Name: Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer hoe u RAN-peptidetoxiciteit kwantificeert in C. elegans met gedrags- en cellulaire assays. Deze gestandaardiseerde methode helpt onderzoekers neurodegeneratieve ziekten beter te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R21NS107797

1. Het genereren van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies
<ol><li>Ontwerp de individuele RAN peptide codering sequentie met behulp van synoniem codons om de fundamentele repetitieve DNA / RNA-structuur te elimineren, maar het behoud van de bovenliggende aminozuur sequentie.</li>
	<li>Bestel de aangepaste codon sequenties commercieel op de herhalingslengtes die nodig zijn voor de studies (meestal 5-100 herhalingen). Neem een HindIII-beperkingssite op aan het einde van 5 en een BamHI-beperkingssite aan het einde van 3 om het klonen in C. elegans-expressievectoren te vergemakkelijken, zoals pPD95.79. OPMERKING: Als de synthese van grotere constructies moeilijk blijkt, kunnen kleinere bouwsteensequenties worden gesynthetiseerd en vervolgens in grotere herhalingen worden ingebouwd met behulp van een directionele ligatiestrategie17.</li>
	<li>Subclone de peptide sequentie in een C. elegans expressie vector met behulp van standaard T4 ligatie methoden.</li>
	<li>Subclone een cel type-specifieke promotor sequentie gegenereerd door PCR in de voorkant van de RAN peptide sequentie om weefsel-specifieke RAN peptide-GFP expressie rijden.</li>
	<li>Microinject de RAN peptide constructie in de gonad van wilde type C. elegans om transgene stammen met extrachromosomale arrays met behulp van standaard methoden18genereren. Voor een co-injectie marker, de spier-specifieke RFP verslaggever(myo-3p::RFP (pCFJ104)) werd gebruikt, hoewel andere markers kunnen ook worden gebruikt.</li>
	<li>Integreer een stabiel transgeen in het genoom met behulp van standaard C. elegans integratie screening methoden19.</li>
	<li>Als het RAN-peptide giftig is en transgene dieren niet overleven, voeden dieren gfp (RNAi) die bacteriën pre- en post-injectie uitdrukken om de expressie van het giftige eiwit het zwijgen op te leggen. OPMERKING: Het verwijderen van dieren uit gfp(RNAi) maakt ran peptide expressie voor fenotypische analyses met behulp van de onderstaande tests.</li>
</ol>2. Het meten van de ontwikkelingstoxiciteit van RAN peptiden na RNAi-gebaseerde gen knockdown: Video snelheid analyse protocol
<ol><li>Giet standaard nematode groeimedium (NGM) RNAi 24 putplaten met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 25 μg/mL carbenicillin.</li>
	<li>Streep RNAi-voedende klonen in HT115 bacteriën die moeten worden getest op Luria bouillon (LB) + carbenicillin (25 μg/mL) agar platen en kweek bacteriën bij 37 °C voor 24 uur. Neem lege vector (RNAi) op als de positieve controle voor toxiciteit en gfp(RNAi) als negatieve controle.</li>
	<li>Voor elke kloon, kies een enkele kolonie in 1 mL lb + carbenicillin vloeibare media en groeien bacteriën 's nachts gedurende 18 uur bij 37 °C tijdens het schudden bij 250 rotaties per minuut (RPM).</li>
	<li>Spot vier individuele putten van de NGM RNAI 24 putten met 20 μL van de volgende nachtelijke bacteriële culturen: kolom 1 putten = gfp(RNAi); kolom 2 putten = (EV)RNAi; kolommen 3-6 putten = RNAi tegen te testen genen. Laat RNAi-bacteriën 's nachts bij kamertemperatuur (RT) dsRNA-productie opwekken.</li>
	<li>Isoleer eieren vanaf dag één volwassen C. elegans uitdrukken van de geïntegreerde RAN peptide transgene met behulp van de standaard hypochloriet methode en zaad ~ 30 C. elegans eieren in elke put van de NGM RNAi 24 goed plaat.</li>
	<li>Incubeer de 24 putten bij 20 °C gedurende 7 dagen. OPMERKING: Deze incubatietijd is voor stammen die giftige C9orf72 RAN-dipeptiden uitdrukken, zoals PR50 of GR50. Andere stammen kunnen kortere incubatietijden vereisen om uitputting van de bacteriële voedselbron en de daaropvolgende honger te voorkomen.</li>
	<li>Verkrijg uitgezonden lichtvideo's met behulp van een Leica MZ16FA stereoontledenmicroscoop uitgerust met een DFC345FX monochrome camera die is aangesloten op een Windows-compatibele pc met Leica AF-video-acquisitiesoftware (versie 2.6.0.7266).<ol>
<li>Verkrijg twee video's van twee afzonderlijke putten voor elke RNAi-voorwaarde met behulp van consistente instellingen voor video-acquisitie tussen putten. Voor elke video, verwerven 10 seconden op 800 x 600 pixel resolutie en 13,16 frames per seconde (tijd voxel dimensie = 0,076 seconden) met behulp van 18,6 x vergroting (1,49 zoom instelling in AF software). Stel de belichtingstijd van de afbeelding in op 4 milliseconden. Label elke video onmiddellijk met de stam, RNAi conditie, en goed nummer.</li>
	</ol></li>
	<li>Rol de experimenter af op het genotype dat aan elk videobestand is gekoppeld door de volgorde van de video's te randomiseren en de naam van de video's in getallen te wijzigen. Sla deze groep video's op als een nieuw bestand. Maak de experimentator ontblind nadat de analyse is voltooid.</li>
	<li>Meet de 'afgelegde afstand' en de lengte van elk dier voor 20 verschillende dieren uit elke video, waarbij een totaal van ~ 40 wormen voor elke RNAi-aandoening wordt onderzocht.<ol>
<li>Selecteer in de software de knop annotatiegereedschappen en vervolgens het tekstgereedschap tekenen. Klik op een punt in het midden van de worm wordt gemeten in het eerste frame van de video en markeren als een getal. Ga de video naar het einde terwijl je het bewegingspad van de worm visueel volgt. Klik in het laatste frame op een punt in het midden van de worm dat wordt gemeten en markeer het volgende overeenkomstige getal. Teken vervolgens met het gereedschap Draw scalebar een lijn van het eerste getal naar het tweede getal om de afgelegde afstand op te nemen.</li>
		<li>'Afgelegde afstand' is de afstand tussen de twee centroidpunten. Deze afstand wordt naast de meetlijn weergegeven. Neem deze meting op in een spreadsheet. Herhaal deze meting voor 19 andere wormen in de video met behoud van elke individuele meting in het analysevenster.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak metingen van dieren die de meest robuuste beweging vertonen om te voorkomen dat dieren geen beweging vertonen en de gegevens in de richting van verlamming beïnvloeden. Zodra de metingen zijn voltooid, neemt u een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle meetlijnen illustreert, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit het is ontstaan.</li>
	<li>Analyseer de gegevens met behulp van een spreadsheet met vier kolommen. Kolom één is de worm "identifier", kolom twee is de afgelegde afstand / tijd (snelheid).<ol>
<li>De tijd van elke video kan worden gevonden door met de rechtermuisknop op de video onder het experiment te klikken en naar de eigenschappen van de video te gaan.</li>
	</ol></li>
	<li>Normaliseer de snelheidsmeting door de lengte van elk dier te vinden door Kwantificeren te selecteren en vervolgens Statistieken over de software. Als u op het pictogram van het annotatiegereedschap op het videoscherm klikt, moet het gebruik van het gereedschap 'Polyline tekenen' mogelijk maken. Deze tool kan vervolgens worden gebruikt om de C. elegans vrij te traceren van de video van het puntje van het hoofd tot het puntje van de staart. De lengte van de lijn wordt geregistreerd in het kader van statistieken.<ol>
<li>Maak een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle polyline's illustreert die worden gebruikt voor het dimensioneren van de C. elegans, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit ze afkomstig zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de gegevens door twee extra kolommen aan de spreadsheet toe te voegen. Kolom drie is de "Dierlengte", en kolom vier is de "Genormaliseerde snelheid" (snelheid /dierlengte). Analyseer de genormaliseerde snelheidsgegevens met behulp van een One-way ANOVA met post-hoc testen versus lege vector (RNAi).</li>
</ol>3. Het meten van ontwikkelingstoxiciteit van RAN peptide: Groeitest
<ol><li>Pick ~30 gravid dieren in een 50 μL-spot van hypochlorietoplossing (10 mL bleekmiddel, 2,5 mL van 10 N NaOH, 37,5 mL dH2O) op een gfp(RNAi), (EV)RNAi, of (genspecifiek) 6 cm RNAi plaat.</li>
	<li>Na 24 uur zes transgene nakomelingen die uit de hypochlorietoplossingsplek zijn gekropen, verplaatsen naar een nieuwe RNAi-plaat van 6 cm die identiek is aan de RNAi-omstandigheden op de plaat waarop ze aan de behandeling van de hypochlorietoplossing zijn onderworpen. Zet deze nakomelingen (F1) op 20 °C om te groeien en te reproduceren.</li>
	<li>Na 24-48 uur, kies 10 transgene L4 dieren op 6 cm RNAi die overeenkomen met de RNAi-omstandigheden waarop de dieren hebben gegroeid. Laat de dieren 24 uur lang eieren leggen in een couveuse van 20 °C.</li>
	<li>Na 24 uur, verwijder de volwassen dieren en gooi ze weg. Tel het aantal eieren en L1 larven gelegd tijdens de periode van 24 uur met behulp van een mechanische handheld teller. Dit is de totale broodgrootte.</li>
	<li>Tel de komende 72 uur het aantal dieren dat de L4 of ouder bereikt. Als elk dier wordt geteld, verwijder het van de plaat.</li>
	<li>Kwantificeer de "Procentgroei" als het percentage dieren dat de L4 of ouder bereikt uit de totale broedgrootte.</li>
	<li>Voer een exacte test van 2 x 2 Fisher uit versus lege vector (RNAi) om te bepalen of de procentgroei statistisch significant is. De categorieën ter vergelijking zijn "Groei" (# van de dieren die de L4 of ouder stadium bereikt in 72 uur) en "Geen groei" (totale broedgrootte minus het aantal dieren bereiken L4 of ouder stadium in 72 uur).</li>
</ol>4. Post-ontwikkelingsgerichte RAN peptide verlamming test
<ol><li>Behoud geïntegreerde C. elegans transgene stammen die RAN peptide-GFP uitdrukken in de spier op gfp(RNAi) door 4-6 transgene L4's op een 6 cm gfp(RNAi) plaat te plaatsen en de wormen op 20 °C te laten groeien.</li>
	<li>Als het experiment RNAi gebruikt om te testen op genetische effecten op ran peptide toxiciteit, verplaats 10 transgene gravid volwassenen van een niet-uitgehongerde plaat naar elk van twee 6 cm lege vector(RNAi) (positieve controle op verlamming, negatieve controle voor genetische effecten), gfp(RNAi) (negatieve controle voor verlamming, positieve controle voor genetische effecten), genspecifieke(RNAi) (d.w.z. 10 gravid volwassenen per 6 cm).</li>
	<li>Als mutanten worden gebruikt om genetische effecten op ran peptide toxiciteit te analyseren, plaats 10 gravid WT of gemuteerde dieren uitdrukken van dezelfde RAN transgeen op elk van twee 6 cm lege vector(RNAi) of gfp (RNAi) platen. Laat de wormen 48 uur lang op 20 °C groeien.</li>
	<li>Kies 10 sets van 10 transgene L4's van de 6 cm RNAi platen en plaats elke set op een RNAi plaat van 3 cm (d.w.z. n = 100 dieren voor elk genotype). Zorg ervoor dat de L4's geselecteerd voor de test hebben allemaal oppervlakkig normale beweeglijkheid. Plaats de platen in een rits opbergzak om vocht vast te houden.</li>
	<li>Plaats de ingepakte platen met L4's in de couveuse van 25 °C.</li>
	<li>Verwijder de dieren 24 uur later uit de 25 °C-couveuse één stam tegelijk om de tijd dat ze bij RT zijn buiten te minimaliseren.</li>
	<li>Tik op de platen op de ontledende microscoop om te controleren op beweging. Als de dieren zich meer dan een lichaamslengte bewegen, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe 3 cm RNAi plaat. Gebruik een platina pick om de resterende wormen op de kop of staart te tikken. Als het dier meer dan een lichaamslengte beweegt, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe 3 cm RNAi plaat. LET OP: Niet meer dan 10 wormen per plaat bij het overbrengen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het verplaatsen van nakomelingen naar de nieuwe RNAi plaat, omdat de test is afhankelijk van het volgen van oude dieren alleen.</li>
	<li>Groepeer alle niet-bewegende wormen samen, zodat beweging van meer dan een lichaamslengte gemakkelijk kan worden gedetecteerd. Geef het dier ten minste één minuut om meer dan één lichaamslengte te verplaatsen. Als het nog steeds niet beweegt, is het verlamd, verpakt (dat wil zeggen, larven uitgebroed in moeder), of dood.</li>
	<li>Censureer dieren die zakken vertonen, uitdrogen aan de zijkanten van de plaat, vertonen geëxtrudeerde darmen, hol, verloren gaan, of sterven aan de test op het moment van detectie. Verlamde wormen worden geteld, achtergelaten op de oude RNAi plaat, en weggegooid.</li>
	<li>Scoor de dieren elke dag 5-7 dagen op verlamming, zoals beschreven in stappen 4.6–4.9.</li>
	<li>Analyseer verlammingsgegevens met een log-rank test die identiek is aan de test die wordt gebruikt om de levensduur te analyseren. In deze statistische analyse, bewegende wormen worden gescoord als "Alive", verlamde wormen worden gescoord als "Dood", en dood, zakken, darm geëxtrudeerd, uitgedroogd, gegraven, of anderszins verloren wormen worden gescoord als "Gecensureerd". OPMERKING: In deze analyse geeft het getal 'Procent levend' de dieren 'Procent bewegen' aan. Het omgekeerde vertegenwoordigt de "Procent Verlamd". Gebruik de online analysetool OASIS<a href="https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/" target="_blank">(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)</a>om de log-rank statistische analyses uit te voeren.</li>
</ol>5. Het meten van neuron pathologie: Commissure test
<ol><li>Genereren transgene C. elegans uitdrukken van de RAN peptide van belang in de GABAergic neuronen met behulp van de unc-47 promotor. Ook express unc-47p::GFP of unc-47p::RFP om de cellulaire morfologie van de GABA neuronen te onthullen.</li>
	<li>Pluk 50 transgene L4 dieren en leg ze 24 uur lang op een OP50-plaat van 6 cm bij 25 °C.</li>
	<li>Breng de 50 transgene dieren gedurende 24 uur op een nieuwe 6 cm OP50 plaat bij 25 °C.</li>
	<li>Maak agarose pads voor beeldvorming van de dieren onder widefield microscopie.<ol>
<li>Plaats twee stukken tape op twee microscoopdia's. Plaats een gereinigde dia zonder tape in het midden van de twee afgeplakte dia's.</li>
		<li>Afzien ~ 100 μL (1 druppel van een wegwerp plastic Pasteur pipet) van 3% gesmolten agarose op de middelste glijbaan met een wegwerp steriele overdracht pipet.</li>
		<li>Plaats onmiddellijk een tweede schone dia over de druppel gesmolten agarose, zodat deze op de afgeplakte dia's rust en een dunne en gelijkmatige laag agarose tussen de dia's creëert.</li>
		<li>Nadat de agarose is afgekoeld en gestold, verwijder voorzichtig de twee dia's met de laag van agarose ertussen, zonder ze te scheiden, en plaats ze in een plastic zak met een vochtig stuk papier eronder. Maak een dia per 10 wormen te onderzoeken, samen met drie extra dia's.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder de transgene C. elegans uit de couveuse van 25 °C en pluk 10 transgene C. elegans in een 100 μL-druppel van 10 mM levamisole in een glazen depressiedia. Incubeer gedurende 10 minuten of totdat de dieren verlamd zijn.</li>
	<li>Verwijder een schuifpaar uit de plastic zak en scheid ze voorzichtig. Label de dia met de agarose met het genotype en voeg 2 μL van 10 mM levamisole toe aan het midden van de agarose. Verplaats de 10 dieren in de levamisole op het agarosepad. Bedek de dieren met een #1 dikte coverslip.</li>
	<li>Beeld dieren waarin de vulva is zo georiënteerd dat het aan de rechterkant van het dier. Als de vulva zich aan de linkerkant van het hoofd bevindt, zullen de commissures van de motorneuronen onder de dieren liggen en niet zo duidelijk zichtbaar, waardoor nauwkeurige kwantificering moeilijk wordt. Kwantificeren van deze dieren weg. In deze oriëntatie zijn de commissures van de motorneuronen het dichtst bij het uitglijder en zijn ze duidelijk zichtbaar op een omgekeerde breedveldfluorescentiemicroscoop. Visualiseer de neuron commissures uitdrukken GFP met een Leica DMI4000B omgekeerde widefield fluorescentie microscoop met een 63X 1.4X NA olie onderdompeling lens en een Leica L5 GFP filter set (Ex480/40nm; Em527/30nm). Als de neuron commissures Express RFP in plaats van GFP, gebruik maken van een Leica TX2 RFP filterset (Ex560/40nm; Em645/75nm).<ol>
<li>Visualiseer de neuron commissures uitdrukken GFP met een omgekeerde widefield fluorescentie microscoop met een 63x 1.4x NA olie onderdompeling lens en een GFP filter set (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Als het neuron RFP in plaats van GFP uitdrukt, gebruikt u een rode fluorescerende eiwitfilterset (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>Beeld de wormen binnen 45 min na het plaatsen van de coverslip op de wormen om toxiciteit van immobilisatie te minimaliseren.</li>
	<li>Tel voor elke worm het aantal zichtbare commissures. Er zijn 16 zichtbare commissures bij wilde dieren. Tel ook het aantal commissures dat grote kralen (dat wil zeggen, blebs) in de commissures evenals het aantal commissures die zijn gebroken. Om te bevestigen dat de commissure is verbroken, volgt u de commissure van het rugkoord naar het ventrale koord door het brandpuntsvlak aan te passen. OPMERKING: Commissures waarin de unc-47p::GFP fluorescentie vertoont een kloof worden beschouwd als gebroken. Een gebroken commissure heeft meestal een bleb aan weerszijden van de pauze, helpen laten zien dat de commissures is gebroken. Tel de hoeveelheid blebbing en pauzes voor 20 wormen.</li>
	<li>Bereken de fractie van commissures met blebs of pauzes over het totale aantal waargenomen commissures voor elk dier. Het absolute aantal commissures geteld per dier (inclusief wild type, blebbed, en gebroken gebeurtenissen) kan ook worden gemeten.</li>
	<li>Bereken voor elke categorie het gemiddelde ± SD en analyseer statistisch met een T-test van een student voor vergelijking tussen twee populaties, of een eenrichtings-ANOVA voor vergelijkingen tussen 3 of meer populaties.</li>
</ol>

<ol><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+associated+non-ATG+%28RAN%29+translation%3A+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+address%2C+g.+h.+m.+h.+e.%2C+Genetic+Modifiers+of+Huntington%27s+Disease%2C+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington%27s+Disease+Onset%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li>
<li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length+of+Uninterrupted+CAG%2C+Independent+of+Polyglutamine+Size%2C+Results+in+Increased+Somatic+Instability%2C+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li>
<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-ATG+%28RAN%29+translation+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li>
<li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-AUG+%28RAN%29+translation%3A+insights+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li>
<li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+Translation+in+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li>
<li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li>
<li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877(2016).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly%2C+Dynamics%2C+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li>
<li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).</li>
<li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87(2011).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li>
<li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li>
<li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li>
<li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li>
<li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li>
<li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin-inducible+degradation+%28AID%29+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier rapporteren we methoden die kunnen worden gebruikt om RAN peptide toxiciteit gemodelleerd in de spier of in de neuronen van C. elegansassay. Terwijl neurodegeneratieve eiwitten een leeftijd begin fenotype bij menselijke patiënten hebben, kunnen ze ook ontwikkelingstoxiciteit vertonen wanneer overuitgedrukt in modelsystemen. Overexpressie heeft aanzienlijke interpretatieve beperkingen, maar het biedt ook een krachtig uitgangspunt voor genetische of farmacologische schermen gericht op het identificeren van ge...

De ongepaste uitbreiding van DNA-herhalingssequenties is de genetische basis voor verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (ZvH)1. Hoewel er gevestigde cellulaire en dierlijke modellen voor deze ziekten, mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarden zijn niet goed gedefinieerd. De ZvH wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door de uitbreidingen van een CAG herhalingssequentie in de coderingssequentie voor het Huntingtine eiwit Htt2. Omdat CAG codeert het aminozuur glutamine, de CAG herhalen expansie resulteert in het inbrengen van een polyGlutamine, of polyQ, sequentie binnen Htt. Uitgebreide polyQ eiwitten vormen lengte- en leeftijdsafhankelijke eiwitaggregaten die worden geassocieerd met toxiciteit3,4. Verrassend genoeg suggereren twee recente studies dat de lengte van de polyQ-sequentie niet de belangrijkste drijfveer is voor het begin van de ZvH ziekte, wat suggereert dat polyQ-onafhankelijke factoren ook kunnen bijdragen aan de ziekte5,6.
Een mogelijk polyQ-onafhankelijk mechanisme betreft een nieuw ontdekt type eiwitvertaling dat Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) vertaling7wordt genoemd. Zoals de naam al aangeeft, ran vertaling treedt alleen op wanneer een uitgebreide herhaling sein en vereist geen canonieke start codon. Daarom vindt RAN-vertaling plaats in alle drie de leesframes van de herhaling om drie verschillende polypeptiden te produceren. Bovendien, omdat veel genen ook een antisense transcript produceren dat de omgekeerde aanvulling van de uitgebreide herhalingssequentie bevat, komt RAN-vertaling ook voor in alle drie de leesframes van het antisense transcript. Samen breidt RAN-vertaling het aantal eiwitten uit dat wordt geproduceerd uit een uitgebreide herhalende DNA-sequentie van één peptide naar zes peptiden. Tot op heden is ran-vertaling waargenomen in ten minste acht verschillende herhalingsstoornissen8. RAN peptiden worden waargenomen in postmortem patiënt monsters en alleen in gevallen waarin de patiënt draagt een uitgebreide herhaling9,10. Hoewel deze peptiden duidelijk aanwezig zijn in patiëntencellen, is hun bijdrage aan de pathofysiologie van de ziekte onduidelijk.
Om de potentiële toxiciteit in verband met RAN peptiden beter te definiëren, hebben verschillende groepen elk peptide uitgedrukt in verschillende modelsystemen, zoals gist, vliegen, muizen en weefselkweekcellen11,12,,13,14,15,16. In plaats van gebruik te maken van de herhalingsvolgorde voor expressie, maken deze modellen gebruik van een codon-variatie benadering waarbij de herhalingssequentie wordt geëlimineerd, maar de aminozuursequentie behouden blijft. Vertaling initiatie vindt plaats via een canonieke ATG en het peptide is meestal gesmolten tot een fluorescerend eiwit op ofwel de N- of C-eindpunt, geen van beide lijkt te interfereren met RAN peptide toxiciteit. Daarom drukt elke constructie een enkel RAN-peptide uit. Het modelleren van de verschillende RAN-producten in een meercellig organisme met eenvoudige tests om ran peptide toxiciteit te meten is van vitaal belang om te begrijpen hoe de verschillende RAN-producten van elke ziekte-veroorzakende herhaalde expansie bijdragen aan cellulaire disfunctie en neurodegeneratie.
Net als andere modelsystemen biedt C. elegans een flexibel en efficiënt experimenteel platform dat studies van nieuwe ziektemechanismen mogelijk maakt, zoals RAN peptide toxiciteit. Wormen bieden verschillende unieke experimentele attributen die momenteel niet beschikbaar zijn in andere modellen van RAN peptide toxiciteit. Ten eerste, C. elegans zijn optisch transparant vanaf de geboorte tot de dood. Dit zorgt voor eenvoudige visualisatie van RAN peptide expressie en lokalisatie, evenals in vivo analyse van neurodegeneratie bij levende dieren. Ten tweede, transgene methoden voor het genereren van RAN peptide expressie modellen zijn goedkoop en snel. Gezien de korte driedaagse levenscyclus van C. elegans,kunnen stabiele transgene lijnen die een bepaald RAN-peptide op een celtypespecifieke manier uitdrukken, in minder dan een week worden geproduceerd. Ten derde kunnen eenvoudige fenotypische uitgangen worden gecombineerd met genetische screeningsmethoden, zoals chemische mutagenese of RNAi-screening, om snel genen te identificeren die essentieel zijn voor ran peptidetoxiciteit. Tot slot, de korte levensduur van C. elegans (~ 20 dagen) stelt onderzoekers in staat om te bepalen hoe veroudering, dat is de grootste risicofactor voor de meeste herhalen expansieziekten, ran peptide toxiciteit beïnvloedt. Samen is deze combinatie van experimentele kenmerken ongeëvenaard in elk ander modelsysteem en biedt een krachtig platform voor de studie van RAN peptide toxiciteit.
Hier beschrijven we verschillende tests die gebruik maken van de experimentele voordelen van C. elegans om de toxiciteit van RAN peptiden te meten en om genetische modifiers van deze toxiciteit te identificeren. De codon-gevarieerde ATG-geïnitieerde RAN peptiden zijn gelabeld met GFP en individueel uitgedrukt in ofwel spiercellen onder de myo-3 promotor of in GABAergic motorneuronen onder de unc-47 promotor. Voor expressie in spiercellen is het belangrijk dat giftige RAN peptiden worden gelabeld met groene fluorescerende eiwitten (GFP), of andere fluorescerende eiwit (FP) tag die kan worden gericht met een RNAi voedingsvector. Dit komt omdat giftige RAN peptide expressie meestal blokkeert de groei, waardoor dergelijke stammen niet levensvatbaar. Het gebruik van gfp(RNAi) activeert voorwaardelijk RAN peptide expressie en maakt stam onderhoud, genetische kruisen, enz. Voor tests worden deze dieren verwijderd uit gfp(RNAi),waardoor het RAN peptide en de resulterende fenotypes kunnen worden expressie. Naast de moleculaire strategie voor het ontwerpen van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies, beschrijven we assays voor het meten van ontwikkelingstoxiciteit (larval beweeglijkheid en groei test), post-ontwikkelingsleeftijd-geassocieerde toxiciteit (verlamming assay), en neuron morfologische gebreken (commissure assay).

<table><tbody><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>50-202-036</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>AGAR GRANULATED 2KILOGRAM</td><td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td><td>DF0145070</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>AGAROSE ULTRAPURE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>16500500</td><td>Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren</td></tr><tr><td>CARBENICILLIN 5G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP26485</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12542B</td><td>Beeldvorming voor commissure-assay</td></tr><tr><td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td>E5242952008</td><td>Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren</td></tr><tr><td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>125485C</td><td>Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12-550-15</td><td>Beeldvorming voor commissure-assay</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;Bacto Peptone&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>DF0118-17-0</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>HALOCARBON OIL 700</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>H8898-50ML</td><td>Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren</td></tr><tr><td>IPTG BIOTECH 10G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP162010</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>Leica Advanced Fluorescence imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-AF</td><td>Beeldverwervingssoftware voor video-snelheidsanalyse en commissure-assay</td></tr><tr><td>Leica Immersion type N (Oil)</td><td>W NUHSBAUM INC</td><td>NC9547002</td><td>Beeldvorming voor commissure-assay</td></tr><tr><td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td><td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td><td>AC187870100</td><td>Beeldvorming voor commissure-assay</td></tr><tr><td>MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td>E5242956003</td><td>Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren</td></tr><tr><td> PETRI DISH, 60X15MM,500/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td><td>FB0875713A</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr><tr><td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td><td>87721</td><td>Nematode groeiplaten en RNAi</td></tr></tbody></table>

meten ran peptide toxiciteit in c. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans wordt vaak gebruikt voor het modelleren van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door herhaalde expansiemutaties, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) en de ziekte van Huntington. Onlangs werd aangetoond dat herhaald expansiebevattend RNA het substraat is voor een nieuw type eiwitvertaling dat herhaal-geassocieerde niet-AUG-afhankelijke (RAN)-vertaling wordt genoemd. In tegenstelling tot canonieke vertaling vereist RAN-vertaling geen startcodon en treedt alleen op wanneer herhalingen een drempellengte overschrijden. Omdat er geen begincodon is om het leeskader te bepalen, vindt RAN-vertaling plaats in alle leesframes van zowel sense- als antisense RNA-sjablonen die een herhalingsuitbreidingsreeks bevatten. Daarom breidt RAN-vertaling het aantal mogelijke ziektegerelateerde toxische peptiden uit van één naar zes. Tot nu toe is ran vertaling gedocumenteerd in acht verschillende repeat expansion-based neurodegeneratieve en neuromusculaire ziekten. In elk geval is het ontcijferen van welke RAN-producten giftig zijn, evenals hun mechanismen van toxiciteit, een cruciale stap in de richting van inzicht in hoe deze peptiden bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte. In dit artikel presenteren we strategieën om de toxiciteit van RAN peptiden in het modelsysteem C. elegans te meten. Ten eerste beschrijven we procedures voor het meten van RAN peptide toxiciteit op de groei en beweeglijkheid van het ontwikkelen van C. elegans. Ten tweede detaileren we een test voor het meten van postontwikkelings-, leeftijdsafhankelijke effecten van RAN peptiden op beweeglijkheid. Ten slotte beschrijven we een neurotoxiciteitstest voor het evalueren van de effecten van RAN-peptiden op neuron morfologie. Deze tests bieden een brede beoordeling van ran peptide toxiciteit en kan nuttig zijn voor het uitvoeren van grootschalige genetische of kleine molecuul schermen om ziekte mechanismen of therapieën te identificeren.

We gebruikten de hier beschreven tests om het effect van verschillende genremmingen op de toxiciteit van RAN-dipeptiden te evalueren die worden aangetroffen bij ALS-patiënten met een herhaalexpansie van G4C2. Met behulp van de groeitest om ontwikkelingstoxiciteit te meten, analyseerden we de effecten van verschillende genetische knock-out mutanten die werden geïdentificeerd in een genoombrede RNAi-schermsuppressors van pr50-GFP-toxiciteit met spieruitgedrukt. Terwijl de expressie van PR50-GFP alleen...

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RAN peptiden zijn een kenmerk van herhaalde expansie neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ZvH, amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie. Deze protocollen bieden een belangrijke gestandaardiseerde aanpak voor het kwantificeren van RAN peptide toxiciteit in de C.elegans model systeem. De beschreven technieken zijn eenvoudig te leren en goedkoop, kunnen snel worden uitgevoerd en maken gebruik van de reproduceerbare kenmerken van het C.elegans-systeem, zoals beweging en reproductie.Bij een poging dit protocol, de grootste uitdaging is het verkrijgen van consistente RAN peptide toxiciteit en expressie. De belangrijkste factoren om de temperatuur van geneesmiddelen te controleren, zijn de temperatuur van de temperatuur, de timing van temperatuurverschuivingen en de bereiding van testplaten. Het is belangrijk voor onderzoekers om de fenotypen van de dieren in deze leeftijdsafhankelijke procestest consequent te classificeren.Visuele demonstratie van deze techniek toont hun classificatiecriteria. Begin met het gieten van standaard nematode groeimedium met één millimolar IPTG en 25 microgram per milliliter carbenicilline in 24-put platen. Streep RNAi voederen klonen in HT115 bacteriën op LB carbenicillin agar en groeien ze op 37 graden Celsius voor 24 uur.Op de volgende dag, kies een enkele kolonie in een milliliter van LB carbenicillin vloeibare media en groeien de bacteriën voor 18 uur op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 250 rpm. Spot vier afzonderlijke putten van de NGM RNAi 24-put plaat met 20 microliter van 's nachts bacteriële culturen zoals beschreven in het tekstmanuscript en laat RNAi-bacteriën 's nachts dubbelstrengde RNA-productie veroorzaken. Gebruik de standaard hypochlorietmethode om eieren te isoleren vanaf dag één volwassen C.elegans die het geïntegreerde RAN peptidetransgene uitdrukken.Dan zaad ongeveer 30 eieren in elke put van de 24-put plaat en broeden de plaat op 20 graden Celsius gedurende zeven dagen. Voor het uitvoeren van video snelheid analyse, verwerven twee video's van twee afzonderlijke putten voor elke RNAi conditie met behulp van een stereo ontleden microscoop uitgerust met een monochrome camera. Zorg ervoor dat u consistente acquisitie-instellingen tussen putten gebruikt.Stel voor elke video de duur in voor 10 seconden en het tijdsinterval op 76 milliseconden. Stel de belichtingstijd van de afbeelding in op vier milliseconden en gebruik de zoominstelling 1,49. Selecteer er vervolgens twee bij twee binning.Controleer of de resolutie 800 bij 600 pixels is en begin met opnemen. Na de overname, label elke video onmiddellijk met de stam, RNAi conditie en goed nummer. Meet vervolgens de afgelegde afstand en de lengte van elk dier voor 20 verschillende dieren per video, waarbij in totaal ongeveer 40 wormen voor elke RNAi-toestand worden onderzocht.Selecteer in de software de knop annotatiegereedschappen. Vervolgens het gereedschap Tekst tekenen. Klik op een punt in het midden van de worm wordt gemeten in het eerste frame van de video en markeer het met een nummer.Ga de video naar het einde terwijl je de worm visueel volgt. Klik er vervolgens op en markeer het met het volgende overeenkomstige nummer. Gebruik het gereedschap Tekenschaalbalk om een lijn te tekenen van het eerste getal naar het tweede getal en de afgelegde afstand in een spreadsheet vast te leggen.Herhaal deze meting voor 19 andere wormen in de video met behoud van elke individuele meting in het analysevenster. Zodra de metingen zijn voltooid, neemt u een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle meetlijnen illustreert, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit het afkomstig is. Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een spreadsheet met vier kolommen waarin kolom één de worm-id is en kolom twee de snelheid is.De tijd van elke video kan worden gevonden door met de rechtermuisknop op de video onder het experiment te klikken en naar de eigenschappen te gaan. Om de snelheidsmeting te normaliseren, vindt u de lengte van elk dier. Gebruik het trekpolylinegereedschap om de C.elegans vrij te traceren vanaf het puntje van het hoofd tot het puntje van de staart.Maak vervolgens een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle polylijnen illustreert. De lengte van de lijnen wordt geregistreerd onder de statistieken. Voeg twee kolommen toe aan de spreadsheet, een voor dierlengte en een voor genormaliseerde snelheid.Ten slotte, analyseren van de genormaliseerde snelheid gegevens met behulp van een one-way ANOVA met post-hoc testen versus lege vector RNAi. Plaats vier tot zes transgene L4 C.elegans uitdrukken RAN peptide GFP op een zes centimeter GFP RNAi plaat en groeien ze op 20 graden Celsius. Als het experiment RNAi gebruikt om te testen op genetische effecten op RAN peptide toxiciteit, verplaats dan 10 transgene gravid volwassenen naar elk van de twee lege vector RNAi GFP RNAi of gen-specifieke RNAi platen.Als mutanten worden gebruikt om genetische effecten op RAN peptide toxiciteit te analyseren, plaats 10 gravid wild type of mutant dieren uitdrukken van dezelfde RAN transgene op elk van de twee lege vector RNAi of GFP RNAi platen. Laat ze 48 uur lang groeien op 20 graden Celsius. Kies 10 sets van 10 transgene L4's uit de RNAi-platen en plaats elke set op een RNAi-plaat van drie centimeter.Zorg ervoor dat de wormen geselecteerd voor de test hebben allemaal oppervlakkig normale beweeglijkheid. Plaats de platen in een plastic zak om vocht vast te houden en uit te broeden op 25 graden Celsius. Na 24 uur, analyseren van de dieren voor mobiliteit door te tikken op de platen op de ontleden microscoop en controleren op beweging.Als een worm meer beweegt dan een lichaamslengte, tel het als mobiel en breng het naar een nieuwe drie centimeter RNAi plaat. Gebruik een platina pick om de resterende wormen op de kop en staart te tikken. Als het dier meer dan een lichaamslengte beweegt, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe drie centimeter RNAi-plaat.Als significante verlamming niet wordt waargenomen in de lege vectorcontrole op dag twee, beëindigt u de test en begint u opnieuw. Groep alle niet-bewegende wormen samen, zodat de beweging van meer dan een lichaamslengte gemakkelijk kan worden gedetecteerd. Tel alle verlamde, inzakkende of dode wormen en gooi de plaat weg.Blijf de dieren vijf tot zeven dagen elke dag voor verlamming scoren. De groeitest werd gebruikt om het effect van genremmingen op de toxiciteit van RAN-diptiden te meten die worden gevonden bij ALS-patiënten met een G4C2-herhalingsuitbreiding. Expressie van PR50 GFP alleen resulteerde in een volledige groei arrestatie, maar knockdown van verschillende genen onderdrukt de ontwikkelingstoxiciteit.Het effect van specifieke gen knockdowns op de ontwikkelingsmotiliteit van PR50 uitdrukken van dieren werd gemeten met behulp van de video snelheid analyse methode. Zoals verwacht, remming van PR50 GFP expressie resulteerde in een grote toename van de beweeglijkheid in vergelijking met lege vector RNAi. Bovendien resulteerde de RNAi tegen de proteasoom subunit RPN7 in de aanzienlijke toename van pr50 beweeglijkheid.Toen volwassen fenotypes werden geanalyseerd met de leeftijdsafhankelijke verlammingstest, vertoonde PR50 GFP tot 80% verlamming door vijf dagen oud. Echter, RNAi gericht op het gen cul-6 aanzienlijk vertraagde verlamming suggereert dat cul-6 nodig is voor PR50 GFP toxiciteit. Om te bepalen of RAN-eiwitten neuropathologie veroorzaken wanneer ze worden uitgedrukt in C.elegans-neuronen, werd neuronspecifieke toxiciteit onderzocht met behulp van de commissure-test.In dag twee volwassenen, PR50 GFP expressie in de motorneuronen leidde tot een aanzienlijke toename van de motorische neuron blebbing. Deze neuropathologie werd aanzienlijk onderdrukt door een mutatie in het insuline IGF receptor gen homolog DAF-2 die de toxische eigenschappen van verschillende neurodegeneratieve eiwitten vertraagt. Voor de gedragstest is het belangrijk dat de RAN peptiden een zeer penetrerend fenotype produceren.Dergelijke genen of geneesmiddelen kunnen nieuwe biomarkers of therapeutische opties voor RAN peptide ziekten. Met behulp van deze testen hebben we een genoombreed RNAi-scherm uitgevoerd voor suppressors van de C9ORF72 geassocieerde RAN peptide proline-arginine. Genen geïdentificeerd in dit scherm bevatten veel nieuwe en geconserveerde genen die het onderwerp zullen zijn van toekomstige mechanistische studies.

measuring-ran-peptide-toxicity-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Deze video introduceert een overlevingstest op korte termijn die een behandeling op acute toxiciteit test of een genetische stam test op resistentie tegen een toxische aandoening.  Het voorbeeldprotocol toont een voorbeeld overlevingstest waarbij wormen worden getest op hun vermogen om oxidatieve stress veroorzaakt door paraquat (PQ) te weerstaan.

C. elegans Overlevingstest: een toxiciteitstest op korte termijn

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.

Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Het huidige protocol beschrijft een test om de respons op levamisol te bepalen, een farmacologische agonist van één klasse caenorhabditis elegans acetylcholinereceptoren. In deze vloeibare levamisol-zwemtest observeren en kwantificeren onderzoekers visueel de tijdsafhankelijke verlamming van dieren die in 24-well-platen worden gekweekt.

Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Leer hoe u RAN-peptidetoxiciteit kwantificeert in C. elegans met gedrags- en cellulaire assays. Deze gestandaardiseerde methode helpt onderzoekers neurodegeneratieve ziekten beter te begrijpen.

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

Meer video's verkennen