Name: Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer de Acyl-RAC-methode voor detectie van eiwit S-acylatie in diverse biologische monsters. Deze techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere eiwitten mogelijk en verbetert de bestaande detectiemogelijkheden aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies 5R01GM115446 en 1R01GM130840.

Muizen gebruikt in dit protocol werden geëuthanaseerd volgens NIH richtlijnen. Het Comité voor dierenwelzijn van de University of Texas Health Science Center in Houston keurde al het dierenwerk goed.
1. Bereiding van cellysataten
<ol><li>Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in tabel 1. Voeg 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside wasmiddel (DDM) toe en draai om op te lossen tot 10 mL PBS. Voeg 100 μL fosforremmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) en proteaseremmercocktail (1x) toe en koel de buffer voor gebruik op ijs.</li>
	<li>Breng de vereiste media met cellen uit de couveuse over in conische buizen van 15 mL of 50 mL en spincellen op 350 x g gedurende 5 min en aangezogen om zich te ontdoen van elk celpuin. OPMERKING: We gebruikten 1 x 107 cellen voor elke acyl-RAC reactie die moest worden uitgevoerd.</li>
	<li>Was de pellet door het opnieuw op te schorten in 5 mL PBS en te spinnen op 350 x g gedurende 5 min. OPMERKING: Voer stap 1.3 snel uit om cellyse te voorkomen als gevolg van langdurige incubatie in PBS.</li>
	<li>Voeg 600 μL lysisbuffer bereid in stap 1.1 toe aan de pellet en lyse door te schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker gedurende 30 min bij 4 °C.</li>
	<li>Duidelijk lysates door centrifugering bij 20.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min tot pellet wasmiddel-onoplosbare materialen. Verzamel gerooide lysate in voorgekoelde 1,5 mL microfuge buizen en houd ze op ijs.</li>
	<li>Voer een Bradford / BCA test uit om de eiwitconcentratie te schatten. Het is van cruciaal belang om dezelfde hoeveelheid eiwit te garanderen in verschillende monsters voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Wij raden aan om minstens 500 μg eiwit per reactie te gebruiken. OPMERKING: In de beschreven experimenten gebruikten we gekweekte (Jurkat) cellen en primaire splenocyten uit muizenweefsel. De hierboven beschreven lysismethode kan ook worden gebruikt voor andere celtypen. De gemiddelde eiwitconcentratie voor bovengenoemde celtypen is ongeveer 500 μg per 1 x 107 cellen. Jurkatcellen werden gehandhaafd in RPMI-1640 medium dat is aangepast tot 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 4.500 mg/L glucose en 1.500 mg/L natriumbicarbonaat aangevuld met 10% FBS bij 37 °C met 5% CO2. We gebruikten 1 x 107 Jurkat cellen per reactie. Primaire splenocyten werden geïsoleerd van muis miltweefsel zoals beschreven26. Kortom, miltweefsel werd gemacereerd op ijs, gevolgd door lyse van erythrocyten in hypotonische oplossing en scheiding van de lymfocyten door centrifugatie. We gebruikten 1 x 107 primaire cellen per reactie.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Blokkeren van vrije thiolgroepen
LET OP: Alle volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).
<ol><li>Breng lysate in een verse 1,5 mL microfuge buis en voer chloroform-methanol (CM) neerslag zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Voeg methanol (MeOH) en chloroform (CHCl3)toe aan het lysaat bij een eindverhouding van lysaat: MeOH: CHCl3 van 2:2:1 en schud krachtig om een homogene suspensie te creëren.</li>
		<li>Draai op 10.000 x g gedurende 5 min om een pellet ("pannenkoek") te vormen in de interfase tussen waterige en organische fasen.</li>
		<li>Kantel de buis en zuig zoveel mogelijk oplosmiddel en een naald of een gellaadtip.</li>
		<li>Laat de eiwitpellet een paar minuten drogen en was het voorzichtig door 600 μL MeOH toe te voegen en voorzichtig te mengen om te voorkomen dat de pellet wordt afgebroken</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de resterende MeOH en droog de eiwitpellet op een benchtop gedurende ongeveer 5 minuten.</li>
		<li>(Optioneel) Voer een extra centrifugatiestap uit om een afgebroken pellet na de MeOH-wasbeurt te laten lopen om verlies van monster te voorkomen. OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na de CM-neerslagstap. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.<ol>
<li>Los de eiwitpellet op in 200 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet is opgelost.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Optioneel) Incubeer voor een extra 5-10 min in een sonicerend waterbad om de pellet op te lossen. LET OP: De lengte van de sonicatie varieert afhankelijk van de oplosbaarheid van het materiaal. Langdurige sonicatie kan echter eiwitafbraak veroorzaken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid 0,2% methylmethaanthiosulfonaat (MMTS) (v/v) voor in 2SHB door 2 μL MMTS toe te voegen aan 998 μL 2SHB-buffer. LET OP: Gebruik vers bereide 0,2% MMTS voor elk experiment.</li>
	<li>Voeg 200 μL van 0,2% MMTS in 2SHB toe aan elke buis tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% MMTS. Incubeer gedurende 15 min bij 42 °C met schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker.</li>
</ol>3. Acyl-RAC: Hydroxylamine (HAM) decolleté en vangst van S-acylated eiwitten
<ol><li>Herhaal 3-4x CM neerslag zoals hierboven beschreven om MMTS te verwijderen. Verwijdering van MMTS kan worden geschat door het ontbreken van verschillende geur van MMTS. Los na elke neerslag de pellet op in 100 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet oplost en verdun dan met 300 μL buffer A.</li>
	<li>Los na de laatste neerslag monsters op in 200 μL 2SHB-buffer zoals hierboven beschreven en verdun met 240 μL buffer A.</li>
	<li>In het geval van het vergelijken van veranderingen in S-acylation in reactie op verschillende behandelingsvoorwaarden, meet u de eiwitconcentratie opnieuw en gaat u verder met een gelijke hoeveelheid eiwit voor elke aandoening.</li>
	<li>Bewaar 40 μL van elk monster als invoerregeling.</li>
	<li>Splits monsters in twee gelijke delen van 200 μL en markeer buizen als "+ HAM" en "- HAM". Voeg 50 μL vers bereide neutrale 2 M HAM (pH 7,0-7,5) toe aan een eindconcentratie van 400 mM aan een van de buizen (+ HAM) en 50 μL neutrale 2 M NaCl aan de tweede buis (- HAM), die zal worden gebruikt als een negatieve controle. Ga over tot toevoeging van thiopropyl-Sepharose (TS) kralen. OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na een van de CM-neerslagstappen. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C. Neutrale pH van 2 M HAM zorgt voor de selectiviteit van de acyl-cysteïne thioester binding en moet zorgvuldig worden aangepast. Bij het hanteren van monsters in de 2SHB-buffer moet worden opgelet om verlies van monster als gevolg van overmatig schuimvorming te voorkomen. Alle volgende stappen zijn identiek voor - HAM en + HAM monsters.</li>
	<li>Voeg 30 μL TS-kraaldrijfmest toe aan elke buis en draai de buizen 1-2 uur bij RT.</li>
	<li>Was de TS kralen 4x met 1% SDS in Buffer A om resterende HAM te verwijderen.<ol>
<li>Draai voorzichtig alle kraalmonsters met behulp van een microfuge voor 1 min en voorzichtig aanzuigen de supernatant.</li>
		<li>Hang de kralen opnieuw op in 500 μL of 1% SDS in Buffer A.</li>
		<li>Herhaal stap 3.7.1–3.7.2 driemaal. LET OP: Geactiveerde thiopropyl-Sepharose (TS) wordt gevriesdroogd in aanwezigheid van additieven die vóór de koppeling bij neutrale pH moeten worden weggespoeld. Gedestilleerd water wordt aanbevolen voor zwelling en wassen. Weeg 0,1 g kralen en resuspend in 1 mL van gedestilleerd water en laat het zwellen tijdens het draaien gedurende 30 min-1 uur bij RT. Was kralen 1x met buffer A en bereid een drijfmest met buffer A, in een verhouding van 50% geregeld medium tot 50% buffer. Gezwollen TS kan worden opgeslagen bij neutrale pH in aanwezigheid van 20% ethanol bij 4 °C tot een week. Gebruik natriumazide niet als bacteriostatisch middel, omdat azide-ionen reageren met de 2-pyridyldisulfidegroepen. Voor een hogere efficiëntie, bereiden verse kralen. Tijdens het hanteren van de kralen kan de punt van een P200 pipettip iets worden gesneden om schade te voorkomen. LET OP: Het experiment kan worden gestopt in elk stadium na CM neerslag. De pellet mag tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elutie en detectie van S-acylated eiwitten
<ol><li>Na de laatste wasbeurt, voorzichtig spin de kralen zoals hierboven beschreven en aanzuigen zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.</li>
	<li>Herstel de eiwitten uit kralen met 4x SDS monsterbuffer met DTT.<ol>
<li>Voeg 50 μL 4x SDS monsterbuffer toe aan de kralen en incubeer bij 80 °C, 1500 tpm gedurende 15 min in een thermische shaker. Laat de buizen afkoelen.</li>
		<li>Centrifugeer de kralen op 5.000 x g gedurende 3 min om de kralen volledig te pelleten en de geëlute eiwitten over te brengen naar een verse buis van 1,5 mL met behulp van een gellaadtip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer SDS-PAGE uit en analyseer S-acylation van het eiwit(en) van belang door westerse blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier hebben we met succes gebruik gemaakt van de acyl-RAC test om S-acylation van geselecteerde eiwitten te detecteren in zowel gekweekte menselijke cellen en primaire cellen afgeleid van muisweefsel. Deze methode is eenvoudig, gevoelig, en kan gemakkelijk worden uitgevoerd met minimale apparatuur eisen met behulp van standaard biochemie technieken. Deze methode is aangetoond dat het met succes nieuwe S-acylated eiwitten te identificeren, zoals de β-subeenheid van het eiwit translocating systeem (Sec61b),Sriboso...

S-acylation is een omkeerbare posttranslationele modificatie waarbij een vetacylketen wordt toegedeeld aan een intern cysteïneresidu op een doeleiwit via een labiele thioesterbinding1. Het werd voor het eerst gemeld als een wijziging van eiwitten met palmitaat, een verzadigd 16-koolstofvetzuur2, en daarom wordt deze wijziging vaak aangeduid als S-palmitoylation. Naast palmitaat kunnen eiwitten omkeerbaar worden gewijzigd door een verscheidenheid aan langere en kortere verzadigde (myristaat en stearate), enkelvoudig onverzadigd (oleaat) en meervoudig onverzadigd (arachidonaat en eicosapentanoaat) vetzuren3,4,5,6,7. In eukaryotische cellen wordt S-acylation gekatalyseerd door een familie van enzymen die bekend staan als DHHC-eiwitacyltransferases en de omgekeerde reactie van cysteinedeacylation wordt gekatalyseerd door eiwitthioesterases, waarvan de meeste nog steedsraadselachtig8 blijven.
De laaitbaarheid van de thioesterbinding maakt deze lipidemodificatie omkeerbaar, waardoor het eiwitclustering, plasmamembraanlokalisatie, intracellulaire handel, eiwit-eiwitinteracties en eiwitstabiliteit9,10kandynamisch reguleren. Bijgevolg is S-acylation gekoppeld aan verschillende aandoeningen, waaronder de ziekte van Huntington, de ziekte van Alzheimer en verschillende vormen van kanker (prostaat, maag, blaas, long, colorectale), die de ontwikkeling van betrouwbare methoden om deze post-translationele eiwitmodificatie te detecterenvereist 11.
Metabolische etikettering met radioactief ([3H], [14C] of [125I]) palmitaat was een van de eerste benaderingen ontwikkeld om testeiwit S-acylation12,13,14. Echter, radiolabeling-gebaseerde methoden presenteren gezondheidsproblemen, zijn niet erg gevoelig, tijdrovend, en alleen detecteren lipidatie van zeer overvloedige eiwitten15. Een sneller en niet-radioactief alternatief voor radiolabeling is metabolische etikettering met bioorthogonale vetzuursondes, die routinematig wordt gebruikt om de dynamiek van eiwit S-acylation16te assay. Bij deze methode wordt een vetzuur met een chemische reporter (alkyne of azidegroep) door een eiwit acyltransferase in het S-acylated eiwit verwerkt. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reactie (klik chemie) kan vervolgens worden gebruikt om een gefunctionaliseerde groep, zoals een fluoroftaan of biotine, hechten aan het geïntegreerde vetzuur waardoor detectie van de S-acylated eiwit17,18,19.
Acyl-biotine uitwisseling (ABE) is een van de veel gebruikte biochemische methoden voor het vangen en identificeren van S-acylated eiwitten die een aantal van de tekortkomingen van metabole etikettering omzeilt, zoals ongeschiktheid voor weefselmonsters15. Deze methode kan worden toegepast voor de analyse van S-acylation in een breed scala van biologische monsters, waaronder weefsels en diepgevroren celmonsters20,21. Deze methode is gebaseerd op selectieve decolleté van de thioesterbinding tussen de acylgroep en het cysteïneresidu door neutrale hydroxylamine. De bevrijde thiolgroepen worden vervolgens gevangen met een thiol-reactief biotinederivaat. De gegenereerde bioatlateeiwitten worden vervolgens affiniteitgezuiverd met streptavidinaaga en geanalyseerd door immunoblotting.
Een alternatieve aanpak genoemd acyl-hars bijgestaan vangen (Acyl-RAC) werd later geïntroduceerd om de biotinylation stap te vervangen door directe vervoeging van vrije cysteïnedoor een thiol-reactieve hars22,23. Deze methode heeft minder stappen in vergelijking met ABE en kan op dezelfde manier worden gebruikt om eiwit S-acylation te detecteren in een breed scala van monsters1.
Acyl-RAC bestaat uit 4 hoofdstappen (figuur 1), 1. Blokkering van vrije thiolgroepen; 2. Selectieve splitsing van de cysteïne-acylthioesterbinding met neutrale hydroxylamine (HAM) om cysteïnethiolgroepen bloot te leggen; 3. Het vastleggen van de lipide cysteïnen met een thiol-reactieve hars; 4. Selectieve verrijking van de S-acylated eiwitten na elutie met reducerende buffer.
De gevangen eiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunoblotting of onderworpen aan massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics om het S-acylated proteome te beoordelen in een gevarieerd scala van soorten en weefsels22,24,25. Individuele S-acylation sites kunnen ook worden geïdentificeerd door trypsine vertering van de gevangen eiwitten en analyse van de resulterende peptiden door LC-MS/MS22. Hier laten we zien hoe acyl-RAC kan worden gebruikt voor gelijktijdige detectie van S-acylation van meerdere eiwitten in zowel een cellijn als een weefselmonster.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini tube rotator</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonics Quantrex Sonicator</td><td>L &amp; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van eiwit s-acylation met behulp van acyl-hars assisted capture

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Eiwit S-acylation, ook wel S-palmitoylation genoemd, is een omkeerbare posttranslationele modificatie van cysteïneresten met lange-keten vetzuren via een labiele thioesterbinding. S-acylation, die in opkomst is als een wijdverbreid regelgevend mechanisme, kan bijna alle aspecten van de biologische activiteit van eiwitten moduleren, van complexe vorming tot eiwithandel en eiwitstabiliteit. De recente vooruitgang in het begrijpen van de biologische functie van eiwit S-acylation werd grotendeels bereikt door de ontwikkeling van nieuwe biochemische instrumenten waardoor robuuste en gevoelige detectie van eiwit S-acylation in een verscheidenheid van biologische monsters. Hier beschrijven we acyl hars-ondersteunde vangst (Acyl-RAC), een recent ontwikkelde methode gebaseerd op selectieve vangst van endogene S-acylated eiwitten door thiol-reactieve Sepharose kralen. In vergelijking met bestaande benaderingen vereist Acyl-RAC minder stappen en kan het betrouwbaardere resultaten opleveren in combinatie met massaspectrometrie voor de identificatie van nieuwe S-acylation-doelen. Een belangrijke beperking in deze techniek is het gebrek aan vermogen om onderscheid te maken tussen vetzuursoorten die via dezelfde thioesterbinding aan cysteïnes zijn verbonden.

Naar aanleiding van het hierboven beschreven protocol, gebruikten we eerst acyl-RAC om tegelijkertijd s-acylation van verschillende eiwitten in Jurkat cellen te detecteren, een vereeuwigde T-cellijn oorspronkelijk afgeleid van het perifere bloed van een T-cel leukemie patiënt27. Regulerende T-celeiwitten die eerder als S-acylated9,28,,29 werden geïdentificeerd om het nut van deze methode aan te tonen. Zoa...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.

Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-hars assisted capture of Acyl-RAC is een gevoelige en betrouwbare methode die kan worden gebruikt om eiwit S-acyleratie te detecteren in een verscheidenheid van biologische monsters. Dit protocol omzeilt enkele van de beperkingen van metabole etikettering en radio-etikettering, en maakt de gelijktijdige detectie van S-acylation van meerdere eiwitten. Niet alleen levende cellen, maar ook primaire weefsels en bevroren monsters.S-acylation kan een verscheidenheid aan cellulaire processen reguleren, zoals eiwithandel, plasmamembraantargeting, signaaltransductie, ijzertransport en eiwit-eiwitinteracties. Het is belangrijk om vers bereide hydroxylamineoplossing met zorgvuldig afgestelde pH voor elk experiment te gebruiken om een efficiënt en specifiek decolleté van de thioesterbinding te garanderen. Met een demonstratie van deze methode is het van cruciaal belang voor stappen zoals chloroform, methanol neerslag.De pannenkoek vorm pellet verkregen tijdens deze stap moet zeer zorgvuldig worden verwerkt. Het kan kwetsbaar zijn en gedeeltelijk verlies van het monster tijdens de stap kan leiden tot ongelijke monsterterugwinning. Het aantonen van de procedure zal Savannah West zijn, een afgestudeerde student van ons laboratorium.Om cellysates te verkrijgen, verzamel je de cellen van belang in een conische centrifugebuis. En verwijder elk celpuin door centrifugatie. Was de pellet in 5 milliliter PBS.En onmiddellijk resuspend de cellen in 600 microliters van vers bereide lyse buffer. Roer het monster op 1,500 omwentelingen per minuut in een thermoshaker gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voor het opruimen van de lysaten, pellet wasmiddel en oplosbaar materiaal door centrifugatie.Verzamel aan het einde van de centrifugatie het gerooide lysaat in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs. En voer een Bradford of bicinchoninic zuur test om de eiwitconcentratie te schatten volgens standaard protocollen. Voeg methanol en chloroform toe om te lyseren bij een verhouding van 2:1.Schud rigoureus om een homogene suspensie te creëren en centrifugeert het monster om een eiwitpellet te verzamelen op de interface tussen de waterige en organische fasen. Kantelen van de buis, gebruik een naald of een gel laadpunt om zo veel oplosmiddel mogelijk te aspireren. De lucht droogt de eiwitkorrel een paar minuten.Voordat u de inhoud van de buis voorzichtig mengt met 600 microliters methanol, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt afgebroken. Na het zorgvuldig verwijderen van de methanol was, droog de eiwitpellet op een bankblad gedurende ongeveer vijf minuten. Vervolgens, resuspend de eiwitpellet in 200 microliters van 2SHB buffer.En vortex bij 42 graden Celsius en 1.500 omwentelingen per minuut in een thermoshaker. Wanneer de pellet is opgelost, voeg 200 microliter van 0,2%MMTS in 2SHB aan het monster. En het eiwit 15 minuten uitbroeden bij 42 graden Celsius en 1.500 omwentelingen per minuut in een thermoshaker.Voer aan het einde van de incubatie 3:4 chloroform-methanolneerslag uit, zoals aangetoond. Los de pellet op in 100 microliter verse 2SHB buffer met vortexing om de MMTS te verwijderen. En verdun het monster met 300 microliters buffer A na elke neerslag.Los na de uiteindelijke neerslag de monsters op in 200 microliter van 2SHB-buffer en verdun met 240 microliters buffer A.Meet de eiwitconcentratie opnieuw en zet een 40 microliter van elk monster opzij als inputcontroles. Splits monsters op in twee gelijke volumes van 200 microliters. En markeer de buizen als plus hydroxylamine en minus hydroxylamine.Voeg 50 microliter vers bereide neutrale twee molaire hydroxylamine toe aan een uiteindelijke concentratie van 400 millimolar aan de plus hydroxylaminebuis. En 50 microliters van neutrale twee molaire natriumchloride aan de negatieve controle, een minus hydroxylamine buis. Voeg vervolgens 30 microliter TS-kraaldrijfmest toe aan elke buis.En draai de buizen voor een tot twee uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatiewas de kralen vier keer met 1%SDS in buffer A om eventuele resterende hydroxylamine te verwijderen. Na de laatste wasbeurt, was alle kraal monsters met drie zachte microcentrifugations van een minuut.Zorgvuldig aspirating de supernatants en resuspending de kralen in 500 microliters van 1%SDS in buffer A bij elke wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, voorzichtig spin vaststelling van de kralen zoals aangetoond. En aspirate zo veel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.Om de eiwitten uit de kralen te herstellen, voeg 50 microliter van 4%SDS monsterbuffer toe aan elke buis en broed de monsters uit bij 80 graden Celsius en 1, 500 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten in een thermoshaker. Laat de monsters aan het einde van de incubatie afkoelen voordat u centrifugeert om de kralen volledig te pelleteren. Gebruik vervolgens een gel laadtip om de eluted eiwitten over te brengen in nieuwe 1,5 milliliter buizen.En voer de monsters uit op een SDS-PAGE gel om de S-acylation van de eiwitten van belang door westerse blotting te analyseren. Tyrosine kinase Lck kan worden gedetecteerd in lysates behandeld met neutrale twee molaire hydroxylamine. om de thioesterband tussen cysteïneresten en de vetzuurmoiety te splijten.Strippen en reprobing met antilichamen tegen eiwitten Fyn en LAT tonen aan dat acyl-hars ondersteunde capture assay kan worden gebruikt om S-acylation van meerdere eiwitten tegelijkertijd te analyseren. Bovendien kan S-acylation van Lck, Fyn en LAT gemakkelijk worden gedetecteerd in primaire muisspuitocyten. Wat aangeeft dat deze wijziging wordt bewaard tussen twee soorten.Naast de identificatie van nieuwe S-acylated eiwitten, kan deze methode ook worden gebruikt om veranderingen in eiwit S-acyleratie onder verschillende biologische omstandigheden te beoordelen. Het aantal nieuw geïdentificeerde S-acylated eiwitten is enorm toegenomen na de dubbele up betekende een snelle, en betrouwbare techniek zoals Acyl-RAC. Naast de identificatie van nieuwe S-acylated eiwitten, kan deze methode ook worden gebruikt om veranderingen in eiwit S-acyleratie onder verschillende biologische omstandigheden te beoordelen.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Dit protocol beschrijft de vereiste stappen om in vitro en in vivo deacetyleringsassays uit te voeren om de rol van eiwitten als specifieke deacetyleringssubstraten voor sirtuïnen vast te stellen en verder de rol van omkeerbare - lysine acetylering als een post-translationele modificatie te bestuderen.

Deacetylering Testen om de wisselwerking tussen Sirtuins (SIRT2) en specifiek eiwit-substraten Ontrafel

We beschrijven een methode voor het genereren van lokalisatie- en affiniteitszuivering (LAP)-getagde inductible stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, ruimtelijk-tijdelijke subcellulaire lokalisatie en eiwit-eiwit interactie netwerken.

Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Leer de Acyl-RAC-methode voor detectie van eiwit S-acylatie in diverse biologische monsters. Deze techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere eiwitten mogelijk en verbetert de bestaande detectiemogelijkheden aanzienlijk.

Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

Meer video's verkennen