Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd. Het uiteindelijke doel van optogenetica is de modulatie van neuronale circuits met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in het gedragende dier.

In tegenstelling tot farmacologische of elektrische manipulaties, optogenetica zorgt voor de nauwkeurige controle van specifieke celtypes op neuronale circuits. Optogenetica is de perfecte manier om specifieke celtypen te targeten in speciaal gedefinieerde regio tijdens gedrag, en om het directe effect van veranderingen in dergelijke microcircuits te onderzoeken. We zullen nu een stap presenteren om te begeleiden hoe te bereiden en te planten en optogenetica uit te voeren in een vrij bewegende muizen.

Voor de bereiding van het optische implantaat, plaats een keramische ferrule platte kant omhoog in een bankvise. Strip de code van een 200 micrometer diameter glasvezel, met een vezel strippen tool en snijd twee tot drie centimeter niet stukken met een keramische vezel schrijver. Plaats het stuk glasvezel in de keramische ferrule en plaats een druppel een superlijm aan de vlakke kant met een injectie cannulaire.

Aan de ronde kant van de keramische ferrule, snijd de glasvezel zo kort mogelijk en plaats het pre-implantaat op een ferrule polijsten puck om de ronde kant op te poetsen op vier verschillende publishing papers. Snijd daarna de glasvezel aan de vlakke kant van de keramische ferrule, tot de lengte die nodig is voor implantatie. Gebruik een muis hersenatlas om de lengte van het implantaat te berekenen.

Het implantaat moet direct boven het belanggebied eindigen. Voorafgaand aan de implantatie wordt anesthesie toegepast. De precieze en esthetische techniek wordt beschreven in het manuscript.

Wanneer de muis een diepe staat van anesthesie bereikt, plaats deze op een verwarmingsplaat en bevestig het hoofd in een stereotactisch frame. Bevestig de neus en de tanden aan de voorkant en de oren aan beide zijden. Breng een algesia met een cuprofen onderschuit in de achterkant van de muis en breng ondoorzichtige oogzalf op beide ogen om hen te beschermen tegen drogen.

Bevochtig het haar op de hoofdhuid met een natte papieren handdoek en snijd het af met een schaar. Zorg ervoor dat al het losse haar te verwijderen met een natte papieren handdoek. Gebruik een katoenen stok om de hoofdhuid te desinfecteren met een tinctuur die jodium bevat.

Verhoog de hoofdhuid over het gebied van belang met een pincet en snijd een centimeter langs de middellijn. Om de schedel te ruwen voor implantatie, breng een kleine hoeveelheid fosforzuur op het litteken en laat het van kracht worden gedurende 15 seconden. Verwijder al het zuur met een katoenen stok en spoel het litteken twee keer af met natriumchloride.

Bereken voor een goede injectie de F-factor voor individuele coördinaten. Plaats een glazen cannulair in het stereoctatische frame en lokaliseer het direct boven bregma. Nu nul het coördinatensysteem en verplaats de glazen canule naar Lambda.

Bereken de F-factor met de volgende formule. Bregma minus Lambda gedeeld door 4,2 is gelijk aan de F-factor. Exacte coördinaten zijn erg belangrijk voor injectie en implantatie, want anders, als de verkeerde structuur wordt gestimuleerd, zijn de gedragseffecten niet-specifiek.

Alle muizen hebben minimale afwijkingen in de grootte van hun schedel, daarom is de coëfficiënt absoluut verplicht. Gebruik de aangepaste coördinaten om de locatie op het litteken direct boven de structuur van belang te vinden. Gebruik een injectie canule om een gat in de schedel te boren, door de canule ter plaatse te draaien.

Om een virusoplossing in de glasblikje te nemen dat is aangesloten op spuit, plaatst u een druppel natriumchloride op de schedel en een stuk pirophen erop. Plaats een druppel van twee microliter virus oplossing op de pirophen en lager de punt van de glas canule in het virus. Breng negatieve druk en wacht tot het virus oplossing wordt opgenomen door de canule.

Nul op die coördinaat wanneer de punt van het virus met canule is op het niveau van de schedel en langzaam lager in het boorgat naar de laagste positie van de injectie kant. Breng een kleine hoeveelheid positieve druk met de spuit tot de meniscus wordt verlaagd. Laat het virus zich twee tot drie minuten verspreiden voordat u de glazen canule naar boven naar de volgende positie verplaatst.

Verwijder de glazen canule heel langzaam en gooi het na de laatste injectie weg. Bereid nu de schedel voor op implantatie. Droog de schedel met perslucht, breng de primer aan met deze overeenkomstige stick en laat deze 15 seconden drogen.

Breng de band met dezelfde stick aan en genees deze gedurende 20 seconden met UV-licht. Plaats het implantaat in de overeenkomstige houder en plaats de punt van de glasvezel direct boven het boorgat en laat het voorzichtig zakken. Stop met het verlagen van het implantaat wanneer de resterende klep van superlijm de schedel raakt.

De implantatie van optische vezels kan ook worden gemaakt voor bilaterale structuren zoals de hippocampus. Dit maakt lichte stimulatie in beide hemisferen tegelijkertijd mogelijk of maakt het mogelijk om twee verschillende structuren te stimuleren. Het is ook mogelijk om het virus te injecteren op een andere locatie dan het optische vezelimplantaat.

Als de injectie en implantatie worden gedaan in verschillende regio's, boor alle nodige gaten na het aanbrengen van fosforzuur, maar vóór de twee componenten hechting. Controleer opnieuw of de schedel nog volledig droog is, breng dan vloeibaar tandcement rond het implantaat aan en in de omgeving en moet u vervolgens 20 seconden genezen met UV-licht Breng twee mindere cement aan in volledig bontvrij en gedroogd schedelgebied. Genees elke laag met UV-licht.

Om de operatie te voltooien van toepassing jodium zalf op de hele wond. Laat de neus- en oorfixatie los, breng de muis in een verse kooi en plaats deze onder een verwarmingslamp om verlies van lichaamswarmte te voorkomen. Controleer het de gezondheidstoestand ten minste eenmaal per dag en het zal post operatieve en algesia na drie dagen indien nodig.

Na twee weken herstel kunnen muizen worden gebruikt voor gedragsexperimenten. Open de Pulser Software en selecteer de USB-poort waarop de lichtbron is aangesloten. Kies bewerkingsmodus drie om een externe software de lichtbron te laten bedienen.

Kies de juiste aanpassing voor 20 Hertz stimulatie met vijf milliseconden lichtpuls. Als u de verdeling wilt vinden om met de pulser te communiceren, drukt u op startvolgorde. Deze status blijft bestaan totdat de experimenten zijn voltooid.

Maak nu een nieuw experiment in EthoVision XT, ga naar het bestand, kies nieuw uit sjabloon en selecteer een vooraf gedefinieerde sjabloon toepassen. Kies live tracking en selecteer de camera met bron en bevestig de aangesloten Puslar Gen-Eye cam. Kies de muis als het dier dat moet worden geregistreerd.

Selecteer de arenasjabloon, het open veldvierkant en het zonesjablooncentrum, de rand, de hoeken. Bevestig een onderwerp dat moet worden bijgehouden en selecteer het middelpunt, neuspunt en staartbasis. Bevestig de dierlijke kleur in vergelijking met de achtergrond is donkerder en de aanbevolen sample rate om de stap te voltooien.

Geef het experiment de juiste naam en kies een locatie die u wilt opslaan. Totdat u de arena-instellingen vindt, opent de camera automatisch een achtergrondafbeelding. Pas de vooraf gedefinieerde zones aan de echte arena aan met behulp van de pijl en de twee symbolen op het recht.

Als sommige zones overbodig zijn, verwijdert u ze. Druk op trekschaal om te kalibreren en zet een lijn van de ene hoek van het doolhof naar de andere. Voer de lengte van de werkelijke afstand in centimeters.

Herhaal dat voor de andere as. Als u de instellingen voor proefbesturingselementen wilt definiëren, stelt u de hoofdregel voor door de conditietijd aan te passen aan 20 minuten. De voorwaarde voor Star Trek moet zijn, wanneer het onderwerp is in arena voor twee seconden, voor een automatische status van de tracking wanneer de muis in de arena.

Als u een subregel voor de lichtstimulatie wilt maken, gaat u naar structuren, meer en selecteert u subregel. Plaats het onder de hoofdregel en verspreid de twee dozen. Ga naar voorwaarden, tijd en geef het een naam als licht op een, aanpassen voorwaarde wordt voldaan met na vijf minuten.

Plaats het vak direct achter het vak met de regel van de subregel. Ga naar aangepaste hardware en geef deze een naam met licht op één. Selecteer actie om uit te voeren als:Ik zet een hoog.

Plaats de doos direct achter de conditiedoos. Herhaal de stappen om licht te programmeren tot in het licht op. Ga nu naar structuren, subregelverwijzing en controleer of de verwijzing tot de juiste subregel behoort.

Kies startvoorwaarden als zonder vertraging en start voorwaarden als eenmaal per start voorwaarde uit te voeren. Plaats het referentievak tussen de extra boeken een en conditie boeken twee van de belangrijkste regel. Definieer nu de detectie-instellingen om het systeem te laten zien wat het moet bijhouden.

Plaats een testmijl in de arena en selecteer geautomatiseerde setup. Kies knaagdier als diertype en gebruik de muiscursor om een doos rond de muizen in de arena te tekenen. Bevestig de resultaten van de zorgvraag met ja.

Voor het open veld experiment, breng de experimentele muis naar de gedragsruimte vlak voor het experiment om een goed niveau van angst te garanderen. Koppel de muis een spleet van de lichtbron door zachtjes op het rooster van de kooi te drukken. Plaats het in een wachtkooi met vers strooisel gedurende 10 minuten om te wennen aan de lichtkabel.

Begin met acquisitie door op de stopknop te drukken en je naar vision XT. Breng de muis vanuit de wachtkooi naar de linkerbovenhoek van het open veld. Verlaat het gezichtsveld van de muis tijdens het experiment en blijf kalm. Na 20 minuten, wanneer het experiment is voltooid, verwijder de muis uit het doolhof, koppel de lichtkabel los en zet hem terug in zijn eigen kooi.

Door een controlevisualisatie kunnen de verschillen in middentijd tussen licht uit en licht op gezichten direct worden gezien. De muis brengt minder tijd door in het midden wanneer het licht aan staat. Voor de Barnes doolhof experiment, breng alle experimentele muizen in de gedragsruimte ongeveer een uur voor het experiment.

Bereid de Barnes doolhof door het sluiten van alle gaten, behalve een, en nu die een escape box is geplaatst. Sluit één muis in de lichtbron bij beide implantaten en plaats deze direct in het midden van het Barnes doolhof. Druk op start en noodzaak om volgende T te bezoeken en verwijder de doos.

Wees bereid om de proef handmatig te stoppen voor het geval de software niet de hele overgang herkent. Haal de muis uit het doolhof en verwijder de verbinding met de lichtkabel. Bij het uitvoeren, leren en geheugen taak, niet alleen het onmiddellijke effect van de manipulatie wordt onderzocht, maar ook de lange termijn effect van manipulatie tijdens de verwerving, consolidatie of ophalen.

Voor gegevensanalyse vindt u de behandelingstoestand behandeld of gecontroleerd, gaat u naar nesting en selecteer de testcontrolestatus. Kies het statusinterval van de elementactie Star Trek naar het element action light gaat op één. Plaats de nestkast tussen de filterboxbehandeling en de bijbehorende resultaatbox.

Dit gedefinieerde interval is van één. Herhaal de stappen voor intervallen op een van de twee en op twee als ook voor de controlegroep. Definieer ook de parameters die moeten worden geanalyseerd in het analyseprofiel.

Kies de afhankelijke variabele in de zone en selecteer het zonecentrum, het hoofdpunt, het middelpunt en ga op proefstatistieken. Selecteer frequentie, cumulatieve duur en laat het eerst zien. Voeg ook afstandsbeweging toe als variabele.

Met dit profiel zijn de gegevens beschikbaar voor de tijd die in het midden wordt doorgebracht, centreert en wordt verteld dat u op afstand moet bewegen. Als u gegevens uit elke divisie wilt extraheren, gaat u naar de resultaten en selecteert u statistieken en grafieken, drukt u op berekenen om de geanalyseerde gegevens te bekijken. Druk op exportgegevens en selecteer de proefstatistieken en de locatie die u wilt opslaan.

De geëxporteerde gegevens worden opgeslagen als een excel-bestand en met afzonderlijke waarden voor elke muis. Ga bovendien naar de visualisatie van de heatmap en druk op plothittekaarten, selecteer rechts proeven om individuele warmtekaarten voor elke muis en proef te bekijken. Klik met de rechtermuisknop op de muis en exporteer de heatmaps als afbeeldingen.

Open later het excel-bestand van de computer en bereken de gemiddelde en standaard euro SCM voor alle vier de proeven en elke gemeten conditioneringsgroep. Om grafieken en Sigma plot te genereren, kopieer de middelen en SCM in de juiste volgorde van het extra bestand naar Sigma plot. De rijen moeten de gegevens bevatten voor één, op één, en de kolommen bevatten trial, mean en SCM hertz.

Selecteer alle drie de kolommen en ga naar grafieken maken. Selecteer het vak met de balk en kies het vak niet-gegroepeerd met pijl. Label de hele grafiek, ga naar huis, selecteer het grafiekvak en druk op exporteren.

Selecteer de doelmap en kies metabestand als indeling. Om statistieken voor verkregen gegevens te berekenen, kopieert u de juiste gegevens van Xcel één op één, et cetera, en naar enkele kolommen van Sigma plot. Markeer de kolommen die u wilt vergelijken en ga naar analyse, kies T-test en druk op run.

Ten slotte kunnen gedragsgegevens worden getoond verdeeld in let off en op proef met extra warmtekaart specialisatie. In het open veld experiment, tijdens lichtstimulatie van Channelrhodopsin2 en piramidale neuronen, is de centrumduur verminderd, wat wijst op verhoogde angstniveaus. Via immunohistochemie kunnen de injectieplaats en expressie van het virus worden bepaald, ook op de specificiteit van de speciale Cre-afhankelijke muislijn kan worden gevalideerd.

Men kan duidelijk zien dat de lichtstimulatie van Channelrhodopsin2 geestneuronen van dit specifieke cortexgebied verhoogt angstniveaus, in vergelijking met baseline angst voor die stimulatie. Dit onmiddellijke effect van de manipulatie op gedrag is de reden waarom optogenetic vandaag voor zo veel onderzoekvragen betreffende gedrag wordt gebruikt. Deze procedure kan worden gebruikt voor optogenetische modulatie van een gewenst celtype of neuronale circuits in de hersenen van de muis.

Door deze procedure te combineren met geschikte gedragstests voor uw onderzoek, kan een dieper inzicht worden verkregen in neuronale circuits die betrokken zijn bij gedrag en bezienswaardigheden.