuikenembryo chorioallantoïsch membraan

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van vasculaire organoïden met behulp van menselijke pluripotente stamcellen.

Vasculaire organoïdegeneratie uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer een verbeterde nierorganoïde-cultuurmethode met CAM-vascularisatie voor ontwikkelingsbiologie. Dit protocol verhoogt de overleving van nieranlagen en maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk.

Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming (Video) | JoVE Journal

Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Meer video's verkennen