Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Tweedimensionale celculturen bootsen de tumorgroei niet voldoende na. Om te verbeteren, zijn 3D-procedures ontwikkeld met behulp van sferoïden. Onze 3D glioblastoom sferoïde-gebaseerde test is bijzonder geschikt om hersentumor invasie te onderzoeken in de gezonde hersentumor omgeving.

Driedimensionale cultuurmodellen kunnen worden gebruikt om een meercellige architectuur, heterogeniteit en metabole toestand van tumoren samen te vatten, waardoor een strengere evaluatie van de effecten van geneesmiddelen mogelijk is. Zorg ervoor dat u de onderkant van de put niet aanraakt of de supernatant volledig verwijdert, de gel op ijs houdt en de cellen snel aan de gel toevoegt. Om gelijkmatig formaat tumor sferoïden te genereren, eerst wassen de tumorcel cultuur van belang met vijf milliliter PBS en de behandeling van de cellen met 0,5 tot een milliliter van dissociatie enzym.

Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, stop de reactie met vier tot 4,5 milliliter PBS en breng de vrijstaande cellen over in een 15 milliliter conische buis met 10 milliliter volledig groeimedium. Na het tellen, resuspend de cellen op een een keer 10 tot de zesde cellen per acht milliliter van volledige groeimedium aangevuld met twee milliliter van 2%methylcellulose concentratie en breng de schorsing naar een steriele systeem container. Voeg vervolgens 100 microliter cellen toe aan elke put van een 96-put ronde bodemplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius 5%koolstofdioxide incubator gedurende drie tot vier dagen.

Om een invasietest uit te voeren, wanneer de tumorcellen uniform formaat sferoïden hebben gevormd, breng elke celstructuur in een 500 microliter buis en was de sferoïden eenmaal met 200 microliter van PBS. Breng na de tweede wasbeurt de sferoïden voorzichtig over in 100 microliter vers bereide collageenmatrix en voeg elke sferoïde suspensie toe aan het midden van elke put van een platte bodem van 96-put plaat. Voeg na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius 100 microliters van volledig groeimedium toe bovenop de gel in elke put.

Zorg ervoor dat alle sferoïden in het midden van elke put voor de beste beeldvorming van de tumorcel invasie. Om een migratietest uit te voeren, wanneer de tumorcellen uniform formaat sferoïden hebben gevormd, bestrijk een zes-put plaat met 0,2 milligram per milliliter Matrigel in groeimedium gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder aan het einde van de incubatie de Matrigel en voeg twee milliliter volledig groeimedium toe aan elke put.

Breng de sferoïden van de ronde bodemplaat in 50 microlitervolumes over in individuele putten van de zes-putplaat en plaats de plaat 24 uur in de celkweek incubator. De volgende dag, vlek de sferoïden met 10 nanogram per milliliter hoechst gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Voor beeldverwerving na een invasie of migratietest, plaats de plaat op het stadium van een Brightfield confocale microscoop uitgerust met een videocamera en verkrijg beelden over de aangewezen experimentele periode.

Als u de afbeeldingen op een semi-geautomatiseerde manier wilt analyseren, importeert u de afbeeldingen in Fiji en klikt u op Plug-ins, macro's, interactieve tolk. Kopieer en plak de aangepaste paarse lus. Houd de paarse zinnen en voeg de groene zinnen van belang als dat nodig is.

Als u vervolgens het gebied van elke sferoïde wilt meten, klikt u op Analyseren en meten. Om hypoxie in verschillende gebieden van de bolvormige structuur te meten, kan carbonische anhydrase IX-kleuring worden gebruikt om de hypoxische activiteit te bepalen. In deze representatieve analyse werden meer koolstofzuuranhydrase IX-positieve cellen waargenomen in het sferoïde centrum.

Hypoxische cellen in de sferoïde kern hebben de neiging om meer glycolytisch dan de cellen rond de kern. Mitochondriën kunnen worden afgebeeld door elektronenmicroscopie voor verdere analyse. De sferoïde diameter is direct gecorreleerd aan de dichtheid van de cellen die deel uitmaken van de 3D-celstructuur en Fiji macro's kunnen worden gebruikt om de proliferatie, invasie of migratie van de cellen in elke sferoïde of migratie van de cellen binnen elke sferoïde te kwantificeren.

Verhogingen van de sferoïde kern weerspiegelen de stimulatie van celproliferatie. Na de remming van complexe I van de mitochondriale ademhalingsketen, wordt de overgrote meerderheid van de ATP-productie in de mitochondriën aangetast door de proliferatie na 72 uur met 20% te verminderen. Waterstofchloride behandeling verbetert collageen type I invasie over een periode van 24 uur, maar vermindert het migratiegebied van de sferoïden 1,5 keer in vergelijking met de controle onbehandelde sferoïden.

Zoals beoordeeld door live imaging, de sferoïden tonen een hoge interne dynamiek en bewegen snel. De grootte van de sferoïden moet relatief uniform zijn en zorg moet worden genomen om de sferoïden te manipuleren naar het midden van de putten voor de beste beeldvorming resultaten. Deze methode kan ook worden gebruikt om tumorcelproliferatie, migratie en dood te onderzoeken, evenals de expressie van extracellulaire matrix, celreceptoren of intracellulaire eiwitten van belang.

De sferoïden kunnen ook worden ingekapseld en het effect van verhoogde celoppervlak spanning kan worden onderzocht bij verwijdering van de capsules.