Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Met behulp van dit protocol, cel migratie en invasie kan worden onthuld onder real-time omstandigheden waardoor celkinetiek onder verlies of winst van genfunctie en drugs worden bepaald. In tegenstelling tot andere methoden, geen vlekken, mechanische cel schade, of tl-markers nodig. Het belangrijkste is dat de real-time celkinetiek op een effectieve manier kan worden bepaald.

Wanneer de U-118MG cellijn cultuur bereikt 70 tot 80%samenvloeiing, was de cellen met PBS voor de behandeling van de cellen met twee milliliters van 0,5% trypsine-EDTA. Na 30 seconden bij 37 graden Celsius, stop de reactie met 10 milliliter vers kweekmedium en breng de vrijstaande cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in een zes keer 10 tot de vijfde cellen per conditieconcentratie in het juiste volume van vers medium.

Breng zes keer 10 naar de vijfde cellen in een microcentrifuge buis per aandoening en voeg 800 microliters van Dulbecco's PBS aan elke buis. Na centrifugatie, resuspend elke pellet in 60 microliters van resuspensie buffer R en zes micromolar van het siRNA van belang. Meng elke buis met zachte tikken voordat elektroporating 10 microliter aliquots van elke cel suspensie met drie 10-milliseconde 1, 350 volt pulsen.

Na elke behandeling, pool de geëlektreerde cellen van elke aandoening in individuele vijf milliliter aliquots van verse cultuur medium. Dan zaad de cellen in twee 35 millimeter cultuur schotels per aandoening en plaats de cellen in de cel cultuur incubator voor drie dagen. Vijf tot zes uur voor de real-time celanalyse, plaats het real-time celanalysesysteem in de celkweek incubator.

Om een invasietest op te zetten, gebruikt u reverse pipetting om 50 microliter DMEM te plaatsen, aangevuld met 0,1 microgram per milliliter extracellulaire matrixgel in elke put van de bovenste kamer van een celinvasieplaat. Verwijder onmiddellijk na het beplating 30 microliter van de extracellulaire matrixoplossing uit elke put en plaats de plaat vier uur in de celkweek incubator. Voor het opzetten van een impedantie meetprogramma, zes uur voor de meting, vervang het medium in alle geëlektreerde celculturen door een laag serummedium.

Selecteer onder het tabblad Indeling in de bijbehorende impedantiemetingssoftware de optie viervoudige putten voor elke biologische aandoening. Stel onder het tabblad Planning een eenmalige veegstap voor basislijnmeting in met een interval van één minuut en stel een tweede stap in om de celimpedantie in de respectievelijke afzonderlijke wiegen voor het eigenlijke experiment te meten. Voeg een uur voor het begin van de celimpedantiemeting 160 microliter medium toe, aangevuld met 10%foetaal runderserum als chemoattractant in de putten van de onderste kamer van de celinvasie en migratieplaat.

Om invasie te meten, monteer de bovenste kamer met de extracellulaire matrix gel gecoate putten. Om migratie te meten, gebruik je ongecoate putten in de bovenkamer. Voor beide soorten experimenten, vul de putten in de bovenste kamer met 50 microliter van laag serum medium en plaats de kamers in de wieg van het systeem.

Klik op het tabblad Bericht in de software om te bepalen of alle putten worden herkend door de besturingseenheid. Als het bericht wordt weergegeven zoals verwacht, is de plaat in de houder klaar voor het experiment. Plaats vervolgens de volledig verpakte platen in de celcultuur incubator in de real-time cel analyse systeem wieg voor een uur om de plaat te acclimatiseren aan de cel cultuur voorwaarden.

Terwijl de platen zijn evenwicht, oogst de glioblastoom cellen zoals aangetoond en resuspend de cellen van elke aandoening op een acht keer 10 tot de vijfde cellen per 800 microliter van lage serum medium concentratie. Bovendien, opzij een drie keer 10 tot de vijfde cellen in twee milliliter van cultuur medium voor het zaaien in een 35 millimeter schotel voor downstream westerse vlek analyse. Als u de basislijn voor migratie wilt meten, klikt u aan het einde van de acclimatisatie op de knop Start van de wieg.

Nadat de nulmeting is verkregen, breng je de migratie en de invasieplaten van hun respectievelijke wiegen over naar een bioveiligheidskast. Omgekeerde pipet 100 microliters van cellen in viervoudige bovenste kamer putten voor elke biologische aandoening in de juiste put van de cel invasie en migratie platen zoals geprogrammeerd in de controle-eenheid van de wieg. Na het zaaien, houd de platen in de bioveiligheidskast gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen gelijkmatig op de plaatbodem te laten nestelen voordat de platen naar hun respectievelijke wiegen worden overgebracht.

Klik op de knop Cradle om te beginnen met het meten met het meten. Als u de wijzigingen in celimpedantie wilt visualiseren als de celindex op een tijdafhankelijke manier tijdens of na voltooiing van het experiment, opent u het tabblad Gegevensanalyse. Als u de gegevens voor elk van de respectieve voorwaarden afzonderlijk of als gemiddelden en/of standaarddeviaties wilt visualiseren, klikt u op de optievakken voor gemiddelde en standaarddeviatie.

Als u de celindexgegevens wilt exporteren naar een spreadsheetbestand, plaatst u de cursor in het midden van het venster voor gegevensanalyse en klikt u met de rechtermuisknop. Selecteer in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de optie Gegevens kopiëren naar lijstindeling en plak de gegevens in een geopende spreadsheet. Als u het experiment wilt vrijgeven, klikt u op de knop Loslaten in elke houder.

Crk adapter eiwit knockdown vermindert Crk1 en Crk2 eiwitniveaus met respectievelijk 85% en 86%zonder crk-achtige eiwitniveaus te induceren. De knockdown van Crk-achtige vermindert Crk-achtige eiwitexpressie met 85%met een lichte vermindering van Crk1 en Crk2 eiwitniveaus. Het combineren van beide siRNAs vermindert Crk1, Crk2, en Crk-achtige expressie met meer dan 80%, terwijl noch Vinculin, noch alpha-Tubulin expressie wordt beïnvloed door een combinatie van Crk of Crk-achtige knockdown.

Menselijke hersenen glioblastoom cellen migreren langs een gradiënt in reactie op hoge serumconcentraties het bereiken van het maximale niveau van migratie op 13 uur. In knockdowncellen van Crk, hoewel de migratie in eerste instantie wordt vertraagd, bleven de cellen migreren tot 23 uur. Crk-achtige knockdown vermindert de celmigratie aanzienlijk met de glioblastoomcellijn die hun migratievermogen volledig verliest bij knockdown van zowel Crk als Crk-achtige suggereert dat Crk en Crk-achtige spelen essentiële overlappende rollen in kanker cel migratie.

Echter, wanneer celinvasie wordt gecontroleerd over meerdere dagen, de Crk knockdown cellen bereiken een vergelijkbaar maximum niveau van celinvasie in vergelijking met controle glioblastoom cellen op 60 uur met Crk-achtige cellen gedeeltelijk herstellen van hun invasieve vermogen door 90 uur en dubbele Crk-Crk cellen waaruit blijkt een verminderd vermogen om binnen te vallen na 40 uur. De resultaten ondersteunen duidelijk de suggestie dat celinvasie over de gehele periode van het experiment moet worden geanalyseerd. Het zaaien van het juiste aantal cellen en het vermijden van de luchtbellen tijdens het opnemen van de extracellulaire matrix voor invasietest en zaaiende cellen zijn belangrijke punten voor succes van dit experiment.

Volgens soortgelijke procedure, maar met behulp van e-platen, celhechting en cel proliferatie kinetiek kan worden bepaald.