Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

Ons protocol maakt de gedetailleerde identificatie en analyse van monocyten en macrofagen en T-cellen en hun relevante subsets binnen de neuronen en ovium en diverse andere weefsels van het immuunsysteem mogelijk. Onze techniek vergemakkelijkt de betrouwbare oogst van leven immuuncellen uit het synovium en andere relevante weefsels voor een uitgebreide karakterisering van de osteoarthritische immuunrespons. Voor de isolatie van weefsels van belang van een artrose model muis, met de muis in een supine positie, veeg de borst, buik en benen met 70%ethanol.

Gebruik een schaar om de huid voorzichtig te openen langs de middellijn van de buik terwijl de buikholte intact blijft. En trek voorzichtig de huid aan de rechterkant van het dier uit de buurt van de onderliggende spier, waardoor het onderhuidse vetweefsel aan de huid wordt bevestigd. Plaats de muis onder een dissecerende microscoop en gebruik twee gebogen fijne tangen om het vetweefsel dat zich aan de dij bevindt voorzichtig uit te plagen.

Na het identificeren van de drie kruisvaten, gebruik fijne ontleden tangen om de inguinale lymfeklier gelegen op het kruispunt van de vaten te verwijderen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de capsule niet scheurt. Gebruik de tangen om het resterende vet van het oppervlak van de lymfeklier te verwijderen en de buikholte te openen. Als er geen resterend vet kan worden gezien, plaats de lymfeklier onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes goed plaat gevuld met 0,5 milliliter RPMI-media.

Maak hierna de buikholte open. Gebruik fijne schaar om de milt weg te nemen en om de darmen voorzichtig te extraheren om de aorta en de splitsing ervan bloot te leggen. Plaats de milt hierna onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes goed gespeelde zes met 0,5 milliliter RPMI-media.

Verwijder de iliacale lymfeklier gelegen op het terminale segment van de abdominale aorta en de oorsprong van de gemeenschappelijke iliacale slagader en verwijder de huid voorzichtig uit beide achterste ledematen. Plaats onmiddellijk de lymfeklier in een eerder voorbereide en gelabelde zes putplaat gebouwd met 0,5 milliliter RPMI-media die alle lymfeklieren van twee dieren bundelen. Met behulp van fijne schaar of een scalpel schoon het linker dijbeen van de bijgevoegde spierweefsel en zorgvuldig losgekoppeld zowel de verstikkende en het heupgewricht, waardoor het hele bot intact tijdens het verwijderen van het dijbeen.

Vervolgens plaatste het dijbeen in een eerder voorbereide en gelabeld zes goed plaat gevuld met 0,5 milliliter RPMI media. Identificeer de patellapees van het rechter verstikkende gewricht en gebruik fijne schaar om het aangrenzende spierweefsel proximaal te verwijderen tot ongeveer vijf milliliter quadriceps pees proximale aan de knieschijf worden blootgesteld. Snijd door de quadriceps pees ongeveer drie tot vier millimeter proximale aan de knieschijf om een handvat te vormen en gebruik fijne tangen om voorzichtig trek de spanning uit de buurt van het gewricht om de randen van de gezamenlijke capsule bevestiging bloot te stellen.

Beginnend met het dijbeen en bewegen in de richting van het scheenbeen, gebruik een scalpel om zorgvuldig te snijden langs de randen van de gezamenlijke capsule aan beide zijden met behoud van een zachte tractie op de quadriceps pees. Wanneer het synoviale weefselblok alleen aan het scheenbeen is bevestigd, moet het intraarticulaire vetkussen duidelijk zichtbaar zijn op de knieschijf en kan het voorzichtig worden losgemaakt van het gewrichts- en voorste aspect van de Minsky. Snijd vervolgens langs het resterende deel van de gezamenlijke capsule om het synoviale weefselblok te verwijderen en plaats het onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes putplaat gevuld met 1,5 milliliter RPMI-media.

Wanneer alle weefsels zijn verzameld, plaats twee gepoolde milt per aandoening op een 70 micrometer cel zeef in een 15 milliliter buis en gebruik een steriele drie milliliter spuit plunger om zachtjes massa tarief van de weefsels door het mesh filter spoelen de zeef vaak met een totaal van zes milliliter RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS. Sediment de cellen door centrifugatie, en opnieuw op te schorten de pellet in vijf milliliter van rode bloedcel lysis puffer. Na vijf minuten stopt u de reactie met 10 milliliter PBS en centrifugeert u de cellen.

Wanneer er geen rode bloedcellen meer worden waargenomen, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter verse PBS voor het tellen. Voor lymfeklier verwerking plaats alle vier lymfeklieren op een 70 micrometer cel zeef in een nieuwe 15 milliliter buis en gebruik een nieuwe steriele drie milliliter zuiger om voorzichtig plagen de lymfeklieren door het net in een enkele cel suspensie, dan centrifugeren de cellen op 500 keer G gedurende vijf minuten, gooi de supernatant en opnieuw schorsen de pellet in 500 microliter pbs voor het tellen. Om het beenmerg te isoleren, gebruik een weefsel duim tang om zorgvuldig te grijpen het intacte dijbeen en gebruik scherpe schaar af te snijden het einde van het proximale dijbeen.

Steek een 23-meter naald in het midden van de intercondylar inkeping van het dijbeen en draai de naald terwijl u zachte druk uitoefent om een gat in de inkeping te boren. Het veranderen van de naald indien nodig, spoel de inhoud van het bot met zes milliliter RPMI aangevuld met 10%FBS op een 70 micrometer cel zeef op een nieuwe 15 milliliter buis en gebruik een nieuwe drie milliliter spuit zuiger om voorzichtig druk het beenmerg door het gaas. Voer hierna de RBC-stap uit zoals aangetoond voor de milt.

Wanneer er geen rode bloedcellen meer worden waargenomen, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter verse PBS voor het tellen. Voor de verwerking van het synoviale weefsel gebruik fijne chirurgische schaar om dobbelstenen de twee synoviale weefsel blokken in kleine stukjes en breng de monsters in een nieuwe 15 milliliter buis. Spoel de opvangcontainer af met 500 microliter medium om de resterende cellen en synoviale weefsels te verzamelen en trek de was in de monsteropvangbuis.

Voeg vervolgens een voldoende volume enzym toe om in een één eenheid per milliliter uiteindelijke concentratie te bereiken en verteer het synoviale weefselmonster bij 37 graden Celsius in een couveuse gedurende twee uur van een rotator. Zorg voor voldoende beweging bij het plaatsen van de buizen in de rotator. Aan het einde van de incubatie, stop de spijsvertering met acht milliliter RPMI aangevuld met 10%FBS en filter de cel suspensie door een 70 micrometer celzeef in een nieuwe 15 milliliter buis.

Spoel de oude 15 milliliter buis met vijf milliliter medium en gebruik dit om het filter te wassen. Vervolgens, sediment de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 500 microliters van PBS voor het tellen. Om levensvatbaarheid kleuring van de geïsoleerde immuuncellen uit te voeren, voeg vijf keer 10 aan de vijf cellen van elke cel suspensie aan de juiste putten van twee verschillende 96 goed U-bodem platen en het verzamelen van de cellen aan de onderkant van elke put.

Altijd voldoende niet-gekleurde cellen van elk weefseltype als negatieve controles. Was cellen met 200 microliter PBS en schort de pellets opnieuw op in 100 microliter cel in permeant amine reactieve kleurstof per put gedurende een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatiewas de cellen twee keer in 200 microliters van FACS buffer per wasbeurt en opnieuw opschorten elke pellet in 100 microliters van de juiste antilichaam van belang of controle cocktail.

Als zowel intra- als extracellulaire kleuring wordt uitgevoerd in dezelfde uitvoeren van de extracellulaire kleuring stap nu. Na 30 minuten incubatie bij vier graden Celsius beschermd tegen licht wassen de cellen twee keer met 200 microliter FACS buffer per goed en opnieuw op te schorten de cellen en de monocyten subset paneelplaat in 250 microliters van FACS buffer aangevuld met een millimolar EDTA. Voer deze stap alleen uit als er geen intracellulaire kleuring is gepland, ga anders verder naar het intracellulaire kleuringsaspect van het protocol.

Breng vervolgens elk monocyt subsetmonster over in de desbetreffende overeenkomstige FACS-buis op ijs dat tegen licht is beschermd. Voor intercellulaire kleuring van de T-cel subset paneelcellen, opnieuw schorsen de pellets in 200 microliter van fixatie buffer van een passende fixatie en permeabilisatie kit voor een 40 minuten incubatie op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatiewas de cellen twee keer met 200 microliters permeabilisatie wasbuffer en opnieuw opschorten de pellets in 100 microliters van de juiste antilichaam van belang of controle cocktail voor een 40 minuten incubatie bij vier graden Celsius beschermd tegen licht.

Dan, was de cellen twee keer in 200 microliters van permeabilisatie wassen buffer per wasbeurt. En schort de cellen opnieuw op in 250 microliter facs plus EDTA-buffer voordat de monsters worden overgebracht naar de desbetreffende FACS-buizen op ijs dat tegen licht is beschermd. Hier kan de hiërarchische gatingstrategie voor het monocytenubsetpanel op immuuncellen die uit het beenmerg van DMM behandelde dieren zijn verzameld, worden waargenomen.

Onbevlekte trollen kunnen worden gebruikt om de ware negatieven voor de dode levende vlek te bepalen en de poorten kunnen worden aangepast telkens wanneer het experiment wordt uitgevoerd als dat nodig is. In deze representatieve analyse werden immuuncellen geïsoleerd uit de synoviale weefsels en gekleurd met extracellulaire oppervlaktemarkers, zes weken na DMM of schijnbestrijdingsoperatie. Een hoger percentage van Ly-SC positieve MHC2 negatieve en M2 macrofagen worden waargenomen bij DMM behandelde dieren in vergelijking met de cel populaties waargenomen in schijnchirurgie muizen.

Hier kan de hiërarchische gatingstrategie voor het extra en intracellulaire T-celpaneel op immuuncellen, geïsoleerd door de milt van met DMM behandelde dieren, worden waargenomen. Een hoger percentage TH1-cellen wordt waargenomen in de lymfeklieren en synoviale weefsels van DMM-dieren, evenals hogere aantallen T-regulerende cellen en TH17-cellen. Om de verwerving van monsters van hoge kwaliteit te garanderen, moeten de weefsels snel, nauwgezet en consistent worden geoogst.

Zodra de immuuncellen zijn geïsoleerd, kan andere downstream-analyse worden uitgevoerd, zoals RTPCR, celcultuur en rust op bloed om een licht te schijnen op moleculaire processen van belang.