Reverse Transcription Loop-Bemiddelde Isothermale Versterking (RT-LAMP) Assay voor de specifieke en snelle detectie van Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus is een opkomende virus en besmettelijke ziekteverwekkers, die hoge sterfte veroorzaken in tilapia en zijn hybride soorten. Aangezien tilapia een belangrijke eiwitbron is voor veel ontwikkelingslanden, heeft de nieuwe virusinfectie een grote impact op de tilapia-aquacultuur en bedreigt ook de voedselzekerheid in de wereld. De ontwikkeling van een snelle, nauwkeurige en gevoelige methode om het virus in visweefsel op te sporen, zal de ziektebestrijding helpen en de impact van het virus verminderen.

In deze video tonen we de omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isothermale versterking, of RT-LAMP test, voor snelle detectie van tilapia lake virus in vis monsters. Deel twee, RNA extractie. Ten eerste, voeg 3250 milligram leverweefsel in een steriele 1,5-milliliter microcentrifuge buis, met 600 tot 1000 microliter zuur guanidinium-fenol base reagens, en gehakt tot homogeen.

Centrifuge op 10.000 RCF gedurende 30 seconden, en breng de supernatant in een nieuwe buis. Voeg een gelijk volume van 95% ethanol toe aan de buis en meng goed. Breng de oplossing in een spinkolom, geplaatst in een opvangbuis, dan centrifuge op 10,000 RCF gedurende 30 seconden.

Gooi de doorstroom weg en breng de kolom over in een nieuwe verzamelingsbuis. Voeg 400 microliter RNA PreWash toe aan de kolom en centrifuge gedurende 30 seconden op 10.000 RCF. Gooi de doorstroom weg en herhaal deze stap.

Voeg 700-microliter RNA Wash Buffer toe aan de kolom en centrifuge twee minuten op 10.000 RCF. Breng de kolom daarna over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Ten slotte, elute RNA in de kolom matrix met een 100-microliter, nuclease-vrij water, en centrifuge op 10,000 RCF gedurende 30 seconden.

Deel drie, primer ontwerp. De PrimerExplorer Versie 4 is de meest voorkomende bioinformatica tool voor het ontwerpen van efficiënte LAMP, of RT-LAMP primers, waarin goede handleidingen voor de software beschikbaar zijn op hun website. Hier werden vier specifieke primers, bestaande uit twee interne en twee externe primers, ontworpen om zes verschillende regio's in het segment 3 van TiLV te herkennen, afkomstig uit Thailand.

Na het betreden van de website, waar de link wordt getoond in de video, klik op PrimerExplorer V4. Kies het bestand met de volgorde van het segment 3 van TiLV, in FASTA-formaat, opgehaald van genbank-toegankelijk nummer, KX631923 of tilapia lake virus TV1 segment 3, en klik vervolgens op Primer Design knop. Eenmaal op de knop Genereren te klikken, wordt de software verwerkt en worden de resultaten weergegeven. Na het optimaliseren van de sequenties voor LAMP-versterking, werden in totaal één paar externe primers en twee paar interne primers geselecteerd voor deze studie, om de TiLV-infectie op te sporen.

Deze set van de primers worden hier getoond. Deel vier, demonstratie van RT-LAMP. De mastermix voor RT-LAMP specifiek voor tilapia lake virus, bestaat uit de volgende chemicaliën.

Bereid een mastermix voor met behulp van de chemicaliën in de tabel. Doe 22 microliter meestermix in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens drie microliters RNA-sjabloon toe aan de reactiebuis.

Voor de negatieve controle, gebruik gedestilleerd water in plaats van RNA materialen, en meng goed. Broed de reacties op 65 graden Celsius gedurende 60 minuten, gevolgd door 80 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na de incubatie gedurende 30 minuten worden de calorimetrische veranderingen visueel waargenomen door blote ogen.

Waar nodig kunnen we rt-LAMP testresultaten bevestigen, door gel elektroforese uit te voeren op 1,5% agarose gel, uitgevoerd met een 100-Volt constante, gedurende 40 minuten, waarbij een kilobase-pair moleculaire grootte DNA Ladder wordt geladen als een marker om fragmentgrootte te bepalen. Deel vijf, representatieve resultaten en interpretatie. Na de incubatie gedurende 30 minuten, de korrel fluorescentie reactie suggereert de positieve versterking van TiLV in visweefsels, werden uiteraard waargenomen in geïnfecteerde monsters onder UV-licht op een golflengte van 365 nanometer, terwijl die van negatieve controle had een duidelijke en licht kleurloze oplossing.

De versterking van RT-LAMP-producten werd overeenkomstig bevestigd op de agarose gel elektroforese, met verschillende maten van de meervoudige versterkingen van omgekeerde DNA-herhalingen, die stamlusstructuren onder UV-lamp vormen in met TiLV geïnfecteerde monsters, terwijl er geen banden werden weergegeven in de putten van de negatieve controle, waar de resultaten in overeenstemming waren met die van de RT-LAMP-test. Dus, om de verspreiding van tilapia lake virus te verminderen, een onmiddellijke screening van deze geïnfecteerde vissen, met behulp van een effectief diagnostische methode, is een van de belangrijke sleutels. De nieuw ontwikkelde RT-LAMP-test moet dus een snel en gevoelig diagnostisch instrument bieden dat moet worden toegepast tijdens het proces van bioveiligheidsmaatregel.

De test kan worden gebruikt in het laboratorium, of faciliteiten ter plaatse. We hopen dat de methode zal worden uitgevoerd om besmette vispopulaties te screenen die kunnen leiden tot de vermindering van de verspreiding van het tilapiameervirus.