Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Het beoordelen van de contractiele eigenschappen van myofibrils geïsoleerd van gestreepte spieren kan worden gebruikt om te bepalen of sarcomere disfunctie is een primaire oorzaak van spierzwakte als gevolg van mutaties in sarcomerische eiwitten. Deze techniek kan worden gebruikt om gegevens te verkrijgen met een zeer hoge signaal-ruisverhouding met nanonewtonresolutie. Dit protocol is ook geschikt om contractiliteit te meten in permeabiliseerde cardiomyocyten.

Houd er rekening mee dat de krachttransducer erg kwetsbaar is. Dus bij het verwijderen van de lijm van de montage naald of bij het lijmen van een myofibril, moet je een vaste hand, veel oefening, en veel geduld. Voordat u het weefsel monteert, plaatst u een homogenisatorstaaf in de buis met het spierweefsel.

Houd de buis op ijs, draai de rotor gedurende 15 seconden op snelheid vijf. Breng aan het einde van de homogenisatie 50 microliter van de resulterende myofibril-suspensie en 250 microliter ontspannende oplossing over op een met poly-HEMA gecoate glijbaan in een weefselbad. Bedek het bad met een deksel om het mengsel te beschermen tegen stof en wacht 5 tot 10 minuten om de myofibrils naar de bodem van de druppel te laten zinken.

Verwarm shellac gedurende 30 tot 60 seconden tijdens het zinken van de myofibrils een ethanollijm op 65 graden Celsius voordat u ongeveer zes microliters lijm toevoegt aan een ongecoate glazen schuif. Herhaaldelijk dompel de punt van elke montagenaald in de lijm tot een laag lijm zichtbaar is. Gebruik vervolgens micro-manipulators om de sonde en piëzo verticaal te verplaatsen om ruimte te maken voor het weefselbad op het microscoopstadium en de glazen dia met de lijm te verwijderen.

Na het monteren van de myofibrils, om de sarcomere lengte te meten, verplaats de piëzo en/of krachtsonde om de initiële sarcomerelengte van de myofibril in te stellen op 2,5 micrometer. Met behulp van de vatfunctie van de systeemcontrollersoftware meet u de lengte en breedte van myofibril. Gebruik de microscoopfase om de myofibril in het midden van het videobeeld te plaatsen en een rechthoek van de ene kant van de myofibril naar de andere uit te rekken, waarbij u ervoor zorgt dat de donkere rand van de lijmdruppels wordt opgenomen.

Klik op Start om de gegevens op te nemen. Na vijf seconden klikt u op Pauzeren. De lengte zal zijn vastgelegd.

Om de breedte te meten, draait u de camera 90 graden om het contrast van de rand van de myofibril zelf te bekijken. Pas de rechthoek aan en klik op start om te beginnen met het opnemen van de gegevens. Na vijf seconden klikt u op Pauzeren.

De breedte zal zijn geregistreerd. Om het thetaglas te positioneren, gebruikt u het oculair en de manipulator om het thetaglas voorzichtig naar de myofibril te bewegen. Lijn het bovenste kanaal van het thetaglas uit met de myofibril en voer een snelle stap uit om de positie te controleren.

Schakel de ontspannende stroom op de achtergrond in om de uitlijning van thetaglas te controleren en gebruik een Luer-klephendel om de instroom van de stroomkamer in te schakelen. Dan om te beginnen met het aftappen van de stroomkamer en om overstromen van de stroomkamer te voorkomen, zet de uitstroompomp klep naar badklep twee, de micro stap modus op micro, de zuiger doel op 48,000, en de zuiger snelheid tot 38 tot 40. Om de snelheid van spanningsherontwikkeling te meten, berekent u de piëzobeweging die nodig is om de myofibril met 15% te verslappen en deze waarde in de signaalgenerator in te voeren.

Klik op hervatten om door te gaan met het registreren van de gegevens en open kleppen een en zes om de stromen van de ontspannende oplossing en de verschillende calciumconcentraties te starten door de theta glas respectievelijk. Selecteer het resetbereik op de interferometer om het bereik van de interferometer opnieuw in te stellen, zodat de basiskracht nul volt is. Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de thetaglas fast-step uit met een stapgrootte van 100 micrometer.

Wanneer het krachtplateau is bereikt, voert u de verkorting opnieuw uit met de piëzo. Een activeringsontspanningsspoor wordt geregistreerd. Klik op Pauzeren.

Als u een stapsgewijs traject wilt uitvoeren, klikt u op start en reset het bereik van de interferometer, zodat de basiskracht nul volt is. Voer een stapsgewijs stuk uit met de signaalgenerator. Wanneer het stuk klaar is, gebruik de piëzo om de myofibril te verkorten tot de slappe lengte.

Druk vervolgens op pauze en stop en sla de gegevens op. Hier worden krachtsporen van een actief krachtexperiment getoond met een myofibril geïsoleerd van gezonde menselijke quadricepsspier. De myofibril werd vijf keer geactiveerd met oplossingen met verschillende calciumconcentraties, met een gemiddelde maximale kracht van alle myofibrils van ongeveer 123 millinewton per vierkante millimeter.

De constructie van een kracht calciumconcentratie curve van het plateau krachten bereikt tijdens elke activering in elk van de vijf calcium curven maakt de berekening van de calciumconcentratie op 50% van de maximale kracht productie. Zoals geïllustreerd in deze representatieve analyse, kunnen de myofibrils worden behandeld met meerdere verbindingen in een enkel experiment om aanvullende vragen over het myofibril type te beantwoorden. De actieve kracht en sarcomere lengte kan ook worden gemeten om de berekening van de tarieven van herontwikkeling, activering en ontspanning mogelijk te maken.

De steile stijging in de gestippelde rode doos wordt veroorzaakt door zowel viscositeit als elasticiteit. Het plateau lijkt alleen op de elastische component. Als viscositeit bestand is tegen spanning lineair, de kracht gedaald nadat de stam werd verwijderd.

Bij het positioneren van de theta glas, zorg ervoor dat u goed uitlijnen met de myofibril. Anders kan de activerende oplossing komen tussen de optische vezel en de cantilever van de kracht sonde en dit zorgt ervoor dat artefacten optreden in uw gegevens. Ook kan de myofibril niet goed activeren.

Deze methode van perfusie is ook geschikt om het spiervezeltype van de myofibril te bepalen. U bijvoorbeeld eerst de myofibril doornemen met een normale calciumoplossing, gevolgd door perfusie van diezelfde oplossing, maar voeg vervolgens een specifieke krachtverhogende verbinding toe.