Gestandaardiseerde methoden voor het meten van inductie van de heat shock response in Caenorhabditis elegans

De warmteschokrespons is een essentieel cellulair stressresponstraject dat cytoplasmische proteostase onderhoudt en kan worden gekarakteriseerd op de moleculaire, cellulaire en organismale niveaus in zeeelegans. We presenteren een reeks gestandaardiseerde protocollen en best practices die robuuste inductie van de warmteschokrespons in zeeelegans genereren om de reproduceerbaarheid in het hitteschokresponsveld te verbeteren. We tonen aan dat thermotolerantie, een veelgebruikte organismale test niet afhankelijk is van de reactie op de hitteschok.

In plaats daarvan raden we aan om thermisch terugwinning te gebruiken, een organismale test die afhankelijk is van de reactie op de warmteschok. De hitteschokreactie wordt verzwakt met het begin van het leggen van eieren. Daarom is ontwikkelingstiming een kritische variabele die moet worden verantwoord in experimenten met hitteschokrespons.

Begin met het maken van een gesynchroniseerde wormpopulatie. Gebruik een platina draadpluk om ongeveer 10 volwassen wormen over te brengen naar een verse plaat. Zorg ervoor dat u eieren of larven verwijdert die mogelijk met de volwassenen zijn overgedragen.

Laat de wormen om eieren te leggen voor een uur, verwijder dan de volwassenen van het bord. Houd de gesynchroniseerde wormen op 20 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase, rekening houdend met het feit dat de ontwikkelingstiming varieert met elke stam en de temperatuur waarmee de wormen worden verhoogd. Wanneer de wormen klaar zijn voor een hitteschok, wikkel de platen met paraffinefilm en gebruik een reageerbuisrek met een loodgewicht om ze een uur lang onder te dompelen in een circulerend waterbad bij 33 graden Celsius.

Haal de borden uit het waterbad en droog ze met een papieren handdoek. Verwijder de paraffinefilm en laat de wormen zes tot 24 uur bij 20 graden Celsius herstellen, wat voldoende tijd is voor GFP-synthese. Om dia's voor te bereiden op beeldvorming, plaatst u een microscoopdia tussen twee andere dia's met een strook laboratoriumtape erop.

Maak een 3%agarose oplossing in water en verwarm het in de magnetron totdat de agaroses oplossen. Gebruik dan een een milliliter pipet om ongeveer 150 microliters van de agarose in het midden van de dia te plaatsen. Bedek de glijbaan onmiddellijk met een lege schuif, plaats deze loodrecht zodat deze op de laboratoriumtape rust en verwijder deze vervolgens voorzichtig.

Om de wormen te immobiliseren, voeg een kleine druppel van een millimolar levamisole, een M9 buffer, aan het midden van de agarose pad en breng 10 wormen in de druppel met behulp van een platina draad pick. Optioneel, verspreid de levamisole af naar de buitenkant van de agarose pad en lijn de wormen met de pick wanneer ze verlamd raken. Bedek de wormen met een cover slip en beeld ze zo snel mogelijk met behulp van een fluorescentie microscoop.

Om een thermorecovery test uit te voeren, synchroniseer de wormen en onderhoud ze op 20 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase. Dan hitte schok ze voor zes uur. Haal de platen uit het waterbad en laat ze 48 uur lang bij 20 graden Celsius herstellen.

Tel na herstel het aantal wormen dat onmiddellijk kan wegkauwen na mechanische stimulatie zonder schokkerige beweging of verlamming. Om de inductie van de hitteschokreactie op cellulair niveau te visualiseren, werden twee fluorescerende verslaggever zeeelegansstammen geanalyseerd. In de negatieve controle monsters zonder hitteschok, de hsp-16.2 verslaggever toonde normale automatische fluorescentie, maar de hsp-70 verslaggever had constitutieve fluorescentie in de anale depressor spier.

Na een uur van hitteschok, robuuste fluorescentie werd waargenomen in beide verslaggevers toen RNAi werd gebruikt om knock-down hsf-1 voor het meten van verslaggever inductie. Fluorescentie van beide stammen werd ernstig verminderd, wat aangeeft dat deze verslaggevers hsf-1 afhankelijk zijn. Om de inductie van de warmteschokrespons op moleculair niveau te kwantificeren, werden twee inheemse warmteschokeiwitten gemeten met rt-toets PCR.

Het bleek dat een 33 graden Celsius hitteschok van een uur resulteert in meer dan een toename van 2.000 voudige in relatieve expressie van de twee hitteschokgenen. Een thermorecovery test toonde aan dat blootstelling aan een zes uur durende hitteschok leidde tot een 20% afname van wormen met normale beweging na een 48 uur herstel. Knockdown van hsf-1 veroorzaakte een dramatische daling van de normale beweging, met meer dan 95% van de wormen tonen schokkerige beweging of verlamming na te zijn geprikt.

In tegenstelling, knockdown van hsf-1 had geen significant effect op de resultaten van een thermotolerantietest, waarbij wormen worden blootgesteld aan een continue temperatuur van 35 graden Celsius en het percentage wormen in leven wordt gemeten op verschillende tijdstippen. Bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer, zorg ervoor dat de platen te wikkelen met paraffine film twee keer om te voorkomen dat water van het invoeren van de platen en verpest het experiment. Moleculaire testen kunnen worden uitgebreid tot genomische analyses met behulp van RNA-seq.

Andere organismen die worden beïnvloed door de hitteschokrespons kunnen worden opgenomen, zoals de levensduur. Het unieke vermogen om moleculaire, cellulaire en organismale warmteschokresponstesten in zeeelegans te correleren is van onschatbare waarde gebleken voor het begrijpen van de rol van dit traject in ontwikkeling en ziekte.