Name: Semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct induceren bij ratten en de beoordeling van de cardiale functie door een geïsoleerd werkend hartsysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct te induceren bij ratten en cardiale functie te beoordelen met een geïsoleerd werkend hartsysteem. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken het operationeel theaterteam en technici van het Center for Biomedical Research voor hun bijdrage, technische bijstand, waardevolle input en advies. De projecten worden gefinancierd door het Ludwig Boltzmann Instituut, Cluster for Cardiovascular Research (REM-project).

Het experimentele protocol dat de in dit artikel beschreven resultaten heeft opgeleverd, is goedgekeurd door de regionale Ethische Commissie voor Dierproeven in het laboratorium van de Medische Universiteit van Wenen en het Oostenrijkse federale ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Onderzoek (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Alle experimenten voldoen aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, herzien 1996).
LET OP: 10−12 weken oude mannelijke Sprague Dawley ratten van 250−300 g lichaamsgewicht (BW) worden gebruikt. Aangezien de volgende procedures en behandelingen worden uitgevoerd in een steriele omgeving van een operatiekamer (OR), dragen scrubs, handschoenen, gezichtsmaskers en kappen bij het hanteren van dieren. Zorg ervoor dat de handen worden gewassen en ontsmet voordat u de OK binnengaat. Als het de bedoeling is om meerdere dieren te opereren in een chirurgische sessie, hetzij wassen en desinfecteren, of autoclave de instrumenten tussen de operaties. Deze hygiënische richtlijnen zijn geldig voor alle procedures die in de protocolsectie worden gepresenteerd.
1. Preoperatief preparaat en anesthesie
<ol><li>Initiëren preoperatieve anesthesie door het injecteren van een mengsel van xylazine (4 mg/kg BW) en ketamine (100 mg/kg BW) intraperitoneally.</li>
	<li>Intuberen van de ratten met een 14 G buis en volumegestuurde ventilatie met een mengsel van O2, lucht en isoflurane (1−2,5%) bij 75−85 slagen/min, 100 mL/takt/BW (figuur 1A). Indien nodig, voor een beter zicht tijdens het intuberen: breng Xylocain aan via een wattenpunt op de onderste keelholte om lokale ontspanning te bereiken.</li>
	<li>Plaats de ratten op een verwarmde operatietafel in een supine positie en bevestig de voorpoten met tape (Figuur 1B).</li>
	<li>Meet de rectale temperatuur met een sonde. OPMERKING: Het moet tussen 37,5−38,5 °C worden gehandhaafd.</li>
	<li>Scheer de thorax en maak het werkgebied schoon met een antiseptische povidone jodiumoplossing. Breng oogzalf aan op de rat om het drogen van de ogen te voorkomen.</li>
	<li>Intraoperatieve analgesie toedienen door piritramide (0,1 mL/kg BW) intraperitoonaal te injecteren.</li>
	<li>Plaats ECG-sondes onderhuids in de ledematen van het dier.</li>
	<li>Controleer staart- en teenreflexen voorafgaand aan het starten van de chirurgische ingreep.</li>
</ol>2. Chirurgische ingreep-inductie van myocardiale ischemie
<ol><li>Voer huidincisie uit met behulp van een scalpel. Zorg ervoor dat u 2 mm parasternal begint op de linker thorax op het niveau van de 3e intercostale ruimte en ga verder naar de voorste axillaire lijn op het niveau van de 5e intercostale ruimte (figuur 1C).</li>
	<li>Vervang de oppervlakkige spieren voorzichtig om de ribben zichtbaar te maken(figuur 1D).</li>
	<li>Gebruik in het geval van kleine bloedingen een cauter om het omringende weefsel uit te roeien of los te koppelen.</li>
	<li>Voer de thoracotomie uit op het niveau van de 4e intercostale ruimte en plaats een oprolmechanisme in om zicht te krijgen op het hart en de long(figuur 1E). Open het borstvlies voorzichtig om bloedingen te voorkomen.</li>
	<li>Tijdelijk occlude de LAD met behulp van een tourniquet te induceren ischemie / reperfusie (MIR) over een bepaalde tijd; of permanent (MI) occlude het door het maken van 6−7 knopen met behulp van een 6-0 hechting om de ligatie te sluiten (Figuur 1F,G). LET OP: De juiste plek voor occlusie van de LAD bevindt zich ongeveer 2−3 mm onder de linker oorschelp op de ventrale /linker laterale rand van het hart. Succesvolle occlusie wordt geassocieerd met ECG-veranderingen (ST-segment hoogte) en macroscopische veranderingen in de LV als paling.</li>
	<li>In het geval van het ischemie/reperfusiemodel, heropent u de LAD door het tourniquet na 30 minuten occlusie te verwijderen.</li>
	<li>Sluit de thorax met drie hechtingen met één knop met behulp van een 4-0 enkele monofilament hechting(figuur 1H). Verwijder vóór het aanspannen van de laatste hechting eventuele restlucht uit de thorax met een spuit van 10 mL om een pneumothorax(figuur 1I)te voorkomen.</li>
	<li>Herpositioneer de spieren en zet de vluchtige anesthesie uit.</li>
	<li>Hecht de huid met een continue hechting met behulp van een 4-0 hechting(figuur 1J).</li>
	<li>Toleer een antiseptische spray om te beschermen tegen infecties en bijten van de hechting door ratten.</li>
</ol>3. Postoperatieve behandelings- en uitsluitingscriteria
<ol><li>Houd de ratten op de verwarmingstafel tot ze wakker worden. Extubate de ratten zodra ze spontaan beginnen te ademen.</li>
	<li>Zet de extubeerde ratten in een kooi onder een verwarmingslamp om te voorkomen dat ze afkoelen.</li>
	<li>Breng ratten terug naar de dierenverblijven onder gestandaardiseerde omstandigheden wanneer ze zich weer normaal gaan gedragen.</li>
	<li>Voeg 2 ampulen piritramide en 30 mL glucose toe aan 250 mL water voor postoperatieve analgesie gedurende drie dagen.</li>
	<li>Controleer de geschiktheid en het gedrag van ratten met de checklist- en uitsluitingscriteria(tabel 1). Observeer de dieren twee keer per dag voor de volgende week, dan twee keer per week. OPMERKING: In overeenstemming met internationale normen, presenteren alle lijdende dieren, of dieren die tot 6 punten krijgen in de evaluatie met de checklist, aan dierenartsen om therapie-gerelateerde beslissingen te nemen. Dieren die 7 of meer punten krijgen, moeten onmiddellijk worden opgeofferd met een overdosis ketamine en xylazine.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Onderzoek</td>
			<td>Observatie</td>
			<td>Score</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Lichaamsgewicht</td>
			<td>Stable</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% verlies</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>15% verlies voor 48 uur</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>18% verlies</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>normaal (laag plat en glanzend)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">Uiterlijk</td>
			<td>piloerection</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>hematoom</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>huidwonden/snijwonden/bijtwonden</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ernstig verminderd grooming</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>(openingen onrein / clotted of vochtig)</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ernstige huidirritaties of wonden</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>gebogen houding >2 uur</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>significante abdominale distension (ascites)</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">Gedrag</td>
			<td>normaal (slapen, nieuwsgierig, sociale contacten, reactie wanneer aangeraakt)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>ongewoon gedrag, bijvoorbeeld verminderde activiteit</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>zelfisolatie, uitgesproken hyperactiviteit of stereotiepe</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>lethargie voor <6 h</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>lethargie voor 6 uur tot 8 uur</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>apathia >8 uur</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>stereotiepe stereotiepee voor >10 min. en nog steeds aanhoudend na 2 uur</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>tekenen van pijn bij aanraking</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>automatisch mutileren</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Spijsvertering</td>
			<td>Normale</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>diarree (zachte ontlasting)</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>diarree voor 72 uur of waterig</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>bloederige ontlasting</td>
			<td>7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Checklist- en uitsluitingscriteria. Deze tabel bevat de onderzoeken die moeten worden nageleefd en de bijbehorende score. Daarom moet de postoperatieve behandeling van het dier worden aangepast of moet een dierenarts worden geraadpleegd.
4. Echocardiografiemetingen
OPMERKING: Echocardiografie wordt meestal twee keer uitgevoerd, voorafgaand aan de inductie van MI en voordat de organen worden geoogst.
<ol><li>Injecteer ratten met een mengsel van xylazine (4 mg/kg BW) en ketamine (100 mg/kg BW) intraperitoneally.</li>
	<li>Plaats de ratten in een supine positie op een verwarmingsbak. Breng echogel aan op de borst, die de ultrasone golven helpt beter te reizen en signaalinterferenten vermindert.</li>
	<li>Verkrijg parasternal korte asmeningen van de LV holte op het niveau van de papillaire spier.</li>
	<li>Voer M-mode echocardiografie uit om linker ventriculaire uitwerpfractie en morfologie te meten.</li>
</ol>5. Orgaanoogst (zonder werkhart)
<ol><li>Herleed xylazine (4 mg/kg BW) en ketamine (100 mg/kg BW) intraperitoneally voorafgaand aan de orgaanoogst. Zorg ervoor dat de reflexen negatief zijn. OPMERKING: Er is geen intubatie vereist omdat de procedure niet langer dan 1 min duurt.</li>
	<li>Gebruik een scalpel om een huidincisie onder de xiphoid te maken en parallel uit te breiden tot de ribben aan beide zijden met behulp van een schaar.</li>
	<li>Snijd de ribben in de frontale oksellijn en pak de xiphoid om de borst op te tillen(figuur 2A).</li>
	<li>Verwijder anatomische of fibrotische weefselverklevingen door het weefsel zorgvuldig te scheuren met twee paar tangen.</li>
	<li>Neem bloedmonsters (voor bloedgasevaluatie of moleculaire analyses) van de vena cava inferieur met een spuit van 5 mL.</li>
	<li>Voer de excisie van het hele hart uit op het inlaat- en uitlaatniveau(figuur 2B). Ga indien nodig verder met het werken van hartevaluatie zoals beschreven in punt 6.</li>
	<li>Oogst organen, schokvorst ze in vloeibare stikstof en bewaar ze in -80 °C voor verdere moleculaire analyses, of in formaldehyde voor histologische doeleinden.</li>
</ol>6. Ex vivo hemodynamische metingen via een werkend hartsysteem
OPMERKING: De algemene opstelling en de onderdelen van het apparaat zijn eerder beschreven11. Het volgende protocol beschrijft de behandeling van het hart van het dier en de nodige stappen om de LV-functie te evalueren.
<ol><li>Verdoven ratten zoals beschreven in stap 5.1 en injecteer 200 IE van heparine intraveneus (dijbeenader).</li>
	<li>Open de thorax via een incisie onder de costal boog met een scalpel en breid deze uit naar beide voorste axillaire lijnen met een schaar en verhoog het borstbeen.</li>
	<li>Snijd de grote schepen in de buurt van hun uitlaat of inlaat in het hart om het te versnijden(Figuur 2B).</li>
	<li>Dompel het hart onder in de ijskoude Krebs-Henseleit buffer en monteer het op het door erythrocyten-perfused geïsoleerde hartsysteem via het aftappen van de aorta (Figuur 3A).</li>
	<li>Begin met de LD-modus met een constante afterload van 60 mmHg (stabilisatieperiode).</li>
	<li>Na 15 minuten LD-modus, overschakelen naar de WH-modus. Daarom kannulateer het linker atrium via een longader(figuur 3B). Verander vervolgens de stroomrichting in het systeem door de clip te openen die de atriumblikule occludes. Dit resulteert in een perfusie van het linker atrium en een fysiologische bloedstroom in het linker hart11.</li>
	<li>Neem hemodynamische metingen op gedurende 20 minuten in de WH-modus.</li>
	<li>Verzamel bloeddruppels van de coronaire met een spuit van 2 mL om de coronaire stroom (CF, mL/min) elke 5 minuten te meten. OPMERKING: CF wordt gemeten als het verschil tussen linkerriale stroom (LAF) en aortastroom (AF).</li>
	<li>Voer continue metingen uit van LAF (gelijk aan cardiale output) en AF met een flow probe. LET OP: De sonde wordt via het WH-apparaat in de LV geplaatst. Alle gegevens worden continu geregistreerd.</li>
	<li>Als het lopende protocol daarom vraagt, steek dan een high-fidelity katheter retrogradely via de aortaklep in de LV en meet de linker ventrikel systolische druk (LVSP).</li>
	<li>Als u het drukvolume werk per minuut wilt beoordelen, berekent u het slagvolume als cardiale output gedeeld door hartslag.</li>
	<li>Bereken extern hartwerk (EHW) volgens de volgende formule: CO x LVSP(g x m/min) genormaliseerd op het hartgewicht.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Health+Estimates+2015%3A+Deaths+by+Cause%2C+Age%2C+Sex%2C+by+Country+and+by+Region%2C+2000-2015%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015.</a> World Health Organization. , (2016).</li>
<li>Jaquet, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+myocardial+scar+size+after+implantation+of+mesenchymal+stem+cells+in+rats%3A+what+is+the+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism.</a> Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).</li>
<li>Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+difference+in+myocardial+function+and+inflammation+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion.</a> Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).</li>
<li>Kolk, M. V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAD-Ligation%3A+A+Murine+Model+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1438(2009).</li>
<li>Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Myocardial+Infarction+Model+using+Permanent+Ligation+of+Left+Anterior+Descending+Coronary+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59591(2019).</li>
<li>Pilz, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischemic+perconditioning+attenuates+adverse+cardiac+remodeling+and+preserves+left+ventricular+function+in+a+rat+model+of+reperfused+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).</li>
<li>Santer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+functional+characterization+of+left+ventricular+remodelling+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ESC+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice.</a> ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugetierherzen+II.+%C3%9Cber+den+Einfluss+von+W%C3%A4rme+und+K%C3%A4lte+auf+das+Herz+der+warmbl%C3%BCtigen+Tiere%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere.</a> Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+new+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).</li>
<li>Podesser, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+erythrocyte-perfused+%22working+heart%22+model%3A+hemodynamic+and+metabolic+performance+in+comparison+to+crystalloid+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).</li>
<li>Kiss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+preconditioning+enhances+postischaemic+cardiac+functional+recovery+following+cardioplegic+arrest+and+global+cold+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).</li>
<li>Kiss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+nerve+stimulation+reduces+infarct+size+via+a+mechanism+involving+the+alpha-7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+downregulation+of+cardiac+and+vascular+arginase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase.</a> Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Negatieve verbouwing post-MI wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme in de ontwikkeling van hartfalen. Om de continuïteit van cardiovasculair onderzoek te waarborgen, moeten daarom experimentele procedures en technieken reproduceerbaar zijn. Een begrijpelijk en duidelijk omschreven experimenteel protocol is een fundamenteel element van reproduceerbaarheid. Reproduceerbaarheid verwijst naar resultaten die door meerdere wetenschappers kunnen worden herhaald en die in verschillende laboratoria worden gevalideerd. Deze studie was bedoeld om een semi-minimaal invasieve methode te presenteren om chronische of opnieuw geperfundeerde MI te induceren en de cardiale hemodynamische functie bij ratten te beoordelen.
Deze resultaten en verder gepubliceerde gegevens tonen de hoge potentie van deze chirurgische methode en het belang ervan in onderzoek naar MI, remodelleren en HF. Terwijl ischemie/reperfusie letsel kan worden gebruikt om de veranderingen in MI met latere reperfusie te begrijpen, permanente occlusie maakt een beter begrip van de korte en lange termijn remodellering processen van het myocardium. Andere chirurgische benaderingen veroorzaken meer weefselschade en dieren vertonen hogere risico's op het ontwikkelen van infecties en pneumothorax, wat resulteert in hogere uitvalpercentages. Deze procedure is daarentegen bedoeld om de mortaliteit te verminderen door specifieke verbeteringen in de opzet en behandeling. Bovendien vertonen ze variaties in fibrotische littekenuitbreiding als gevolg van instabiele LAD occlusie.
Ons protocol biedt een eenvoudige methode voor intubatie, wat een van de meest kritieke stappen van de hele procedure is. In tegenstelling tot diverse andere publicaties12wordt tracheotomie niet uitgevoerd in onze procedure. Dit verbetert het ontwaken en de revalidatie van de dieren postoperatief, wat leidt tot de ontwikkeling van de pathofysiologische veranderingen die door deze chirurgische ingreep zijn bedoeld voordat de dieren postoperatieve metingen ondergaan. Uiteraard, als het een niet-overlevingsprotocol is, wordt tracheotomie uitgevoerd onder visie en is het dus gemakkelijker uit te voeren. Bovendien is het sluiten van de tracheotomie in een overlevingsprotocol niet van toepassing. Als de thorax wordt geopend, is het verplicht om de long te ventileren om instorting te voorkomen. Daarom worden de ratten geïntubeerd voorafgaand aan de chirurgische ingreep. De minimaal invasieve aanpak snijdt de ribben of het borstbeen niet waardoor de compactheid en stabiliteit van de thorax behouden blijft. Bijgevolg wordt het herstel van de dieren verbeterd en is het risico op spontane pneumothorax of bloedingen relatief laag.
Zoals eerder vermeld, terwijl de intubatie is van duidelijk voordeel, het is moeilijk uit te voeren en kan leiden tot een hogere drop-out rate aan het begin van de experimenten. Dit probleem kan worden beperkt met training en wat anatomische kennis. Het is belangrijk om de buis in de juiste hoek te plaatsen en het lichaam van het dier uit te rekken totdat het licht door de vocale lippen schijnt waarna de buis voorzichtig naar voren kan worden geduwd. Zorg ervoor dat de vocale lippen niet schadelijk zijn, omdat dit zwelling kan veroorzaken, daaropvolgende occlusie van de glottis en verstikking.
Het is ook belangrijk dat de LAD correct wordt geligat. Het kleine chirurgische raam, het snel kloppende hart en de geventileerde long (raak het niet zoveel mogelijk aan, omdat elk contact kan leiden tot bloedingen in de long) maken het vat niet duidelijk zichtbaar. Daarom is anatomische kennis onmisbaar. De linker oorschelp is onmisbaar om zowel het risicogebied te standaardiseren als de ligatie rond de LAD te positioneren. De steek moet intramuraal worden uitgevoerd, niet transmuraal in de LV, omdat dit een vermindering van de LV-kamerdiameter en het volume kan veroorzaken die niet te wijten is aan de pathologische processen. Succesvolle occlusie wordt geassocieerd met cyanose van het myocardgebied in gevaar en verhoging van het ST-segment op ECG. De belangrijkste beperking van deze procedure is de juiste positionering van de hechting. Om vergelijkbare resultaten te bereiken, moeten de steken op hetzelfde niveau zijn en moeten vergelijkbare hoeveelheden weefsel worden gebruikt. Dit vereist een hoog opleidingsniveau en de verschillende gewichten van de dieren moeten in aanmerking worden genomen. Een ander punt om te overwegen is de adequate verwijdering van de pneumothorax voorafgaand aan de sluiting van de intercostale ruimte. Als dit niet precies wordt uitgevoerd, zullen de dieren ademhalingsproblemen vertonen, omdat de inflatie van de linkerlong wordt belemmerd door een pneumothorax. Zoals eerder vermeld, kan dit worden verzacht door het gebruik van een spuit om eventuele restlucht te verwijderen uit de thorax.
Momenteel is deze MI-procedure een veelgebruikte methode die vergelijkbare resultaten en een hoge overlevingskans garandeert als de kritieke stappen met hoge precisie worden uitgevoerd. Toekomstige projecten op verschillende behandelingen, apparaten of geneesmiddelen in MI, HF of cardiale remodellering kunnen worden geëvalueerd door het uitvoeren van deze minimaal invasieve techniek.
De WH-metingen worden, zoals eerder vermeld, niet vaak gebruikt omdat het onderhoud en de behandeling ervan specifieke apparatuur en kennis vereist. Om representatieve en vergelijkbare gegevens te verkrijgen, moeten valkuilen worden vermeden. De meest kritieke stappen zijn de montage van het hart en het overschakelen van het D-model naar de WH-modus. Als het hart niet voldoende wordt uitgesneden, kan de montage moeilijk zijn omdat voldoende aortaweefsellengte nodig is om het hart aan het apparaat te bevestigen. Kort na het aansluiten op de LD-modus kan de hartfrequentie afnemen als gevolg van het wassen in koude buffer, de ontkoppeling van de fysiologische stimuli in het lichaam of de reperfusie met bloed van een andere soort door het apparaat. In dergelijke gevallen moet een pacemaker worden toegepast om de fysiologische frequentie te herstellen en te behouden. Dit zorgt voor vergelijkbare resultaten bij alle dieren. Aangezien het bloedvolume in het apparaat een veelvoud is van het fysiologische volume bij ratten, worden runderrode bloedcellen in een op Krebs-Henseleit buffer gebaseerde suspensie gebruikt.
De overstap van de LD-modus naar de WH-modus is synoniem voor een overstap van passief naar actief hartwerk. De LD-modus wordt gebruikt om het hart te wennen aan zijn nieuwe omgeving. In de WH-modus moet het hart zijn fysiologische uitwerpfuncties uitvoeren. Daarom is een korte aanpassingsfase aan de nieuwe omstandigheden vereist vóór de evaluatie door het verhogen van de afterload.
Een andere kritieke stap die vaak wordt vergeten is de adequate voorbereiding en het onderhoud van het apparaat en het uitfuideren. Het precieze volume van elke verbinding moet worden gemengd en de temperatuur in het systeem moet worden geregeld en aangepast. Niettemin is de WH een elegante methode om cardiale output, slagvolume, linker ventriculaire systolische druk en coronaire stroom tegelijkertijd te beoordelen.
Deze zeer reproduceerbare procedure om MI te induceren en de vertegenwoordigende gegevens die door het WH-apparaat zijn verkregen, bewijzen zelf hun vermogen. De semi-minimaal invasieve aanpak, het niveau van LAD occlusie en intubatie methode vergemakkelijken snel herstel en lage variabiliteit in infarct grootte. Bovendien, cardiale functie analyse in geïsoleerde werkende harten bieden waardevolle hemodynamische resultaten.

Hoewel de incidentie voortdurend afneemt, is een acuut hartinfarct (MI) nog steeds de belangrijkste bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit wereldwijd1. Er zijn beperkingen op de evaluatie van de werkzaamheid van potentiële behandelingen als geneesmiddelen of chirurgische ingrepen die acute MI voorkomen en behandelen. Voordat de effecten ervan bij de mens kunnen worden onderzocht, moeten deze behandelingen vooraf worden getest op risico's, waaronder in vivo onderzoeken bij dieren. Er is geen betere gelegenheid om een pathologie te bestuderen dan onder in vivo omstandigheden. Daarom maakt MI-inductie bij ratten of muizen en zelfs grote diermodellen (varkens of schapen) het onderzoek mogelijk naar korte- (acute) en langdurige (chronische) veranderingen als gevolg van ischemie in de kransslagaders en het omliggende myocardium, evenals systemische veranderingen als gevolg van verminderde hartfunctie. Infarct grootte was voorheen het belangrijkste doel, maar meer recent daaropvolgende cardiale remodellering processen in acute MI of ischemie / reperfusie letsel evenals in opeenvolgende hartfalen (HF) zijn geworden van groot belang. Daarom is een vergelijkbare en gemakkelijk reproduceerbare methode nodig om consistente resultaten te bereiken.
Terwijl het gebruik van cryo-ablatie te krijgen MI is gemeld2, onze methode bouwt voort op andere studies waarin onderzoekers occlude de linker voorste aflopende slagader (LAD) door een enkele steek ligatie. In vergelijking met (hemi-)sternotomieprocedures maakt de minimaal invasieve aanpak die in dit artikel zal worden gepresenteerd, een sneller postoperatieve herstel mogelijk en vermindert de werkingstijd aanzienlijk. Een veel voorkomende stap van andere chirurgische ingrepen is de lift-out van het hart van de thorax om het hart steek3uit te voeren. De aanpak van deze methode maakt deze stap overbodig. Afhankelijk van het protocol kunnen twee verschillende procedures worden uitgevoerd: een tijdelijke occlusie met behulp van een tourniquet om ischemie/reperfusie over een bepaalde tijd te induceren; of een permanente occlusie van de slagader door de ligatuur te bevestigen. Het succes van occlusie kan worden geëvalueerd met elektrocardiogram (ECG) en de macroscopische veranderingen in de linker ventrikel (LV) evenals de verlamming.
Een andere belangrijke stap voorafgaand aan de operatie is intubatie. Terwijl in de meeste gevallen intubatie wordt uitgevoerd via tracheotomie of via orale inbrengen van de buis onder visie door een huidincisie bij de keel, beschrijft dit protocol de endotracheale intubatie van het verdoofde dier dat ademhalingsproblemen of infecties postoperatiefvermindert 4,5. Om postoperatieve complicaties te voorkomen, wordt lucht via een spuit uit de thorax verwijderd voordat de borst wordt gesloten.
De tweede taak van dit artikel is de evaluatie van de hemodynamische functie via een geïsoleerd werkhart experimenteel model, hoe het wordt gebruikt in andere projecten binnen ons instituut6,7. Terwijl echocardiografie, cardiale magnetische resonantie imaging (MRI) en invasieve kwantificering van drukvolume lussen zijn bekende en veel gebruikte methoden om de cardiale functie in vivo te beoordelen, ze zijn bekend dat sommige beperkingen hebben. Invasieve benaderingen, zoals het gebruik van katheters om de globale functie of specifieke parameters van het hart te onderzoeken, worden vaak gebruikt en vertegenwoordigen de gouden standaard van hartmetingen. Het ex vivo werkhartapparaat daarentegen wordt zelden gebruikt vanwege de complexiteit en kosten. Er zijn vele belangrijke aspecten, van het mengsel van het uitfuis tot de adequate cannulatie van het hart, die cruciaal zijn voor een succesvolle evaluatie. Het geïsoleerde werkende hartapparaat werd in 1897 voor het eerst beschreven door Oskar Langendorffen is in de afgelopen decennia gewijzigd9. Vandaag de dag zijn er twee modellen gebruikt: de Langendorff (LD) modus en de working heart (WH) modus. In onze studie wordt de LD-modus gebruikt om het hart te acclimatiseren aan zijn nieuwe omgeving (ongeveer 15 min). In deze modus wordt het hart cannulated via de aorta en de kransslagaders zijn geperfundeerd anterogradely, voldoende leveren van de myocardium. In de LD-modus voert het hart geen drukvolumewerk uit. In de WH-modus daarentegen wordt het linkeratrium cannulated via een longader, waardoor het perfusate het linkeratrium binnenkomt. Het hart pompt dit vervolgens fysiologisch tegen een vooraf gedefinieerde afterload. Door de afterload na verloop van tijd te verhogen, kan de hartfunctie continu worden gemeten. Parameters zoals coronaire stroom, cardiale output (CO), slagvolume (SV) en werk, atriumstroom en LV-systolische en diastolische druk kunnen worden gemeten. De impact van verschillende behandelingen direct en uitsluitend op het hart kan worden onderzocht6,10. Een beoordeling door Liao en Podesser9 presenteerde het wijdverbreide gebruik van deze methode bij de evaluatie van farmacologische effecten op de hartfunctie en metabolisme, alsmede bij de exploratie van verschillende ziekten zoals MI, HF, obesitas en diabetes.
Samengevat presenteert dit protocol een reproduceerbare methode om MI- of myocardiale ischemie/reperfusie (MIR) letsel in vivo uit te voeren. Bovendien, het laat de karakterisering van LV (dys-)functie op een geïsoleerd rattenhart na MI. Dit protocol presenteert een unieke combinatie van behandeling en analyse.

<table><tbody><tr><td>ANESTHESIA &amp; ANALGESIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>TU061219 / 8-00487</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Dr. E. Gräub AG</td><td></td><td>100 mg/kg lichaamsgewicht</td></tr><tr><td>Piritramide</td><td>Hameln-Pharma Plus GmbH</td><td></td><td>2 ampullen met 30 ml glucose 5% in 250 ml water</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>4 mg/kg lichaamsgewicht</td></tr><tr><td>INTUBATIE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zuurstof (zuiver)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilatiepomp</td><td>Hugo Sachs Electronics</td><td>UGO Basile S.R.L.</td><td>Respirator</td></tr><tr><td>14-gauge tube</td><td>Dickinson and Company</td><td></td><td>BD Venflon</td></tr><tr><td>VOORBEREIDEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptische povidine-jodiumoplossing&nbsp;</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>Betaisodona-oplossing</td></tr><tr><td>Oogzalf&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi Austria</td><td></td><td>Oleovital met Vitamine A + Dexpanthenol</td></tr><tr><td>Shaver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIRURGISCHE INSTRUMENTEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anatomische tang</td><td>Martin</td><td>12-272-15</td><td></td></tr><tr><td>Anatomische tang klein</td><td>Martin</td><td>24-386-16</td><td></td></tr><tr><td>Anatomische tang dun</td><td>Odelga</td><td>RU4042-15</td><td></td></tr><tr><td>Cautery Fine Tip</td><td>High Temp</td><td></td><td>bvi-Accu-Temp</td></tr><tr><td>Cup (klein, voor vloeistoffen)</td><td>Martin</td><td>56-231/11</td><td></td></tr><tr><td>Mensur</td><td>MTI</td><td>29-260/25</td><td></td></tr><tr><td>Mosquitoklemmen</td><td>MTI</td><td>05-055/12</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder kort</td><td>Martin</td><td>20-658-14</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder dun</td><td>Martin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ronde haak</td><td></td><td>BT-190</td><td></td></tr><tr><td>Scalpell maat 3</td><td>Swann Morton</td><td>No.10, 0301</td><td></td></tr><tr><td>Schaar voor weefselvoorbereiding</td><td>Aesculap</td><td>BC259R</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe schaar</td><td>MTI</td><td>01-010/10</td><td></td></tr><tr><td>Kleine retractor</td><td>Alm</td><td>AM.416.10</td><td></td></tr><tr><td>Surgicale tang</td><td>Martin</td><td>12-321-13</td><td></td></tr><tr><td>Surgische schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PermaHand Silk 4-0</td><td>Johnson &amp; Johnson Medical Products GmbH</td><td>K891H</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Johnson &amp; Johnson Medical Products GmbH</td><td>JV2024</td><td>enkeldradige monofil naald&nbsp;</td></tr><tr><td>Vicryl 6-0</td><td>Johnson &amp; Johnson Medical Products GmbH</td><td>V301G</td><td>polyethyleen naald&nbsp;</td></tr><tr><td>COMPUTERPROGRAMMA'S &amp; APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labchart 7 Pro</td><td>ADInstruments</td><td>v7.3.2</td><td>Labchart Software</td></tr><tr><td>PowerLab Systeem&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>Powerlab 8/30</td><td></td></tr><tr><td>EX VIVO HEMODYNAMICS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowmeter Narcomatic RT-500</td><td>Narco Bio-Systems</td><td></td><td>flowsonde&nbsp;</td></tr><tr><td>Geïsoleerd hartapparaat&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Electronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labchart 7 Pro</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>v7.3.2</td><td>Labchart Software</td></tr><tr><td>Millar SPR-407</td><td>Millar Instruments Inc.</td><td>840-4079</td><td>hoogwaardige MicroTip katheter&nbsp;</td></tr><tr><td>Naaldelelektroden via Animal bio Amp</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>Fysiologische druktransducer (MLT844) met Clip-on BP Domes&nbsp;</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>MLT844</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Systeem&nbsp;</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>Powerlab 8/30</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct induceren bij ratten en de beoordeling van de cardiale functie door een geïsoleerd werkend hartsysteem

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardinfarct (MI) blijft wereldwijd de belangrijkste bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit. Daarom is onderzoek naar dit onderwerp verplicht. Een gemakkelijk en zeer reproduceerbare MI inductieprocedure is vereist om meer inzicht en beter begrip van de onderliggende pathologische veranderingen te verkrijgen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de effecten of potentie van nieuwe en veelbelovende behandelingen (als geneesmiddelen of interventies) bij acute MI, latere remodellering en hartfalen (HF) te evalueren. Na intubatie en pre-operatieve voorbereiding van het dier werd een verdovingsprotocol met isoflurane uitgevoerd en werd de chirurgische ingreep snel uitgevoerd. Met behulp van een minimaal invasieve aanpak, de linker voorste aflopende slagader (LAD) werd gelokaliseerd en afgesloten door een ligatuur. De occlusie kan acuut worden uitgevoerd voor latere reperfusie (ischemie/reperfusieletsel). Als alternatief kan het vat permanent worden geligat om de ontwikkeling van chronische MI, remodelleren of HF te onderzoeken. Ondanks de gemeenschappelijke valkuilen zijn de uitvalpercentages minimaal. Verschillende behandelingen zoals remote ischemische conditionering kunnen worden onderzocht op hun cardioprotectieve potentieel pre-, peri- en postoperatief. Het postoperatieve herstel was snel omdat de anesthesie nauwkeurig werd gecontroleerd en de duur van de operatie kort was. Postoperatieve analgesie werd toegediend voor drie dagen. De minimaal invasieve procedure vermindert het risico op infectie en ontsteking. Bovendien vergemakkelijkt het een snel herstel. De "werkende hart" metingen werden uitgevoerd ex vivo en maakte nauwkeurige controle van preload, afterload en flow. Deze procedure vereist specifieke apparatuur en training voor adequate prestaties. Dit manuscript biedt een gedetailleerde stapsgewijze inleiding voor het uitvoeren van deze metingen.

De volgende resultaten zijn gepubliceerd door Pilz et al.6. Met deze nauwkeurige chirurgische ingreep kan het cardioprotectieve effect van remote ischemische perconditioning (RIPerc) worden onderzocht. Dit is een potentiële nieuwe behandeling voor patiënten die lijden aan acute MI of MIR en de daaropvolgende ventriculaire verbouwing, wat in veel gevallen leidt tot opeenvolgende HF. Het nabootsen van de pathofysiologische veranderingen van MI/MIR is een verplichte stap in de evaluatie van behandelingen, omdat in vitro- of ex vivo-studies niet de fysiologische omgeving bieden. In dit protocol werden de dieren onderworpen aan 30 minuten LAD occlusie gevolgd door reperfusie (d.w.z. MIR).
Om de reproduceerbaarheid van de procedure te bewijzen, werden histologische snijwonden en vlekken uitgevoerd (figuur 4A). Het was duidelijk dat het fibrotische litteken bij MIR+RIPerc behandelde dieren vergelijkbaar was met de littekenvorming van de Sham-dieren, terwijl de vergelijking van fibrose tussen Sham- en MIR-groepen significant was(figuur 4B). Bovendien vertoonden met MIR+RIPerc behandelde dieren aanzienlijk verminderde fibrose in vergelijking met met MIR behandelde dieren. De representatieve histologische beelden verduidelijken echter de potentie van deze chirurgische ingreep, aangezien het infarct expliciet wordt volgehouden in de MIR-groep(figuur 4A). Met behulp van in vivo echografie werden ejection fraction, LV end-diastolische en end-systolische diameters (LVEDD en LVESD) gemeten en vertoonden ze een aanzienlijk verminderde cardiale functie als gevolg van MIR-behandeling, terwijl hemodynamische parameters werden bewaard door RIPerc (figuur 4C−F). Ex vivo hemodynamische gegevens vertoonden de effectiviteit van de procedure, aangezien de MIR-groep significante dalingen vertoonde in LVSP, cardiale output (CO), slagvolume (SV) en extern hartwerk (EHW)(figuur 5A−G).
Een literatuuronderzoek over deze chirurgische procedure rapporteerde geen negatieve of onbevredigende commentaren en resultaten wanneer het adequaat werd uitgevoerd. Niettemin moeten valkuilen die in de inleiding en de discussie worden genoemd, worden voorkomen en is opleiding verplicht om een stabiel prestatieniveau te verwerven en vergelijkbare resultaten te behalen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig1.jpg"> Figuur 1: Preoperatieve bereiding en chirurgische ingreep. (A) Intubatie van het dier met behulp van een 14 G buis. (B) Supine positionering en ontsmetting van het chirurgische veld. (C) Huidincisie (2 mm parasternal op de linker thorax op het niveau van de 3e intercostale ruimte). De incisie moet de voorste axillaire lijn bereiken op het niveau van de 5e intercostale ruimte. (D) Verplaats de spieren om de ribben zichtbaar te maken. (E) Opening van de thorax. (F) Permanente occlusie van LAD met 6−7 knopen. (G) Transient occlusion van LAD met behulp van een tourniquet. (H) Sluiting van de borst na myocardiale ischemie en reperfusie door het plaatsen van drie enkele knoop hechtingen rond de ribben. (I) Een goede sluiting van de thorax. Gebruik een spuit van 10 mL om eventuele restlucht uit de thorax te verwijderen voordat de laatste knoop stevig wordt hersteld. Dit is een integraal onderdeel om een pneumothorax te voorkomen. (J) Hechting van de huid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig2.jpg"> Figuur 2: Orgaanoogst. (A) Open de borst met sub-xiphoidal bezuinigingen en breid ze uit tot beide mid-oksellijnen. Verdere snijwonden door de ribben worden uitgevoerd om het opheffen van het borstbeen te vergemakkelijken. (B) Excisie van het hart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig3.jpg"> Figuur 3: Geïsoleerd hartapparaat. (A) Langendorff-modus. Het hart wordt via cannulation van de aorta aan het WH-apparaat gemonteerd. (B) Werkende hartmodus. Het systeem kan worden overgeschakeld naar het WH-model om de hartfunctie te evalueren door het linkeratrium te kannuiven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig4.jpg"> Figuur 4: Effect van externe ischemische conditionering op littekenvorming, linker ventriculaire functie en remodelleren. aA) Histologische LV-plakjes geoogst op dag 14 post-myocardale reperfusie. (B) Gekwantificeerde resultaten van fibrose in staafgrafieken. cC) representatieve M-modus echocardiogrammen. (D) Uitwerpfractie (EF) gekwantificeerd in staafgrafieken. (E) LV end-systolische diameter (LVESD) gekwantificeerd in staafgrafieken. (F) LV end-diastolische diameter (LVEDD) gekwantificeerd in staafgrafieken. MIR, myocardiale ischemie-reperfusie; RIPerc, remote ischemische perconditioning. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Herdrukt van Pilz et al.6 met toestemming van Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig5.jpg"> Figuur 5: Effect van RIPerc op LV hemodynamische functie. (A) LV systolische druk (LVSP), (B) cardiale output (CO), en (C)slagvolume (SV) resultaten werden verkregen uit het geïsoleerde werkende hart op dag 14 post-myocardial reperfusie. (D) CO wordt afgeschilderd als een functie van nabelasting; (F) extern hartwerk als functie van afterload, gekwantificeerde resultaten in staafgrafiek(E en G). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en n = 4-7 per groep. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. MIR, myocardiale ischemie/reperfusie; RIPerc, afgelegen ischemische randvoorwaardering; EHW, extern hartwerk; SV, slagvolume; AUC, gebied onder de curve. Herdrukt van Pilz et al.6 met toestemming van Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Dit artikel presenteert een efficiënte methode om myocardiale ischemie en de daaropvolgende chronische reperfusie bij ratten uit te voeren met behulp van een minimaal invasieve aanpak. Bovendien wordt de linker ventriculaire hemodynamische functie van ratten beoordeeld door echocardiografie en geïsoleerde werkhartmethoden.

Semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct induceren bij ratten en de beoordeling van de cardiale functie door een geïsoleerd werkend hartsysteem

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Ondanks de aanzienlijke verbeteringen in de therapie neemt het aantal patiënten dat hartfalen ontwikkelt na een acuut hartinfarct nog steeds toe. Om de overgang van acute MI naar hartfalen waar te nemen, hebben we reproduceerbare diermodellen nodig. We demonstreren een model van MI dat relatief eenvoudig, reproduceerbaar is en de dieren minimaal ongemak veroorzaakt.Bovendien biedt het geïsoleerde hartapparaat een zeer reproduceerbare voorbereiding die op een tijd en kostenefficiënte manier kan worden bestudeerd. In samenwerking met andere onderzoeksgroepen wereldwijd gebruiken we deze techniek om de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen en therapeutische benaderingen te verduidelijken die de myocardiale reparatie en functie verbeteren na MI.Visuele demonstratie van de meest kritieke stappen van dit protocol, zoals intubatie of het niveau van LAD occlusie, kan helpen om veelvoorkomende valkuilen te voorkomen. De stapsgewijze beschrijving maakt reproduceerbare resultaten mogelijk, zelfs als deze worden uitgevoerd door ongetrainde onderzoekers.Milat Inci, laborant, voert de werkhartmetingen uit en Michael Koch, wiskundige en elektronische ingenieur, draagt bij aan computationele analyse. Na het verdoven van de rat, intuberen met een 14-gauge buis en volume-gecontroleerde ventilatie met een mengsel van zuurstof, lucht, en isoflurane. Plaats de rat op een verwarmde operatietafel in een supine positie en bevestig de voorpoten met tape.Plaats vervolgens de ECG-sondes onderhuids in de ledematen van het dier. Gebruik een scalpel om een incisie te maken die twee millimeter parasternal begint op de linker thorax op het niveau van de derde intercostale ruimte en verder gaat naar de voorste axillaire lijn op het niveau van de vijfde intercostale ruimte. Beweeg voorzichtig de oppervlakkige spieren, zodat de ribben kunnen worden gezien.Voer de thoracotomie uit op het niveau van de vierde intercostale ruimte en plaats een oprolmechanisme in om zicht op hart en long te krijgen. Open vervolgens voorzichtig het pericardium om bloedingen te voorkomen. Om ischemie reperfusie over een bepaalde tijd te induceren, occlude de linker voorste dalende slagader met een tourniquet.Na het scheuren van het myocardium, identificeer de linker slagader en plaats de hechting twee tot drie millimeter onder de grens aan de ventrale rand van het hart. Heropen de slagader door het verwijderen van de tourniquet na 30 minuten. Als alternatief kan de slagader permanent worden afgesloten door het maken van zes tot zeven knopen met een 6-0 hechting om de ligatie te sluiten.Gebruik een 4-0 enkele monofilament hechting om de thorax te sluiten met drie enkele knop hechtingen. Verwijder voordat u de laatste hechting aanhaalt, met een spuit van 10 millimeter de restlucht uit de thorax om een pneumothorax te voorkomen. Vervang de spieren en zet de vluchtige anesthesie uit.Dan hecht de huid met een continue 4-0 hechting. Dien een antiseptische spray toe om te beschermen tegen infectie en bijten van de hechting. Voor diepe anesthesie, beheren van een mengsel van xylazine vier milligram per kilogram lichaamsgewicht en ketamine 100 milligram per kilogram lichaamsgewicht intraperitoneally voorafgaand aan echocardiografie of werkhartmetingen.Voor echocardiografie plaatst u de rat in een supinepositie op de verwarmingslade en verkrijg u parasternal korte asweergaven van de linker ventriculaire holte op het niveau van de papillaire spier. Voer vervolgens M-mode echocardiografie uit om de linker ventriculaire uitwerpfractie en morfologie te meten. Om de organen te oogsten, voer een intraveneuze heparine injectie uit.Gebruik vervolgens een scalpel om een huidincisie te maken onder de xyphoid en uitgebreid parallel aan de ribben aan beide zijden met een schaar. Snijd de ribben in de voorste oksellijn en pak de xiphoid om de borst op te tillen. Verwijder anatomische of fibrotische weefselverklevingen door het weefsel zorgvuldig te scheuren met twee paar tangen.Neem bloedmonsters van de vena cava met een spuit van vijf milliliter. Voer vervolgens de excisie van het hele hart uit op het inlaat- en uitlaatniveau. Dompel het hart onder in ijskoude Krebs-Henseleit buffer en monteer het op het door erythrocyte-doordrongen geïsoleerde hartsysteem door de aorta te cannuëren.Begin met de Langendorff-modus. En na 15 minuten, overschakelen naar werkende hart modus. Cannulate het linker atrium via een longader.Verander vervolgens de stroomrichting door de clip te openen die de atrium canule occludes wat resulteert in een perfusie naar het linker atrium en een fysiologische bloedstroom in het linkerhart. Neem hemodynamische metingen gedurende 20 minuten op in de werkende hartmodus, verzamel bloeddruppels van de kransen met een twee milliliter spuit om de coronaire stroom om de vijf minuten te meten. Voer continue metingen uit van de linkerriale stroom en aortastroom met een sonde.Plaats indien nodig een hoge getrouwe katheter retrogradely via de aortaklep in de linker ventrikel en meet de linker ventriculaire systolische druk. Sluit de analyse af door het slagvolume en het externe hartwerk te berekenen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Histologische snijwonden en vlekken werden uitgevoerd om de reproduceerbaarheid van de procedure te bewijzen.Het fibrotische litteken bij MIR en behandelde dieren was vergelijkbaar met de littekenvorming van de schijndieren, terwijl het verschil in fibrose tussen sham- en MIR-groepen aanzienlijk was. Bovendien vertoonden MIR en op afstand behandelde dieren per conditionering aanzienlijk verminderde fibrose in vergelijking met mir-behandelde dieren. In vivo echografie werd gebruikt om uitwerpfractie, LV eind-diastolische en eind-systolische diameters te meten.De analyse toonde een aanzienlijk verminderde hartfunctie als gevolg van MIR-behandeling, maar hemodynamische parameters werden bewaard door RIPerc. Ex vivo hemodynamische gegevens vertoonden de effectiviteit van de procedure, omdat de MIR-groep significante dalingen vertoonde in lv-systolische druk, cardiale output, slagvolume en extern hartwerk. Bij een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een goede positionering van de afsclude hechting en montage van het hart naar het geïsoleerde hartapparaat de kans op het verkrijgen van reproduceerbare resultaten aanzienlijk verhoogt.Er zijn vele manieren om de hartfunctie bij het intacte dier te beoordelen door middel van acute of chronische instrumentatie of zelfs niet-invasief door echocardiografie of MRI. Echter, de geïsoleerde reperfused hart blijft een prominente onderzoeksinstrument en biedt een hele reeks van unieke voordelen.

semi-minimal-invasive-method-to-induce-myocardial-infarction-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De rat model van acuut myocard infarct (AMI) is nuttig om het gevolg van een MI op cardiale pathofysiologische en fysiologische functie te bestuderen.

Acuut myocardinfarct in ratten

Een zeer reproduceerbaar model voor myocardinfarct bij muizen met minimale invasieve manipulaties wordt beschreven. Het model kan eenvoudig worden uitgevoerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid en overlevingsgraad. Daarom zal het beschreven model het aantal benodigde dieren verminderen zoals gevraagd door het 3R-principe (Vervanging, Verfijning en Vermindering).

Minimaal invasieve chirurgische procedure voor het induceren van Myocardinfarct in Muizen

Geïsoleerde werkende hartmodellen kunnen worden gebruikt om het effect van belastingsomstandigheden, hartslag en medicijnen op de myocardprestaties en zuurstofverbruik te meten. We beschrijven methoden voor de voorbereiding van een werkende linker hartmodel van knaagdieren dat de studie van systolische en diastolische prestaties en zuurstofverbruik onder verschillende omstandigheden mogelijk maakt.

Knaagdier Werken Heart Model voor de Studie van hartspierprestatie en Oxygen Consumption

De post-mortem beoordeling van myocardinfarct (MI) bij knaagdieren is gebaseerd op kwantificering van het infarct op gekleurde hartsecties. We beschrijven een nauwkeurige methode om de infarctgrootte te kwantificeren door systematische bemonstering van geoogste rattenharten van basis tot apex en beeldanalyse van trichrome-gekleurde histologische secties.

Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten

Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van een hartinfarct bij muizen met behoud van het hartzakje en de inhoud ervan.

Een intact pericardium ischemisch knaagdiermodel

Onder adequate anesthesie werd het muizenhart geëxternaliseerd door de intercostale ruimte en werd een myocardinfarct met succes geïnduceerd door de linker voorste dalende slagader (LAD) af te binden met behulp van materialen die in de meeste laboratoria gemakkelijk verkrijgbaar zijn.

Een aangepaste eenvoudige methode voor het opwekken van een hartinfarct bij muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode die myocardinfarct of myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen kan induceren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader door middel van micromanipulatie.

Inductie van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen

Myocardiale ischemie-reperfusie model van rattenhart wordt verbeterd door gebruik te maken van een zelfgemaakt retractor, polyvinylchloride buis, en een unieke knoopmethode. Elektrocardiogram, trifenyltetrazoliumchloride en histologische kleuring en procentuele overlevingsanalyseresultaten toonden aan dat de verbeterde modelgroep hogere succes- en overlevingskansen heeft dan de reeds bestaande modelgroep.

Verbeterd knaagdiermodel van myocardiale ischemie en reperfusieletsel

Een nauwkeurige en praktische methode om de parameters te meten achtige stam in myocardiale weefsel is van grote klinische waarde, want het is aangetoond, dat de stam is een meer gevoelige en eerder marker voor contractiele dysfunctie dan de vaak gebruikte parameter EF.

Magnetic Resonance Afgeleide myocard Strain Assessment Met behulp van functie Tracking

Contrast-versterkte cardiale magnetische resonantie (CMR) beeldvorming maakt het mogelijk...

Evaluatie van de hartfunctie en myocard morfologie Met kleine dieren Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI bij ratten

Leer een semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct te induceren bij ratten en cardiale functie te beoordelen met een geïsoleerd werkend hartsysteem. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën.

Semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct induceren bij ratten en de beoordeling van de cardiale functie door een geïsoleerd werkend hartsysteem (Video) | JoVE Journal

Semi-minimale invasieve methode om myocardiaal infarct induceren bij ratten en de beoordeling van de cardiale functie door een geïsoleerd werkend hartsysteem

Meer video's verkennen