Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

ICO, of ICO-seq is de eerste aanpassing van high-throughput RNA sequencing aan microben. Deze methode beoordeelde de microbiële functie op genoombrede schaal. Voor gemanipuleerde microben kan deze methode verduidelijken hoe veranderingen in het microbiële genoom de functies ervan kunnen verstoren.

Verkrijg gist uit een suspensiecultuur en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Schort de cellen in PBS opnieuw op bij een concentratie van ongeveer 750.000 cellen per milliliter. Meng vervolgens ultralaag smeltpunt in PBS en verwarm het mengsel op 90 graden Celsius, totdat de agarose smelt.

Laad het agarosemengsel in een spuit, met een bijgevoegd 0,22 micron filter. Plaats een spuitpomp voor een ruimtekachel ingesteld op 80 graden Celsius en plaats de spuit in de pomp. Vul een tweede spuit met de gistsuspensie en vul een derde spuit met gefluoreerde olie, met 2%ionische fluorosurfactant.

Laad beide spuiten in de spuitpompen. Sluit de slang van de spuiten aan op apparaat A.Plaats een 15-milliliter conische buis in een ijsemmer en leid de uitlaatbuizen in de conische buis. Stel de stroomsnelheid voor elke spuit, en verzamel ongeveer een milliliter emulsie in de 15 milliliter conische buis.

Na vijf minuten wachten op de agarose in de buis in te stellen, voeg een gelijk volume van 20%perfluor-octanol in gefluoreerde olie aan de emulsie. Meng de emulsie en de perfluor-octanol door de conische buis een paar keer om te keren. Centrifuge de gebroken emulsie op 2.000 keer G gedurende twee minuten.

Zorg ervoor dat de hydrogels hebben pelleted boven de olie-en PFO-fasen. Verwijder de olie- en PFO-fasen. Voeg twee milliliter tet(W)buffer toe om de hydrogels opnieuw op te schorten.

Breng de suspensie over in een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Centrifuge de buis weer op 2.000 keer G gedurende twee minuten. Verwijder de supernatant en hang de hydrogels opnieuw op in tet(W)again.

Na het spinnen van de hydrogels op 2,000 keer G gedurende twee minuten, opnieuw op te schorten de hydrogels in twee milliliter van gist cultuur medium. Broed de buis 's nachts bij 30 graden Celsius, met schudden. Elke soort groeit in verschillende snelheden.

Het kiezen van een geschikte media- en incubatietijd is essentieel om ervoor te zorgen dat de gist binnen de hydrogel groeit, maar niet overwoekert, wat leidt tot cellen die in de media ontsnappen. Breng de hydrogels eerst over op een conische buis van 15 milliliter. Centrifuge de buis op 2.000 keer G gedurende twee minuten.

Was de hydrogels twee keer met PBS en vervolgens een keer in spheroplasting buffer. Voer een 40x verdunning van spheroplasting enzym in spheroplasting buffer. Voeg vervolgens een milliliter van het verdunde enzym toe aan de hydrogels.

Broed de buis van hydrogels op 37 graden Celsius gedurende een uur. De behandelde gist ziet er transparanter uit. Trek uit de buis met de hydrogelsuspensie 0,8 milliliter van de suspensie van de bodem van de buis en breng deze over op een niet-afgetopte spuit van één milliliter.

Plaats de spuit in de 3D-geprinte spuithouder. Centrifuge de spuit en houder op 2.000 keer G gedurende twee minuten. Zorg er voordat u verder gaat ervoor dat de hydrogels strak aan de onderkant van de spuit worden verpakt.

Plaats 240.000 druppelvormige kralen in een conische buis van 15 milliliter. Centrifuge de buis op 1.000 keer G gedurende een minuut. Verwijder de supernatant, en opnieuw schorsen de kralen in twee milliliter van 0,9x gist lyse buffer, met 500 millimolar natriumchloride.

Steek een roerstaaf en breng de kraalsuspensie over op een spuit van drie milliliter. Bereid een andere spuit, met enkele milliliter PFPE-PEG oppervlakteactieve stoffen in gefluoreerde olie. Verkrijg de eerder bereide spuit van gist kloon verpakt hydrogels.

Evacueer het gedrend hoofd en dop de spuit. Steek de drie spuiten, de hydrogels, de kraalsusopening en de olie in spuitpompen. Sluit de spuiten via buizen aan op apparaat B, het inkapselapparaat.

Plaats het uiteinde van de uitlaatbuizen in een conische buis van 50 milliliter op ijs. Stel de stroomsnelheid voor elke spuit in. Verzamel ongeveer 1.000 milliliter emulsie, of voer het apparaat uit totdat er geen hydrogels meer over zijn.

Volg vervolgens het drop-seq-protocol voor cDNA-synthese, bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Met behulp van een microfluïdisch apparaat werden gistcellen ingekapseld in druppels van 160 micrometer. Een achtvoudige splitter verdeelde deze druppels in acht druppels van 60 micrometer.

's Nachts incubatie resulteerde in isogene gist kolonies groeien binnen een aantal van de hydrogels. Voorafgaand aan het laden van de gist hydrogels in de tweede microfluïde apparaat, werden ze gewassen en ondergedompeld in een oplossing om de celwanden te verteren. De juiste spijsvertering werd geverifieerd door microscopie, met behandelde gistcellen met een meer reflecterende morfologie.

Een stroom van mRNA capture kralen in lysis buffer werd gemengd met een stroom van close-pack gist hydrogels voorafgaand aan de drop-making knooppunt van de tweede microfluïde apparaat. In de resulterende emulsie bevatte ongeveer 10% van de verzamelde druppels één kraal met een lysed kolonie. Deze isogene kolonie sequencing workflow werd gebruikt om de witte ondoorzichtige schakelrespons van C.albicans te analyseren.

Hoofdcomponent, pc, analyse en een tSNE-dimensionaliteitsreductie gaven een algemene overeenstemming aan tussen de voorbeeldgegevensset en een referentiegegevensset. TSNE analyse toonde drie clusters van cellen. Terwijl cluster twee voornamelijk bestond uit cellen uit de steekproefgegevensset, bestonden clusters nul en één uit cellen uit beide monsters.

Overlaying WH11 expressie op de tSNE aangegeven dat cluster een waarschijnlijk witte kolonies bevatte. STF2-expressie toegenomen in cluster één, in overeenstemming met eerder verkregen gegevens. In clusters nul en twee waren WH11 en STF2 aanzienlijk down-regulated in vergelijking met cluster één.

Androgeen microben hebben een steeds groter potentieel om massa produceren biologische geneesmiddelen voor de behandeling van een breed scala van ziekten. Na deze procedure kan men een verscheidenheid aan bio-informaticatools toepassen om de sequencing-gegevens verder te analyseren.