Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

De hoeveelheid informatie van slechts één experiment is enorm. We kunnen de aanwezigheid van deze celwandpolymeren detecteren en precies weten hoe ze worden verdeeld in cellen en weefsels, en zelfs hun overvloed bepalen. Deze methode is zo ontworpen dat het kan worden toegepast op bijna elke vorm van plantenweefsel van elke soort die men zou willen analyseren.

Immunolocalisatie in plantenweefsels omvat veel nauwgezet werk, moeilijk uit te leggen zonder daadwerkelijk te zien wat er gebeurt. Voordat u het plantenweefselmonster verzamelt, vult u een glazen flacon met voldoende koude fixatieve oplossing om alle monsters volledig onder te dompelen. Selecteer vervolgens de te analyseren plantenweefsels en trim de monsters tot een grootte van niet meer dan 16 vierkante millimeter.

Dompel de monsters onmiddellijk onder in de fixatieve oplossing. Glutaraldehyde en formaldehyde zijn beide uitstekende fixatieven, maar beide zijn gevaarlijk en moeten in de stroomkap worden behandeld. Breng de flacon over in een vacuümkamer en breng langzaam vacuüm aan.

Wanneer de druk 60 kilo negatief is, begint het zwevende materiaal in de flacon naar de bodem te zinken. Houd de druk in de kamer op niet meer dan negatieve 80 kilo pascals. Het zinken kan tot twee uur duren.

Nadat de monsters twee uur in de vacuümkamer hebben gezeten, laat u het vacuüm langzaam los. Sluit de glazen flacon af en koel deze 's nachts op vier graden Celsius. Gooi na de nachtelijke fixatie alle monsters weg die niet naar de bodem van de injectieflacon zijn gezonken.

Was de resterende monsters gedurende 10 minuten met 25 millimolar PBS en was ze vervolgens gedurende 20 minuten in 25 millimolar PIPES buffer. Het is uiterst belangrijk om alle drijvende monsters te verwijderen, omdat het zeer waarschijnlijk is dat het fixatieve niet in het monster is doorgedrongen. Droog de monsters uit in een ethanolreeks en dompel de monsters gedurende 20 minuten onder bij elke ethanolconcentratie.

Om de monsters te doordrenken, voegt u toenemende concentraties LR-witte hars toe in ethanol, te beginnen met een deelhars tot drie delen ethanol. Incub in elke concentratie gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Vervang de LR-witte hars door verse hars en incubeer de monsters nog eens 12 uur bij vier graden Celsius.

Bereid de insluitgelatinecapsules voor en selecteer capsules die iets groter zijn dan de monsters, zodat de monsters volledig in de hars kunnen worden ingesloten. Label papieren tags met potlood omdat inkt de hars zal vervuilen. Breng één druppel verse LR-witte hars aan op de bodem van elke capsule.

Plaats een monster in elke capsule en vul de capsules vervolgens tot maximale capaciteit met verse hars. Leg de dop op de capsule en druk zachtjes om deze af te dichten. Om de hars te polymeriseren, hardt u de capsules uit op 58 graden Celsius tot ze ongeveer 24 tot 48 uur volledig zijn uitgehard.

Nadat u de gelatinecapsule van de LR-witte hars hebt gepeld, plaatst u het harsblok onder de stereomicroscoop. Knip met een scherp scheermesje het LR-witte blok in een hoek van 45 graden ten opzichte van het monster. Draai het monster en maak een tweede snede onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de eerste.

Ga verder met snijden in hetzelfde patroon om een piramide te vormen met de top van de piramide direct boven het interessegebied van het monster en begin vervolgens met het verwijderen van fijne plakjes loodrecht op de hoofdas totdat het snijoppervlak het monster bereikt. Het doelmonster moet idealiter in een trapeziumvorm worden ingesloten. Plaats het bijgesneden harsblok in de ultramicrotome.

Pas de hoek tussen de mesrand en het harsblok aan. Snijd secties uit het blok met een dikte tussen 200 en 700 nanometer. Gebruik een draadlus om enkele bemonsterde secties voorzichtig van de microtome op te tillen.

Leg ze in een druppel gedestilleerd gedeïnsioniseerd water op een glazen glijbaan. Verdampt het water door de glijbaan op een kookplaat op 50 graden Celsius te plaatsen en voeg vervolgens een druppel vlek toe aan de secties. Spoel na 30 seconden de vlek af en observeer de glijbaan onder de microscoop om de algemene toestand van de sectie te controleren en of de gewenste plantstructuur zichtbaar is.

Bereid een schone reactieschuif voor door in elke put van de glijbaan een druppel gedestilleerd gedeïnsioniseerd water te plaatsen. Breng een of twee monstersecties over op elke druppel water. Plaats de glijbaan in een vierkante Petrischaal van 10 centimeter, dek hem af en laat hem drogen op 50 graden Celsius.

Om een incubatiekamer voor te bereiden op de reactieglijbanen, plaatst u enkele gedempte papieren handdoeken aan de onderkant van een pipetpuntendoos en wikkelt u de doos in met aluminiumfolie. Breng de dia's van de doos over naar de incubatiekamer. Pipet 50 microliter blokkeeroplossing in elke put.

Nadat u de dia gedurende 10 minuten hebt geïncubeerd, verwijdert u de blokkeringsoplossing en wast u vervolgens alle putten telkens 10 minuten met PBS. Na het bereiden van de primaire antilichaamoplossingen zoals beschreven in het manuscript, voert u een laatste wasbeurt uit van de putten met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water gedurende vijf minuten. Pipetteer de primaire antilichaamoplossing in de reactieputten en pipetteer vervolgens de blokkerende oplossing in de controleputten.

Sluit de incubatiekamer. Laat het twee uur staan op kamertemperatuur en koel het vervolgens 's nachts op vier graden Celsius. Bereid een 1%-oplossing van het secundaire antilichaam in de blokkeringsoplossing.

Er zijn ongeveer 40 microliters per put nodig. Bedek de oplossing met aluminiumfolie. Was de putten van de reactieschuif twee keer met PBS en eenmaal met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water gedurende 10 minuten.

Zorg ervoor dat er geen blokkeringsoplossing of afzettingen in de putten achterblijven. Pipetteer de secundaire antilichaamoplossing in alle putten. Incubeer de dia's in het donker bij kamertemperatuur gedurende drie tot vier uur.

Was nogmaals de putten van de reactieschuif twee keer met PBS en eenmaal met gedestilleerd gedeïnsioniseerd water en voeg vervolgens een druppel Calcofluor White toe aan elke put. Voeg zonder wassen een druppel montagemedium toe aan elke put en bedek elke put met een afdeklip. Observeer de monstersecties in de reactieschuif met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Gebruik voor elke waarneming een UV-filter om celwanden te detecteren die door de Calcofluor zijn gekleurd en een FITC-filter om immunolocalisatie te detecteren. Voor een betere visualisatie van de resultaten gebruikt u ImageJ of een vergelijkbaar beeldanalyseprogramma om elke UV-filterafbeelding samen te voegen met de bijbehorende FITC-filterafbeelding. Door de lokalisatie van specifieke epitopen te lokaliseren, maakt het protocol karakterisering van de celwandsamenstelling mogelijk.

Bijvoorbeeld, 1, 5-arabinan is overvloedig in de celwand van de zich ontwikkelende Quercus suber anther. Nauwelijks veresterde homogalacturonanen worden meestal gevonden aan de wortelpunt van het Quercus suber embryo dat mechanische eigenschappen van het orgaan specificeert. Xylogalacturonans worden gevonden in degenererende cellen, zoals de endospermcel tijdens de laatste stadia van de Quercus suber eikelrijping.

AGP's epitopen erkend door JIM13 of JIM8 worden gevonden op structuren die verband houden met reproductie, zoals cellijnen gerelateerd aan microgametogenese in Arabidopsis thaliana en de stigmatische papillae en microbiële van de basale angiosperm Trithuria submersa. Veelgemaakte fouten bij het implementeren van dit protocol zijn meestal gemakkelijk te detecteren en te identificeren. Wanneer de wasbeurten worden overgeslagen of de reactieputten mogen drogen, zal het secundaire antilichaam meestal verschijnen als een uitstrijkje.

Aggregaten van groen fluorchroom vormen zich als het niet-gebonden primaire antilichaam niet goed wordt weggespoeld. Het vouwen of losmaken van de secties is meestal gerelateerd aan slechte hechting als gevolg van het gebruik van onreine dia's of agressief wassen. Monstervoorbereiding is ook van cruciaal belang.

De harsblokken moeten vrij zijn van scheuren met een duidelijk zichtbaar lichtgeel tot lichtbruin monster. Inefficiënt ingebedde monsters vertonen poederwitte vlekken of gebieden. Het onder acht millimeter houden van de monstergrootte is essentieel voor de penetratie van de fixatieve oplossing.

Slecht gefixeerde monsters verschijnen donkerbruin of bijna zwart. Overmatige temperatuur kan ervoor zorgen dat de hars barst, waardoor doorsnede van het monster onmogelijk wordt. Het gebruik van immunolocalisatietechnieken opent verschillende onderzoeksrichtingen.

Men kan doorgaan met meer specifieke technieken zoals biochemische analyse van de celwand of zelfs doorgaan met een moleculaire benadering. De resultaten van deze techniek kunnen helpen om de samenstelling van de celwand te begrijpen, een uiterst complexe structuur die zeer moeilijk te analyseren is door eenvoudige chemische analyse.