Name: Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Leer een intracisternale injectietechniek met een gebogen naald voor precieze genetische manipulatie van leptomeningeale cellen in muizen. Deze methode minimaliseert weefselschade en volgt liquorstroomdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Zweedse Onderzoeksraad, de Swedish Cancer Society, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek, Knut en Alice Wallenbergs Stiftelse en het Strategic Research Programme in Stem Cells and Regenerative Medicine van Karolinska Institutet (StratRegen).

De hierbij voorgestelde chirurgische procedures werden goedgekeurd door Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd en uitgevoerd in overeenstemming met de specificaties van het onderzoeksinstituut (Karolinska Instituut, Zweden).
LET OP: Intracisternalinjectie kan flexibel worden aangepast voor meerdere onderzoeksdoeleinden. We presenteren hieronder een procedure die is ontwikkeld om leptomeningealcellen efficiënt te labelen voor fate mapping op basis van injectie van endoxifen in een transgene muislijn met R26R-tdTomato12 en CreER, de laatste onder de Cx30 promotor13. De etikettering van deze populatie cellen kan worden bereikt door injectie van virale constructies volgens dezelfde procedure die hieronder wordt beschreven. Ten slotte kan deze aanpak worden gebruikt voor het bijhouden van hersenvochtstroom, door infusie van fluorescerende tracers.
1. Voorbereiding van het injectiesysteem
LET OP: Wij raden aan de procedure uit te voeren in een geschikte chirurgische ruimte, en in aseptische omstandigheden. Chirurgische hulpmiddelen kunnen worden gesteriliseerd met behulp van warmte (autoclave, glazen kraal sterilisator) of ontsmet met behulp van een hoog niveau chemisch ontsmettingsmiddel als ze hittegevoelig zijn. Spoel de instrumenten voor gebruik bij het gebruik van chemische desinfectie of laat ze afkoelen wanneer ze ontsmet worden met warmte.
<ol><li>Buig met behulp van tangen de naald van de injectiespuit tot 30° op 3 mm van de punt. LET OP: Gebruik Hamilton spuiten met een 30 G schuine naald.</li>
	<li>Bereid 1 mg/mL endoxifen oplossing, verdund in 10% DMSO en vul de spuit met de gebogen naald. OPMERKING: Toedien 5 μL van de verbinding toe om te zorgen voor wijdverspreide blootstelling van hersencellen in de volwassen C57Bl/6j-muis (ca. 25-30 g), hoewel proefexperimenten die verschillende concentraties en injectievolumes testen nodig kunnen zijn bij de behandeling van dieren van verschillende leeftijden en stammen.</li>
	<li>Pas de muishoofdhouder zo in dat het mondstuk zich op ongeveer 30° van het oppervlak van de chirurgische tafel bevindt. LET OP: Een stereotactisch frame met driepuntsfixatie (d.w.z. oren en mond) kan ook voor deze procedure worden gebruikt. In dit geval wordt het dier echter alleen met het mondstuk bevestigd, terwijl de oorstaven onder de voorpoten van het dier kunnen worden verlengd en kunnen worden gebruikt om het lichaam van het dier tijdens de procedure te ondersteunen.</li>
</ol>2. Inductie van anesthesie
<ol><li>Gebruik voor injecteerbare anesthesieconcentraties en toedieningswijzen die door de veterinaire eenheid van de plaatselijke instelling worden aanbevolen.</li>
	<li>Voor inhalatie-verdoving, zoals isofluraan, bereid de administratie-eenheid volgens de specificaties van de fabrikant.</li>
	<li>Met isofluraan, ingestelde concentratie van de verbinding op 4% voor inductie van anesthesie.</li>
	<li>Lever lucht met een snelheid van 400 mL/min.</li>
	<li>Laat de anesthesie-eenheid de kamer een paar minuten vullen met de verdoving en plaats de muis daarna in de kamer. LET OP: Voor de huidige experimenten hebben we volwassen (>2 maanden oud en ongeveer 30 g) mannelijke en vrouwelijke transgene muizen gebruikt die Cx30-CreER en R26R-tdTomato dragen en gefokt op een C57Bl/6j achtergrond.</li>
	<li>Houd het dier in de gaten tijdens de inductie van anesthesie. Het ademhalingspatroon moet vertragen wanneer de muis onder volledige anesthesie is.</li>
	<li>Haal het dier uit de kamer en controleer op onderdrukking van de pootreflex door de achterpoten subtiel te knijpen. LET OP: De reflex kan nog steeds aanwezig zijn, maar vertraagd een paar seconden. Als dat het geval is, plaats het dier terug in de kamer totdat volledige onderdrukking van de pootreflex is bereikt.</li>
	<li>Analgesic (bijvoorbeeld Carprofen, 5 mg/kg door onderhuidse injectie) toedienen om postoperatieve pijnbestrijding te helpen.</li>
</ol>3. Plaatsing van het dier voor de procedure
<ol><li>Bevestig het hoofd van het dier op de hoofdhouder. Om de toegankelijkheid van de cisterna magna te verbeteren, positioneer je het lichaam van het dier op ongeveer 30° van het oppervlak van de tafel en het hoofd naar beneden, om een hoek van 120° met de rest van het lichaam vast te stellen en de achterkant van de nek uit te breiden om de toegang tot de cisterna magna(figuur 1A )te vergemakkelijken.</li>
	<li>Voeg papieren handdoeken onder het dier om zijn lichaam te ondersteunen tijdens de procedure.</li>
	<li>Veilige anesthesie levering via de mond stuk en vermindering isoflurane concentratie tot 2,5% en luchtlevering tot 200 ml/min.</li>
	<li>Breng oogheelkundige zalf aan.</li>
</ol>4. Blootstelling van de Cisterna Magna
<ol><li>Scheer de achterkant van de nek van het dier en ontsmet het gebied met 70% ethanol en Betadine.</li>
	<li>Met behulp van chirurgische schaar, het uitvoeren van een middellijn incisie (ca. 7 mm in lengte) te beginnen op het niveau van het occipital bot en uit te breiden naar achteren.</li>
	<li>Scheid voorzichtig oppervlakkig bindweefsel en nekspieren die zijwaarts van de middellijn trekken met fijne tippincet. Dit zal bloot het durale membraan overdeed van de cisterna magna, gevormd als een omgekeerde driehoek.</li>
	<li>Gebruik steriele absorptie speren of wattenstaafjes om eventuele resulterende bloeden controle.</li>
	<li>Plaats een kleine chirurgische separator om de nekspieren opzij getrokken te houden en visualisatie van de cisterna magna gedurende de hele procedure mogelijk te maken.</li>
</ol>5. Intracisternal Injectie
<ol><li>Om toegang te krijgen tot de cisterna magna, identificeert u het staarteinde van het occipital bot en plaatst u de naald die eerder onmiddellijk eronder werd gebogen. LET OP: Er zal een plotselinge daling van de weerstand als de dural membraan wordt doorboord. De punt van de naald dringt echter slechts iets door onder het meningealeoppervlak, dankzij de gehaakte vorm.</li>
	<li>Zodra de dura is geperforeerd, laat de gebogen punt van de naald door te dringen onder het dural oppervlak door voorzichtig te trekken de spuit naar boven en parallel aan het lichaam van het dier, om "haak" de naald aan de schedel (zie figuur 1B). Dit zorgt voor een betere stabiliteit en voorkomt dat de naald dieper doordringt, waardoor het risico van beschadiging van het onderliggende cerebellum of medulla wordt vermeden.</li>
	<li>Injecteer de verbinding langzaam om interferentie met de natuurlijke stroom van het hersenvocht te voorkomen. LET OP: Afhankelijk van het doel van het experiment kan de infusiesnelheid variëren. Als een langzame en constante infusiesnelheid vereist is (bijvoorbeeld bij het gebruik van de procedure om de beweging van hersenvocht te traceren), kan het raadzaam zijn om een geautomatiseerd microinfusiesysteem te gebruiken in combinatie met de spuit.</li>
	<li>Laat de naald na de injectie 1 min op de plaats rusten en verwijder deze voorzichtig. Gebruik fijne tip tangen om te helpen het terugtrekken van de naald uit zijn aangesloten positie. LET OP: Het gebruik van een dunne naald (bijvoorbeeld 30 G) leidt niet tot aanzienlijke schade aan het hersenvlies en de daaruit voortvloeiende uitstroom van het hersenvocht. Als grotere naaldmaten nodig zijn, raden we aan het lekken van vloeistof te stoppen door druk uit te oefenen op de injectieplaats met behulp van een steriele katoenen punt.</li>
</ol>6. Afsluiting van de procedure en postoperatieve zorg
<ol><li>Verwijder de separator en laat de spieren terug te gaan naar hun oorspronkelijke positie overhet dural membraan.</li>
	<li>Sluit de huidincisie met behulp van een paar druppels cyanoacrylaatlijm. LET OP: U ook absorberende hechtingen gebruiken (bijvoorbeeld 5-0 vicrylhechtingen) en de huidincisie sluiten met onderbroken hechtingen.</li>
	<li>Breng lokale verdoving (bijvoorbeeld 100 μL van 5% lidocaine) aan op de incisieplaats.</li>
	<li>Haal het dier uit de houder en plaats in een schone kooi op een verwarmingskussen. Hou het dier in de gaten tot het weer bij bewustzijn is. LET OP: De procedure zal naar verwachting geen langdurige pijn of angst bij het dier veroorzaken. Niettemin moet de muis gedurende de eerste postoperatieve dagen nauwlettend worden gevolgd en kunnen pijnbestrijdingsmaatregelen worden genomen wanneer dit nodig wordt geacht, en in overeenstemming met de aanbevelingen van de veterinaire eenheid van uw instelling.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Het hier geschetste protocol presenteert een eenvoudige en reproduceerbare procedure om leptomeningealcellen te labelen voor het in kaart brengen van het lot. We gebruiken intracisternalinjectie van endoxifen, een actieve metaboliet van Tamoxifen, om expressie van tdTomato fluorescerende reporter in Cx30-CreER te induceren; R26R-tdTomato muizen12,13.
In vergelijking met andere protocollen die worden gebruikt voor het verkrijgen van toe...

Leptomeningealcellen zijn een fibroblast-achtige populatie van cellen georganiseerd in een dunne laag die de hersenen overlegt en genen uitdrukt die betrokken zijn bij collageencrosslinking (bijvoorbeeld Dcn en Lum), en bij de oprichting van een hersen-meningeale barrière (bijvoorbeeld Cldn11)1,2. Leptomeningeale cellen zijn betrokken bij een breed scala van fysiologische functies, van strikte controle over de cerebrospinale vloeistof drainage3 tot begeleiding van neurale voorouders in de zich ontwikkelende hersenen4,5. Een recente studie heeft ook voorgesteld dat leptomeninges in de pasgeborene kan haven radiale glia-achtige cellen die migreren naar de hersenen parenchyma en ontwikkelen tot functionele corticale neuronen6.
Leptomeningealcellen bevinden zich in de nabijheid van oppervlakteastrocyten en delen met hen, evenals andere parenchymale astroglia, expressie van connexin-30 (Cx30)7. De onderstaande chirurgische procedure maakt een wijdverbreide en specifieke etikettering van deze meningealecellen mogelijk via een eenmalige levering van endoxifen in de cisterna magna van transgene muizen die tdTomato in Cx30+ cellen voorwaardelijk uitdrukken (d.w.z. met behulp van een CreER-loxP-systeem voor het in kaart brengen van het lot). Endoxifen is een actieve metaboliet van Tamoxifen en induceert recombinatie van CreER-uitdrukkende cellen op dezelfde manier als Tamoxifen doet. Het is echter de aanbevolen oplossing voor actuele toepassing, omdat het oplost in 5-10% DMSO, in plaats van hoge concentraties ethanol. Bovendien kruist endoxifen niet de hersen-meningeale barrière, waardoor een specifieke recombinatie van leptomeningeale cellen mogelijk wordt, zonder etikettering van de onderliggende Cx30+ astrogliale populatie (zie representatieve resultaten).
De hier gepresenteerde techniek is gericht op het handmatig en veilig injecteren van de verbinding in het hersenvocht, via directe toegang tot de cisterna magna. In tegenstelling tot andere, meer invasieve procedures die craniotomie vereisen, maakt deze aanpak het mogelijk om verbindingen te bezielen zonder schade aan de schedel of het brein parenchyma te veroorzaken. Het wordt dus niet geassocieerd met de inductie van ontstekingsreacties veroorzaakt door activering van parenchymale gliacellen. Net als bij andere injectiestrategieën beschreven vóór8,9,10, is de huidige aanpak gebaseerd op de chirurgische blootstelling van het atlanto-occipital dural membraan dat de cisterna magna bedekt, na een stompe dissectie van de overlopende nekspieren. Echter, in tegenstelling tot andere procedures, raden we het gebruik van een naald gebogen aan de punt, die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot tijdens toediening. Dit voorkomt het risico dat de naald te diep doordringt en het onderliggende cerebellum en medulla beschadigt.
Deze chirurgische ingreep is compatibel met afstammingsonderzoeken die gericht zijn op het in kaart brengen van veranderingen in celidentiteiten en migratieroutes via haakjeslagen. Het kan ook worden aangepast aan genetische ablatiestudies die van plan zijn de rol van leptomeningealcellen in gezondheid en ziekte te onderzoeken, zoals hun bijdrage aan corticale ontwikkeling5 of de verspreiding van bacteriële meningitis3,11. Ten slotte kan het worden gebruikt om cerebrospinale vloeistof beweging te volgen in combinatie met de levering van fluorescerende tracers in wildtype dieren.

<table><tbody><tr><td>Anesthesia unit</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>Compleet met verdamper, kamer en slang die aansluit op kamer en muis kop houder</td></tr><tr><td>Anesthesia (Isoflurane)</td><td>Baxter Medical AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Orion Pharma AB</td><td>014920</td><td>Commerciële naam Rymadil</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate lijm</td><td>Carl Roth</td><td>0258.1</td><td>Gebruik zijde 5-0 hechtingen, als alternatief</td></tr><tr><td>Medbond Tissue Glue</td><td>Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Histolab</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit (30 G geslepen naald)</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Aspen Nordic</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>Muis kop houder</td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>Met mondstuk voor inhalatie anesthetica. Alternatief, gebruik een stereotactische frame</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Steriele absorptiespijkers</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-01</td><td>Steriele wattenstaafjes zijn ook een goede optie</td></tr><tr><td>Chirurgisch scheider</td><td>World Precision Instrument</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch&amp;Lomb Nordic AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van leptomeningeal cellen wijziging via intracisternal injectie

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

Het hier beschreven protocol beschrijft hoe u veilig en handmatig oplossingen injecteren via de cisterna magna terwijl het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. Eerder gepubliceerde protocollen raden het gebruik van rechte naalden die moeten worden verlaagd tot een maximum van 1-2 mm van het dural oppervlak. De plotselinge daling van de weerstand zodra het durale membraan is doorboord, maakt het moeilijk om de naald in een stabiele positie te houden. Onze methode, in plaats daarvan, maakt gebruik van een naald gebogen op de punt die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot van de schedel, waardoor de spuit niet in het weefsel doordringt na perforatie van het durale membraan. De procedure is eenvoudig, reproduceerbaar en veroorzaakt geen langdurig ongemak bij de geopereerde dieren. We beschrijven de intracisternal injectiestrategie in de context van genetische fate mapping van vasculaire leptomeningealcellen. Dezelfde techniek kan bovendien worden gebruikt om een breed scala van onderzoeksvragen aan te pakken, zoals het onderzoeken van de rol van leptomeninges in neuroontwikkeling en de verspreiding van bacteriële meningitis, door genetische ablatie van genen putatief betrokken bij deze verschijnselen. Bovendien kan de procedure worden gecombineerd met een geautomatiseerd infusiesysteem voor een constante levering en worden gebruikt voor het volgen van cerebrospinale vloeistofbeweging via injectie van fluorescerende gelabelde moleculen.

Intracisternal injectie van endoxifen in transgene muizen uitdrukken CreER onder de Cx30 promotor13 en een ondoordringbare fluorescerende verslaggever zorgt voor een specifieke recombinatie van leptomeningeal cellen zonder etikettering van de naburige Cx30-uitdrukkende oppervlak en parenchymale astrocyten in de cortex (Figuur 1). Om toegang te krijgen tot de cisterna magna, wordt het verdoofde dier geplaatst met zijn lichaam en zijn ho...

We beschrijven een intracisternalinjectie die een naald gebruikt die aan de punt is gebogen en die kan worden gestabiliseerd aan de schedel, waardoor het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. De aanpak kan worden gebruikt voor genetische lot mapping en manipulaties van leptomeningealcellen en voor het bijhouden van cerebrospinale vloeistof beweging.

Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Onze chirurgische ingreep maakt het mogelijk specifieke genbewerking van leptomeningeale cellen om hun functie te bestuderen in vele fysiologische en pathologische aandoeningen zoals neuroontwikkeling en de verspreiding van bacteriële meningitis. Om schade tijdens de intracisternale levering van endoxifen te minimaliseren, gebruiken we een gebogen naald die tegen de staartrand van de schedel kan worden bevestigd om te voorkomen dat het dieper in het weefsel doordringt. De procedure kan worden gebruikt om de rol van genen die leptomeningeal cellen uitdrukken sonde door verlies en winst van functie-experimenten.Het kan ook worden aangenomen om de cerebrospinale vloeistofstroom te volgen. Visuele demonstratie van deze methode zal zorgen voor een succesvolle identificatie van de injectieplaats voor intracisternale injectie en inzicht in hoe de naald tegen het occipitaal bot te beveiligen. Begin met het voorbereiden van een Hamilton spuit met een 30 meter schuine naald voor injectie.Gebruik tangen om de naald te buigen tot 30 graden drie millimeter van de tip. Vervolgens verdunen endoxifen in 10%DMSO tot een concentratie van 1 milligram per milliliter en de spuit bijvullen. Verdoof het dier in de isoflurane kamer.Stel vervolgens de hoofdhouder van de muis zo in dat het mondstuk ongeveer onder een hoek van 30 graden van het oppervlak van de chirurgische tafel staat en bevestig het hoofd van het dier op de houder. Om de toegankelijkheid van de cisterna magna te verbeteren, plaatst u het lichaam van het dier op ongeveer 30 graden van het oppervlak van de tafel met het hoofd naar beneden gekanteld, waardoor een hoek van 120 graden met de rest van het lichaam wordt bepaald en de achterkant van de nek wordt verlengd om de toegang tot de cisterna magna te vergemakkelijken. Zodra het dier goed is gepositioneerd, breng oogheelkundige zalf, scheer de achterkant van zijn nek, en ontsmet het gebied met alcohol doekjes en Betadine.Gebruik chirurgische schaar om een middellijn incisie te maken vanaf het niveau van het occipitale bot en zich naar achteren uit te breiden. Scheid voorzichtig het oppervlakkige bindweefsel en de nekspieren door zijwaarts van de middellijn te trekken met fijne tip pincet die het oermembraan boven de magna van de stedelingen zal blootstellen. Plaats een kleine chirurgische separator om visualisatie van de cisterna magna gedurende de hele procedure mogelijk te maken.Identificeer het staarteind van het occipitale bot en steek de eerder gebogen naald er onmiddellijk onder. Zodra de dura is geperforeerd, laat de gebogen punt van de naald onder het oppervlak doordringen door de spuit voorzichtig omhoog en parallel aan het lichaam van het dier te trekken, wat een betere stabiliteit garandeert. Injecteer de verbinding langzaam om interferentie met de natuurlijke stroming van hersenvocht te voorkomen.Na de injectie, laat de naald rusten binnen voor een minuut, dan voorzichtig te verwijderen met behulp van fijne tip tangen. Sluit de huid met een paar druppels cyanoacrylaatlijm en breng lokale verdoving aan op de injectieplaats. Haal het dier van de houder en leg het in een schone kooi op een verwarmingskussen.Zorg er dan voor om het dier te controleren totdat het weer bij bewustzijn komt. Intracisternale injectie van endoxifen in transgene muizen uitdrukken CreER onder de Cx30 promotor, een inducible fluorescente reporter zorgt voor een specifieke recombinatie van leptomeningeal cellen zonder etikettering van de naburige Cx30 uitdrukken oppervlak astrocyten en parenchymale astrocyten in de cortex. Dit injectieprotocol maakt gebruik van de fysiologische beweging van het hersenvocht, zodat de endoxifen-oplossing over de subarachnoïdale ruimte wordt verdeeld om leptomeningeale cellen efficiënt te combineren die de refactorische bollen, cortex en cerebellum overlayen.De oplossing gaat niet over de hersenvliesbarrière of komt in contact met astrogliale cellen van de parenchyma in tegenstelling tot systemische toediening via orale gavage. Recombinatie van leptomeningeale cellen na intracisternale injectie werd geïdentificeerd door Pdgfr-alpha reactiviteit, terwijl het oppervlak en parenchymale astrocyten uitdrukken Gfap bleef niet gelabeld. Bij een poging tot dit experiment is het belangrijk om de injectieplaats te vinden voor intracisternale levering.Deze visuele demonstratie biedt de technische knowhow om de procedure uit te voeren en tegelijkertijd het risico op beschadiging van het neurale weefsel eronder te minimaliseren. Genablatiestudies kunnen met deze techniek worden uitgevoerd om de rol van leptomeningeale cellen in corticogenese en regulatie van hersenvochtvorming te onderzoeken en om extra plaatsen te identificeren voor de verspreiding van bacteriën in de subarachnoïdale ruimte.

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Zamboni, M., et al., Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the procedure of delivering an inducer drug into the cisterna magna of an anesthetized mouse. The injection selectively induces fluorescent marker expression in brain surface cells accessible via cerebrospinal fluid, confirmed by fluorescence imaging.

Targeted Drug Delivery in a Mouse Model via Cisterna Magna Injection

In this video, we describe the procedure to deliver human-derived tumor cells into the cisterna magna of a mouse’s brain. The orthotopic mouse model can be used to study metastatic spread of cancer to the cranial meninges.

Surgical Cisterna Magna Injection: A Method for Administering Tumor Cells Directly into Central Nervous System of Murine Model

In this video, we demonstrate the intracisternal delivery of Neisseria meningitidis into a mouse model to generate meningitis infection.

Intracisternal Delivery of Meningococci into Mouse Models to Induce Meningococcal Meningitis

The video demonstrates a method for generating a rat model with widespread cerebral cortical demyelination. This involves disrupting the blood-brain barrier by injecting pro-inflammatory cytokines into mice primed with recombinant myelin sheath protein. This process facilitates the infiltration of immune cells, resulting in widespread cerebral cortical demyelination.

Generating the Widespread Cerebral Cortical Demyelination in a Rat Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

Het hier gepresenteerde protocol maakt de reproductie mogelijk van een wijdverspreide demyelinatie van grijze stof van beide corticale hemisferen bij volwassen mannelijke Dark Agouti-ratten. De methode bestaat uit intracerebrale implantatie van een katheter, subklinische immunisatie tegen myeline oligodendrocyt glycoproteïne en intracerebrale injectie van een pro-inflammatoir cytokinemengsel via de geïmplanteerde katheter.

Rat model van wijdverspreide cerebrale corticale demyelinatie geïnduceerd door een intracerebrale injectie van pro-inflammatoire cytokinen

Hier beschrijven we een methode om meningokokken meningitis te induceren via een intracisternale infectie route bij volwassen muizen. We presenteren een stap voor stap Protocol van meningokokkeninfectie van de bereiding van entmateriaal tot de intracisternale infectie; Noteer vervolgens de overleving van het dier en evalueer de bacteriële ladingen in muriene weefsels.

Inducerende meningokokken meningitis serogroep C in muizen via Intracisternal Delivery

Hier beschrijven we een murine xenograft model dat functioneel lijkt op een Ommaya reservoir bij patiënten. We ontwikkelden de Murine Ommaya om nieuwe therapieën te bestuderen voor de universeel fatale leptomeningeale ziekte.

Een Murine Ommaya Xenograft-model om direct-gerichte therapie van leptomeningeale ziekte te bestuderen

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Het protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tumorcellen via de percutane punctieroute in cisterna magna die leptomeningeale metastase bij muizen robuust induceert, waardoor trauma en extracraniële tumorbelasting worden verminderd.

Minimaal invasief Cisterna Magna-injectiemodel voor onderzoek naar leptomeningeale metastase bij muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om muis meningeale lymfevaten (MLV's) te beoordelen, die een belangrijke rol spelen bij meerdere neurologische aandoeningen. Het doel van dit protocol is het bieden van een geïntegreerde methode die zowel functionele evaluatie van tracerdrainage als gedetailleerde morfologische karakterisering van het dorsale MLV-netwerk mogelijk maakt.

Geïntegreerd protocol voor het beoordelen van meningeale lymfekatica: Cisterna magna-injectie, lymfeklierbeeldvorming, meningeale dissectie en whole-mount kleuring

Leer een intracisternale injectietechniek met een gebogen naald voor precieze genetische manipulatie van leptomeningeale cellen in muizen. Deze methode minimaliseert weefselschade en volgt liquorstroomdynamiek.

Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie

Meer video's verkennen