Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

Dit protocol is belangrijk omdat het de knockdown en overexpressie van genen in een zich ontwikkelende vis mogelijk maakt, en de kwantificering van die downstream-effecten op bloedcellen. Dit protocol is snel, eenvoudig uit te voeren, economisch en eenvoudig te automatiseren met toegang tot de juiste instrumentatie. Kristen Rueb, een niet-gegradueerde onderzoeker in het laboratorium, demonstreert deze procedure.

Begin met het overbrengen van tussen de vijf en 200, 48 uur na de bevruchting embryo's in een plastic petrischaal van 10 centimeter. Kantel de schaal zodat het embryo naar de onderrand zakt en verwijder zoveel mogelijk E3-medium uit de schaal. Voeg vervolgens 500 microliter dechorionatie protease toe aan de embryo's.

Na vijf minuten bij kamertemperatuur, kantel alle embryo's opnieuw naar de onderkant van de plaat en tik voorzichtig op de zijkant van de schaal, zodat de embryo's zachtjes tegen de bodem van de plaat kunnen wrijven om hun koraal volledig te verwijderen. Voeg met behulp van een knijpfles ongeveer 20 milliliter E3-medium toe om het protease te verdunnen en de embryo's te laten bezinken. Decanteer vervolgens het medium en spoel de embryo's nog drie keer met vers medium, zoals zojuist is aangetoond om alle sporen van het protease te verwijderen.

Om de embryo's voor te bereiden op dissociatie, gebruikt u een P1000 pipet om vijf tot tien embryo's over te brengen in één microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en het overgedragen E3-medium te aspireren. Voeg vervolgens een milliliter van 10 millimolar DTT in E3 medium toe aan de embryonale zebravis en plaats de microcentrifugebuis gedurende 30 minuten horizontaal bij kamertemperatuur om de slijmlaag te verwijderen. Was voor embryodissociatie de met DTT behandelde embryo's driemaal met één milliliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium per wasbeurt.

Alvorens 500 microliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium toe te voegen, en vijf microliter van vijf milligram per milliliter, dissociatie protease. Incubeer vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius op een horizontale orbitale shaker met 185 omwentelingen per minuut gedurende 60 minuten. Zorg ervoor dat u de embryo's regelmatig controleert, zodat u ze niet te veel verteert.

Wanneer een niet volledig homogeen monster met wat vast weefsel aanwezig kan worden waargenomen, tritureer de embryo's met een P1000 pipet totdat het monster volledig is gedissocieerd. Om de gedissocieerde zebravis embryonale cellen voor te bereiden op flowcytometrie, brengt u het hele celmonster over op het bovenste reservoir van een vijf milliliter polystyreen ronde bodembuis, met een 35 micrometer celzeefdop. Spoel de dop af met vier milliliter PBS zonder calcium of magnesium en pellet de cellen door centrifugeren.

Resuspend de cellen vervolgens in 500 microliters PBS zonder calcium en magnesium per tube. Voor flow cytometrische analyse van de zebravis embryonale cellen, draai voorzichtig de cel suspensussingen voordat een een-op-een duizend verdunning van rode dode cel vlek toe te voegen aan elke buis. Binnen 30 minuten na het aanbrengen van de dode celvlek, leeg de afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing en start het vloeistofsysteem van de flowcytometer.

Teken in de analysesoftware vijf plots en stel de eerste plot in om voorwaarts versus zijverstrooiing te meten. Stel de voorwaartse spreiding in op lineair en de zijstrooiing op logaritmisch. Stel de tweede plot in om de voorwaartse spreidingshoogte versus de breedte van de voorwaartse spreiding te meten en de derde plot om de spreidingshoogte versus de breedte van de zijstrooiing te meten.

Stel de vierde plot in om de rode dode celvlek op de x-as te meten en zijverstrooiing op de y-as om de discriminatie van leven uit dode cellen mogelijk te maken. Het vijfde perceel moet worden ingesteld om de fluorofoor van keuze te meten. Wanneer alle plots zijn ingesteld, laadt u het monster op de cytometer en vermindert u het debiet, zodat de cellen niet snel opraken.

Pas de instellingen voor voor- en zijstrooiing aan, zodat het grootste deel van de celpopulatie duidelijk kan worden waargenomen en teken een poort rond de celpopulatie. Label deze poortcellen. Met de tweede punt plot gated op de cellen, gate op voorwaartse scatter en de side scatter singlets om doubletten uit te sluiten.

Pas in het vierde plot de instellingen voor rode dode celvlekken aan zodat er een duidelijk negatieve populatie is. Teken een poort rond deze cellen en label deze poort levende cellen. In het vijfde perceel, poort op de levende cellen en teken een poort rond de positieve cellen, voer dan elk monster uit dat ten minste 25.000 live celgebeurtenissen verzamelt.

Wanneer alle monsters zijn geanalyseerd, volgt u de uitschakelingsprocedure om de fluidics uit te schakelen, de manteltank bij te vullen en de afvaltank te legen. Na analyse van het percentage GFP-positieve rode bloedcellen van elk embryonaal zebravismonster, kan het gemiddelde van alle controlegroep worden berekend. Meestal wordt het gemiddelde ingesteld als één en worden alle percentages berekend op basis van dit referentiepunt.

In deze representatieve analyse werd vastgesteld dat het verminderen van het ISM1-transcript met een specifiek morfolino het aantal GFP-positieve rode bloedcellen binnen 48 uur na de bevruchting van embryo's vermindert. Door deze verlaging van de ISM1-morfolinospiegels met exogene mRNA te redden, wordt het aantal rode bloedcellen weer normaal. Een goede spijsvertering van de monsters is van cruciaal belang.

Als u over- of onderverteerd wordt, krijgt u niet de juiste resultaten. Als er een faxapparaat beschikbaar is, kunnen onderzoekers de bloedcellen verzamelen door te sorteren op in vitro kweek, RNA-sequencing en kwantitatieve RT-PCR.