Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

RAN peptiden zijn een kenmerk van herhaalde expansie neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ZvH, amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie. Deze protocollen bieden een belangrijke gestandaardiseerde aanpak voor het kwantificeren van RAN peptide toxiciteit in de C.elegans model systeem. De beschreven technieken zijn eenvoudig te leren en goedkoop, kunnen snel worden uitgevoerd en maken gebruik van de reproduceerbare kenmerken van het C.elegans-systeem, zoals beweging en reproductie.

Bij een poging dit protocol, de grootste uitdaging is het verkrijgen van consistente RAN peptide toxiciteit en expressie. De belangrijkste factoren om de temperatuur van geneesmiddelen te controleren, zijn de temperatuur van de temperatuur, de timing van temperatuurverschuivingen en de bereiding van testplaten. Het is belangrijk voor onderzoekers om de fenotypen van de dieren in deze leeftijdsafhankelijke procestest consequent te classificeren.

Visuele demonstratie van deze techniek toont hun classificatiecriteria. Begin met het gieten van standaard nematode groeimedium met één millimolar IPTG en 25 microgram per milliliter carbenicilline in 24-put platen. Streep RNAi voederen klonen in HT115 bacteriën op LB carbenicillin agar en groeien ze op 37 graden Celsius voor 24 uur.

Op de volgende dag, kies een enkele kolonie in een milliliter van LB carbenicillin vloeibare media en groeien de bacteriën voor 18 uur op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 250 rpm. Spot vier afzonderlijke putten van de NGM RNAi 24-put plaat met 20 microliter van 's nachts bacteriële culturen zoals beschreven in het tekstmanuscript en laat RNAi-bacteriën 's nachts dubbelstrengde RNA-productie veroorzaken. Gebruik de standaard hypochlorietmethode om eieren te isoleren vanaf dag één volwassen C.elegans die het geïntegreerde RAN peptidetransgene uitdrukken.

Dan zaad ongeveer 30 eieren in elke put van de 24-put plaat en broeden de plaat op 20 graden Celsius gedurende zeven dagen. Voor het uitvoeren van video snelheid analyse, verwerven twee video's van twee afzonderlijke putten voor elke RNAi conditie met behulp van een stereo ontleden microscoop uitgerust met een monochrome camera. Zorg ervoor dat u consistente acquisitie-instellingen tussen putten gebruikt.

Stel voor elke video de duur in voor 10 seconden en het tijdsinterval op 76 milliseconden. Stel de belichtingstijd van de afbeelding in op vier milliseconden en gebruik de zoominstelling 1,49. Selecteer er vervolgens twee bij twee binning.

Controleer of de resolutie 800 bij 600 pixels is en begin met opnemen. Na de overname, label elke video onmiddellijk met de stam, RNAi conditie en goed nummer. Meet vervolgens de afgelegde afstand en de lengte van elk dier voor 20 verschillende dieren per video, waarbij in totaal ongeveer 40 wormen voor elke RNAi-toestand worden onderzocht.

Selecteer in de software de knop annotatiegereedschappen. Vervolgens het gereedschap Tekst tekenen. Klik op een punt in het midden van de worm wordt gemeten in het eerste frame van de video en markeer het met een nummer.

Ga de video naar het einde terwijl je de worm visueel volgt. Klik er vervolgens op en markeer het met het volgende overeenkomstige nummer. Gebruik het gereedschap Tekenschaalbalk om een lijn te tekenen van het eerste getal naar het tweede getal en de afgelegde afstand in een spreadsheet vast te leggen.

Herhaal deze meting voor 19 andere wormen in de video met behoud van elke individuele meting in het analysevenster. Zodra de metingen zijn voltooid, neemt u een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle meetlijnen illustreert, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit het afkomstig is. Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een spreadsheet met vier kolommen waarin kolom één de worm-id is en kolom twee de snelheid is.

De tijd van elke video kan worden gevonden door met de rechtermuisknop op de video onder het experiment te klikken en naar de eigenschappen te gaan. Om de snelheidsmeting te normaliseren, vindt u de lengte van elk dier. Gebruik het trekpolylinegereedschap om de C.elegans vrij te traceren vanaf het puntje van het hoofd tot het puntje van de staart.

Maak vervolgens een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle polylijnen illustreert. De lengte van de lijnen wordt geregistreerd onder de statistieken. Voeg twee kolommen toe aan de spreadsheet, een voor dierlengte en een voor genormaliseerde snelheid.

Ten slotte, analyseren van de genormaliseerde snelheid gegevens met behulp van een one-way ANOVA met post-hoc testen versus lege vector RNAi. Plaats vier tot zes transgene L4 C.elegans uitdrukken RAN peptide GFP op een zes centimeter GFP RNAi plaat en groeien ze op 20 graden Celsius. Als het experiment RNAi gebruikt om te testen op genetische effecten op RAN peptide toxiciteit, verplaats dan 10 transgene gravid volwassenen naar elk van de twee lege vector RNAi GFP RNAi of gen-specifieke RNAi platen.

Als mutanten worden gebruikt om genetische effecten op RAN peptide toxiciteit te analyseren, plaats 10 gravid wild type of mutant dieren uitdrukken van dezelfde RAN transgene op elk van de twee lege vector RNAi of GFP RNAi platen. Laat ze 48 uur lang groeien op 20 graden Celsius. Kies 10 sets van 10 transgene L4's uit de RNAi-platen en plaats elke set op een RNAi-plaat van drie centimeter.

Zorg ervoor dat de wormen geselecteerd voor de test hebben allemaal oppervlakkig normale beweeglijkheid. Plaats de platen in een plastic zak om vocht vast te houden en uit te broeden op 25 graden Celsius. Na 24 uur, analyseren van de dieren voor mobiliteit door te tikken op de platen op de ontleden microscoop en controleren op beweging.

Als een worm meer beweegt dan een lichaamslengte, tel het als mobiel en breng het naar een nieuwe drie centimeter RNAi plaat. Gebruik een platina pick om de resterende wormen op de kop en staart te tikken. Als het dier meer dan een lichaamslengte beweegt, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe drie centimeter RNAi-plaat.

Als significante verlamming niet wordt waargenomen in de lege vectorcontrole op dag twee, beëindigt u de test en begint u opnieuw. Groep alle niet-bewegende wormen samen, zodat de beweging van meer dan een lichaamslengte gemakkelijk kan worden gedetecteerd. Tel alle verlamde, inzakkende of dode wormen en gooi de plaat weg.

Blijf de dieren vijf tot zeven dagen elke dag voor verlamming scoren. De groeitest werd gebruikt om het effect van genremmingen op de toxiciteit van RAN-diptiden te meten die worden gevonden bij ALS-patiënten met een G4C2-herhalingsuitbreiding. Expressie van PR50 GFP alleen resulteerde in een volledige groei arrestatie, maar knockdown van verschillende genen onderdrukt de ontwikkelingstoxiciteit.

Het effect van specifieke gen knockdowns op de ontwikkelingsmotiliteit van PR50 uitdrukken van dieren werd gemeten met behulp van de video snelheid analyse methode. Zoals verwacht, remming van PR50 GFP expressie resulteerde in een grote toename van de beweeglijkheid in vergelijking met lege vector RNAi. Bovendien resulteerde de RNAi tegen de proteasoom subunit RPN7 in de aanzienlijke toename van pr50 beweeglijkheid.

Toen volwassen fenotypes werden geanalyseerd met de leeftijdsafhankelijke verlammingstest, vertoonde PR50 GFP tot 80% verlamming door vijf dagen oud. Echter, RNAi gericht op het gen cul-6 aanzienlijk vertraagde verlamming suggereert dat cul-6 nodig is voor PR50 GFP toxiciteit. Om te bepalen of RAN-eiwitten neuropathologie veroorzaken wanneer ze worden uitgedrukt in C.elegans-neuronen, werd neuronspecifieke toxiciteit onderzocht met behulp van de commissure-test.

In dag twee volwassenen, PR50 GFP expressie in de motorneuronen leidde tot een aanzienlijke toename van de motorische neuron blebbing. Deze neuropathologie werd aanzienlijk onderdrukt door een mutatie in het insuline IGF receptor gen homolog DAF-2 die de toxische eigenschappen van verschillende neurodegeneratieve eiwitten vertraagt. Voor de gedragstest is het belangrijk dat de RAN peptiden een zeer penetrerend fenotype produceren.

Dergelijke genen of geneesmiddelen kunnen nieuwe biomarkers of therapeutische opties voor RAN peptide ziekten. Met behulp van deze testen hebben we een genoombreed RNAi-scherm uitgevoerd voor suppressors van de C9ORF72 geassocieerde RAN peptide proline-arginine. Genen geïdentificeerd in dit scherm bevatten veel nieuwe en geconserveerde genen die het onderwerp zullen zijn van toekomstige mechanistische studies.