Name: Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Leer de APEGS-assay voor kwantitatieve analyse van palmitoylering in hersenmembraaneiwitten van muizen. Deze methode vereist geen affiniteitszuivering en gebruikt gelmobiliteit voor detectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken K. Woolfrey voor advies en input op de APEGS-test. Deze studies werden gefinancierd door onderzoekssubsidies aan E.D. van de Whitehall Foundation en de NIH-NIMH (1R01MH119347).

Alle dierlijke procedures gevolgd richtlijnen uiteengezet door de National Institutes of Health (NIH) en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Californië, Davis.
1. Voorbereiding van muishersenmembranen
<ol><li>Onthoofd de muis met behulp van een guillotine-apparaat en ontleed de hersenen snel (in <1 min, indien mogelijk, om palmitoylation veranderingen die kunnen optreden tijdens dissectie procedure te minimaliseren). Homogeniseer onmiddellijk in 10 mL homogenisatiebuffer(tabel 1)in een glazen homogenisator (~12 slagen) op ijs.</li>
	<li>Centrifugelysats gedurende 15 min bij 1.400 x g bij 4 °C. Breng de supernatant over op een nieuwe buis op ijs. De pellet (~ 6 slagen) opnieuw opschorten in een gelijk volume homogenisatiebuffer en centrifugeren op 710 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Combineer de supernatants uit stap 1.2 en centrifugeer op 40.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi de supernatant (cytosolic fractie) weg en storing de gepelleteerde membraan (P2) fractie opnieuw op in homogenisatiebuffer. OPMERKING: Monsters kunnen worden flash frozen en opgeslagen bij -80 °C voor later gebruik.</li>
	<li>Voer een bicinchoninezuur (BCA) test uit om eiwitniveaus te kwantificeren. Begin voor de APEGS-test met ~100−200 mg eiwit (maximaal 250 mg) in een volume van 470 μL buffer A (tabel 1) in een buis van 1,5 mL. Sonicaat en centrifugeer bij >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C om onoplosbaar eiwit te verwijderen. Breng solubilized eiwit over op een nieuwe buis van 1,5 mL.</li>
</ol>2. Acyl-PEGyl exchange gel-shift (APEGS) test
<ol><li>Verstoor disulfidebindingen en blokkeer vrije cysteïnen.<ol>
<li>Disulfide-bindingen verstoren door incubatie in 25 mM tris(2-carboxyethyl)fosphine (TCEP; 25 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) gedurende 60 min bij 55 °C.</li>
		<li>Blokvrije cysteïnen met 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12,5 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. LET OP: De reactie kan 's nachts worden verlengd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer chloorvorm methanol (CM) neerslag uit.<ol>
<li>Breng de eiwitoplossing van 1,5 mL buis naar een polypropyleen of glazen buis die kan worden gecentrifugeerd in een swingende emmer rotor op bescheiden snelheid. Een 5 mL buis is ideaal. Voeg kort vier volumes (2 mL) methanol (MeOH) en vortex toe.</li>
		<li>Voeg twee volumes (1 mL) chloroform en vortex kort toe.</li>
		<li>Voeg kort drie volumes (1,5 mL) dH2O en vortex toe.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters op 3.000 x g gedurende 30 min bij 25 °C in een slingerende emmerrotor.</li>
		<li>Verwijder en gooi de bovenste fase voorzichtig weg.</li>
		<li>Voeg 3 volumes (1,5 mL) van MeOH toe en meng voorzichtig maar grondig, wees voorzichtig om de ondoorzichtige eiwitpannenkoek niet te fragmenteren.</li>
		<li>Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C in een slingerende emmerrotor.</li>
		<li>Met behulp van een glazen serologische pipet, verwijder zoveel mogelijk van de bovenste fase mogelijk zonder verstoring van de eiwitpannenkoek.</li>
		<li>Spoel de pellet voorzichtig af met 1 mL MeOH.</li>
		<li>Laat de pellet minstens 10 min drogen. LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer decolleté van palmitoyl-thioester verbindingen uit met hydroxylamine (NH2OH, HAM).<ol>
<li>Resuspendeer eiwitneerslag in 125 μL buffer A en sonicaat kort. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Breng solubilized eiwit over op een nieuwe buis van 1,5 mL.</li>
		<li>Voeg 375 μL buffer H (HAM+; Tabel 1) of buffer T (HAM-; Tabel 1) en incubeer monsters gedurende 60 min bij 25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal de CM-neerslag beschreven in stap 2.2. LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C.</li>
	<li>Voeg mPEG toe aan onbeschermde cysteïnen.<ol>
<li>Resuspend pellet in 100 μL buffer A met 10 mM TCEP. Overzetten naar een buis van 1,5 mL. OPMERKING: Het is normaal dat er significant eiwitverlies is opgetreden tijdens cm-neerslagstappen. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een buis van 1,5 mL, waardoor het volume eiwit wordt beperkt tot een maximum van ~120−130 μL. Dit vermindert eiwitverlies tijdens de uiteindelijke CM neerslag.</li>
		<li>Voeg 20 mM mPEG-5k (25 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) eiwitmonster en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 60 min bij 25 °C met end-over-end rotatie.</li>
		<li>Om mPEG-5k zonder rechtspersoonlijkheid te verwijderen, voert u CM-neerslag uit zoals beschreven in stap 2.2 met behulp van deze aangepaste volumes: 4 volumes MeOH (500 μL), 2 volumes chloroform (250 μL) en 3 volumes dH2O (375 μL). Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de bovenste fase als voorheen, het vermijden van de dikke, flocculente pannenkoek. Voeg 1 mL MeOH toe en meng voorzichtig maar grondig. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C.</li>
		<li>Verwijder de supernatant voorzichtig en spoel de pellet af met 1 mL MeOH. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C. Lucht droge pellet. LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C.</li>
		<li>De gedroogde pellet opnieuw opschorten in 50 μL buffer A (zonder TCEP of een reducerend middel). Reserveer 5 μL voor BCA eiwitkwantitatie. Voeg na de kwantificering een geschikte hoeveelheid 4x Laemmli-monsterbuffer toe en verwarm, afhankelijk van het eiwit van belang, het monster mogelijk tot 70−100 °C gedurende 10 min. OPMERKING: Koken kan aggregatie van sommige membraaneiwitten veroorzaken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Westerse vlekanalyse van PEGylated eiwitten
<ol><li>Laad het monster op een natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) gel13. OPMERKING: In dit protocol werd 10% polyacrylamide gebruikt.</li>
	<li>Gebruik standaard scheidings-, overdrachts- en detectieprotocollen voor western blotting14.</li>
	<li>Gebruik densitometry14 om de relatieve hoeveelheden PEGylated versus nonPEGylated eiwitten te bepalen.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In ons vorige werk gebruikten we de ABE-test om aan te tonen dat SynDIG1 palmitoylated is op twee geconserveerde nevenprovliecys-residuen (gevonden in alle SynDIG-eiwitten) op een activiteitsafhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie en functie te reguleren6. Een beperking is dat de ABE-test affiniteitszuivering vereist met agaroseharsen die tot avidin moieties worden vervoegd als de laatste stap in de procedure, wat resulteert in een aanzienlijk verlies van signaal dat kwantitatieve analyse ...

S-palmitoylation is een omkeerbare post-translationele modificatie van doeleiwitten die stabiele membraanassociatie, eiwithandel en eiwit-eiwitinteracties reguleert1. Het gaat om toevoeging van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïne residuen via thioester linkage gekatalyseerd door palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymen. Veel synaptische eiwitten in de hersenen zijn palmitoylated, met inbegrip van AMPA-R's en PSD-95, op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie, en functie2te reguleren,3,4. Veranderingen in de niveaus van synaptische AMPARs in de PSD via interactie van hulpfactoren met synaptische steigers zoals PSD-95 liggen ten grondslag aan synaptische plasticiteit; methoden om de palmitoylation-toestand van synaptische eiwitten te bepalen, bieden dus belangrijk inzicht in mechanismen van synaptische plasticiteit.
Eerder identificeerden we de SynDIG-familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs5. Overexpressie of knock-down van SynDIG1 in gescheiden rat hippocampal neuronen neemt toe of vermindert, respectievelijk, AMPA-R synapsgrootte en aantal met ~ 50% zoals gedetecteerd met behulp van immunocytochemie en elektrofysiologie5. We gebruikten de acyl-biotine uitwisseling (ABE) test om aan te tonen dat SynDIG1 is palmitoylated op twee geconserveerde nevennoa-transmembraan Cys residuen (gevonden in alle SynDIG eiwitten) op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit te reguleren, lokalisatie, en functie6. De ABE-test is gebaseerd op de uitwisseling van biotine op cysteïnen beschermd door modificatie en daaropvolgende affiniteitzuivering7. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische aanpak, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test8,9,10,11,12, die geen affiniteit zuivering vereist en in plaats daarvan maakt gebruik van veranderingen in gel mobiliteit om het aantal wijzigingen voor een eiwit van belang te bepalen. Het protocol wordt beschreven voor onderzoek naar endogene membraaneiwitten uit muizenhersenen waarvoor geschikte antilichamen beschikbaar zijn.

<table><tbody><tr><td>Hydroxylamine (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>of equivalent materiaal</td></tr><tr><td>N-ethylmalemide (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Zeer giftig.</td></tr><tr><td>Optical imager voor densitometrie</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>of equivalent materiaal</td></tr><tr><td>Polypropyleen buisjes met dop</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten (glas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>of equivalent materiaal</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)fosfine-hydrochloride (TCEP)</td><td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van brain membrane eiwitten

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activiteitsafhankelijke veranderingen in de niveaus van synaptische AMPA-receptoren (AMPARs) binnen de postsynaptische dichtheid (PSD) wordt beschouwd als een cellulair mechanisme voor leren en geheugen. Palmitoylation regelt lokalisatie en functie van vele synaptische eiwitten, waaronder AMPA-R's, hulpfactoren en synaptische steigers op een activiteitsafhankelijke manier. We identificeerden de synapsdifferentiatie geïnduceerde gen (SynDIG) familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs en synapssterkte reguleren. SynDIG1 is palmitoylated bij twee cysteïneresiduen die zich op posities 191 en 192 in het nevenxta-transmembraangebied bevinden dat belangrijk is voor activiteitsafhankelijke excitatory synapsenontwikkeling. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van elk eiwit van belang te onderzoeken en het nut ervan aan te tonen met de SynDIG familie van eiwitten in muis hersenen lysaten.

Immunoblotting met antilichamen tegen het eiwit van belang onthult de palmitoylated staat (niet, afzonderlijk, dubbel, enz.) in muis hersenen lysaten zoals bepaald door mobiliteit verschuiving in vergelijking met monsters waarin HAM niet was opgenomen. Eerder hadden we aangetoond dat SynDIG1 was palmitoylated op twee locaties met behulp van de ABE test6; we konden echter niet bepalen of beide sites werden gewijzigd in hersenweefsel. Hier laten we zien dat SynDIG1, ...

Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Deze biochemische methode maakt het mogelijk om de palmitoylation-toestand te bepalen van elk membraaneiwit uitgedrukt in de hersenen waarvoor een geschikt antilichaam beschikbaar is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen affiniteitszuivering vereist en in plaats daarvan veranderingen in gelmobiliteit gebruikt om het aantal wijzigingen van een eiwit van belang te bepalen. Na het ontleden van de hersenen, homogeniseren het onmiddellijk in 10 milliliter van homogeneisatie buffer in een glas homogenisator op ijs.Met behulp van ongeveer 12 slagen, centrifuge de lysates gedurende 15 minuten op 1400 keer G, en vier graden Celsius. Breng de supernatant naar een nieuwe buis op ijs. Resuspend de pellet in 10 milliliter van homogeneisatie buffer.Homogeniseren met ongeveer zes slagen. Centrifuge de suspensie op 710 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Combineer de supernatants en centrifuge ze op 40,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Gooi de supernatant weg en zet de gepelde membraanfractie opnieuw op in een homogeneisatiebuffer door de pellet op te breken met een pipetpunt en op en neer te pipetten. Voer ABCA-test uit op kwantitate eiwitniveaus. Om de APEGS-test uit te voeren, plaatst u 470 microliter buffer A in een buis van 1,5 milliliter en voegt u ongeveer 100 tot 200 milligram eiwit toe.Soniceer de buis en scheid vervolgens het onoplosbare eiwit door de buis te centrifugeren bij 25 graden Celsius en minimaal 13.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng het gesaneerde eiwit over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Verstoor eerst de disulfidebindingen door het gesaneerde eiwit in 25 microliter van TCEP gedurende 60 minuten bij 55 graden Celsius uit te broeden.Blokkeer vervolgens gratis cysteines door de oplossing uit te broeden met 12,5 microliter van de voorraadoplossing van NEM gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Begin vervolgens met het proces van chloroforme methanolneerslag. Breng de eiwitoplossing van de buis van 1,5 milliliter over naar een polypropyleen of glazen buis die met een bescheiden snelheid in een swingende emmerrotor kan worden gecentrifugeerd.Voeg twee milliliter methanol en vortex kort. Voeg een milliliter chloroform en vortex kort. Voeg vervolgens 1,5 milliliter gedeïsized water en vortex kort weer.Keer indien nodig de buis om om een grondige menging te garanderen. Centrifugeren de monsters op 3000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 30 minuten in een swingende emmer rotor. Verwijder en gooi de bovenste fase van de oplossing voorzichtig in een buis.Voeg 1,5 milliliter methanol toe. Meng zachtjes maar grondig door zachte omkering van de buis, voorzichtig niet te fragmenteren de ondoorzichtige eiwit pannenkoek. Centrifugeren het monster op 3000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten in een swingende emmer rotor.Verwijder met behulp van een glazen serologische pipet zoveel mogelijk van de bovenste fase van de oplossing zonder de eiwitpannenkoek te verstoren. Spoel de pellet voorzichtig af met een milliliter methanol en laat deze minstens 10 minuten aan de lucht drogen. Met de chloroforme methanol neerslag compleet, begin het decolleté van de palmitoyl thioester koppelingen door het eiwit neerlopen in 125 microliter van buffer A.Transfer naar een nieuwe 1,5 milliliter buis.Soniceer de buis kort en centrifugeer het vervolgens op 13, 000 keer G of hoger en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Breng het gesaneerde eiwit over op nieuwe buizen van 1,5 milliliter en voeg 375 microliter buffer H of buffer T.Na het uitbroeden van de monsters gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, herhaal de chloroforme methanolneerslag. Om m-PEG toe te voegen aan onbeschermde cysteines, beginnen met het opnieuw toewijzen van de pellet in 100 microliter van buffer A met 10 mil of meer TCEP.Breng de vering vervolgens over op een buis van 1,5 milliliter. Voeg 25 microliter stock m-PEG 5K oplossing toe en meng door pipetting. Incubeer bij kamertemperatuur met eind over eindrotatie.Na 60 minuten incubatie, verwijder niet-opgenomen m-PEG 5K door het uitvoeren van chloroforme methanol neerslag opnieuw. Centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de bovenste fase zoals voorheen, het vermijden van de dikke, floccullent pannenkoek.Voeg een milliliter methanol toe en meng voorzichtig maar grondig. Centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en spoel de pellet af met een milliliter methanol.Nogmaals, centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na het drogen van de pellet in de lucht, opnieuw op te stellen in 50 microliter buffer A zonder TCEP of een reducerend middel. Reserveer 5 microliter van de oplossing voor BCA eiwitkwantificering.Voeg na kwantificering een geschikte hoeveelheid 4x Laemmli-monsterbuffer toe. Laad het monster op een SDS-paginagel. Gebruik standaard scheidings- en detectieprotocollen voor westerse blotting.Om de palmitoylation staat van SynDIG eiwitten te onderzoeken, werden P2 membraanfracties van gehomogeniseerde muizenhersenen onderworpen aan de APEGS-test. Scheiding en indringende met antilichamen aangetoond dat SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, en Prrt2 zijn palmitoylated in de muis hersenen. Het doel van de chloroforme methanolneerslag is om te voorkomen dat een chemische stof, zoals NEM, de volgende stap van het protocol verstoort.Een goede chloroforme methanolneerslag verwijdert ongewenste chemicaliën terwijl eiwitverlies wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden toegepast op hersenlysates van muizen van verschillende leeftijden of uit verschillende hersengebieden om de ruimtelijke-temporele regelgeving van palmitoylation te onderzoeken.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

The video demonstrates the analysis of the palmitoylation state of cell membrane proteins isolated from mouse brain tissue. The process involves exposing the non-palmitoylated cysteines and blocking them, then using a polymer that binds to the palmitoylated cysteines, aiding in assessing the palmitoylation state of the isolated proteins.

Assessing the Palmitoylation State of Cell Membrane Proteins from Mouse Brain Tissue

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.

Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

Deze studie beschrijft experimentele methoden om GFAP en de ziekteverwekkende mutaties biochemisch te karakteriseren, met de nadruk op filamentassemblage, aggregatie en posttranslationele modificatie. Hoogzuivere GFAP-eiwitten werden geanalyseerd, wat inzicht gaf in de mechanismen van de ziekte van Alexander die een kader kunnen bieden voor het bestuderen van potentiële therapeutische doelwitten en het begrijpen van GFAP-mutaties en gerelateerde aandoeningen.

Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten

Leer de APEGS-assay voor kwantitatieve analyse van palmitoylering in hersenmembraaneiwitten van muizen. Deze methode vereist geen affiniteitszuivering en gebruikt gelmobiliteit voor detectie.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Meer video's verkennen