Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

We gebruiken deze test om te beoordelen of plantaardige voedingsmiddelen fytosteroïden bevatten, die fysiologische processen bij dieren, evenals gedrag en reproductiesucces kunnen beïnvloeden. Deze test biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen of planten oestrogene verbindingen produceren met biologische activiteit. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om geneesmiddelen met xeno-oestrogeenactiviteit te screenen voor toepassingen in de geneeskunde.

Bijvoorbeeld, het remmen van celproliferatie. We gebruiken het om inzicht te geven in de ecologie en evolutie van primaten. Het is belangrijk om oefening te hebben met het werken met aseptische techniek in een schone omgeving voordat u deze test probeert, omdat deze zeer gevoelig is voor besmetting.

Begin door de verse plantenitems te bevriezen met de lyofilisator, vervolgens fijn te malen met behulp van een maalmolen met een 0,85 millimeter gaasscherm. Bewaar de gemalen monsters in zakjes in het donker tot extractie. Om eventuele fytosteroïden in de planten te extraheren, voegt u gedroogd monster toe aan een geschikt formaat kolf, en vervolgens HPLC-kwaliteit methanol.

Dek de plantenmethanoloplossing af met aluminiumfolie en zet deze op een orbitale schudder om drie dagen lang met 100 RPM te roteren. Na drie dagen gebruikt u filterpapier om het supernatant in een druppelfiltratiesysteem te decanteren. Droog het plantenextract met een rotatieverdamper tot het verdikte, maar uitgietbaar is in een ronde bodemkolf van 300 milliliter.

Giet het monster in een 50 milliliter kolf en spoel de grote kolf af met een kleine hoeveelheid methanol, en droog het monster vervolgens in de kleine kolf verder tot het methanol volledig is verdampt. Wanneer u klaar bent, weegt u het monstersediment met een analytische balans en noteert u de massa. Los het plantenextract op in DMSO met een concentratie van 0,1 gram extract op twee milliliter DMSO en vortex het tot het gehomogeniseerd is.

DMSO is op zichzelf niet giftig, maar het is een medium dat andere stoffen toelaat om membranen te passeren. Omdat we niet weten of onze planten giftige chemicaliën bevatten, worden ze allemaal behandeld alsof ze gevaarlijk zijn. Laat de oplossing niet op de huid komen, vervang handschoenen als ze besmet zijn, en draag dikke, afsluitende schoenen en labjassen.

Bewaar het monster op vier graden Celsius in barnstenen glazen flesjes tot het klaar is voor gebruik. Vortex de monsters, en voeg vervolgens vier microliter van elk monster toe aan 496 microliter van het verbindingscreeningsmedium om een 0,8% DMSO-oplossing te verkrijgen. Desinfecteer de buitenkant van een voorverwarmde buis voor celrecuperatie met 70% ethanol en breng 10 milliliter van het medium over in een buis met bevroren reportercellen om ze te ontdooien.

Sluit de buis met reportercellen en plaats deze in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende vijf tot tien minuten. Na het ophalen van de cellen uit het waterbad, draai de buis voorzichtig enkele keren omhoog om aggregaten van cellen te breken en een homogene suspensie te produceren, en maak vervolgens het oppervlak van de buis schoon met 70% ethanol. Gebruik een multikanaals pipette om 100 microliter van de reportercelsuspensie in elk putje van een 96-putjesplaat te doseren, en doseer vervolgens 100 microliter van de monsters in drievoudig in de juiste putjes.

Incubeer de plaat gedurende 22 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Net voor het einde van de incubatie van de plaat, haalt u het detectiesubstraat en het detectiebuffer uit de koelkast en plaatst u deze in een donkere ruimte tot ze gelijk zijn aan de kamertemperatuur, en draait u vervolgens voorzichtig elke buis omhoog om de oplossingen te mengen. Direct voordat de plaatincubatie voltooid is, giet u de volledige inhoud van het detectiebuffer in de buis met detectiesubstraat om het luciferasedetectiereagens te creëren.

Meng de buis voorzichtig om geen schuim te produceren. Gooi de inhoud van de monstersplaat in een ongeschikte afvalcontainer en tik er voorzichtig op een schone absorberende papieren handdoek om de laatste druppels uit de putjes te verwijderen. Voeg 100 microliter van het luciferasedetectiereagens toe aan elk putje en laat de testplaat gedurende 15 minuten op kamertemperatuur rusten, en bepaal vervolgens de luminescentie met behulp van een luminometer voor het lezen van 96-putjesplaten.

22 extracten van fruit en groenten die vaak in het menselijk dieet voorkomen, zijn gescreend op de aanwezigheid van oestrogene verbindingen. Oestrogene activiteit wordt gepresenteerd op een ordinale kwalitatieve manier van hoge, gemiddelde, lage of geen activiteit. Biologische en niet-biologische sojabonen werden getest op hoge activiteitsniveaus, terwijl alle andere fruit- en groente-items geen activiteit registreerden.

Het vergelijken van de sojaresultaten met de standaardcurve toont ook aan dat ze bij deze concentratie hoge oestrogene activiteitsniveaus hebben. Soja-extract, een bekende krachtige bron van de isoflavonen, daidzeïne en genisteïne, werd verder gebruikt om de verdunning te bepalen die een 50% signaal oplevert ten opzichte van het maximum. Dit extract vereist 422 keer meer verdunning om de helft van het signaal van ons standaardverdunningsprotocol te produceren.

Steekproeven geïdentificeerd met activiteit kunnen worden verzonden voor analyse door massaspectrometrie om de actieve chemicaliën te identificeren. Met behulp van een antagonistische methode, zouden we ook kunnen bepalen of het plantaardige voedsel chemicaliën bevat die de binding en activiteit van endogene oestrogenen verminderen. Deze techniek stelt ons in staat om ons begrip van hoe wijdverbreid oestrogene voedingsmiddelen zijn in primatendietes verder te vergroten, evenals hoe consumptie van fyto-oestrogenen de fysiologie en het gedrag beïnvloedt wanneer de test wordt gecombineerd met fecale hormoonanalyses en veldgegevens.