Name: Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer hoe u real-time medicijnrespons meet in organotypische tumorsnijden voor oncologisch onderzoek. Deze methode versnelt preklinische medicijnontwikkeling door middel van medium-throughput screening op intact weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] en Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). We willen Dr. Alana Welm (Universiteit van Utah) bedanken voor het verstrekken van de borstkanker PDX tumor. We willen ook het personeel van Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) bedanken voor het onderhoud van het PDX-model en leden van het Gujral-lab voor nuttige discussies. N.N.A. wordt ondersteund door de JSPS Overseas Research Fellowship en Interdisciplinary Training Grant van FHCRC. A.J.B. wordt ondersteund door de Chromosoom Metabolisme en Kanker Training Grant van FHCRC.

Alle muisexperimenten werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en Het Gebruik van Laboratoriumdieren van de Wet dierenwelzijn en de Richtlijnen van de Nationale Instituten voor Gezondheid voor de zorg en het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek.
1. Voorbereiding van tumorweefselplakjes
<ol><li>Bereid weefsel slice cultuur (TSC) medium volgens het recept in tabel 1. Filtreer het medium met een 0,45 μm vacuümfilterunit om te steriliseren.</li>
	<li>Aliquot 250 μL TSC medium per put voor een 24 put plaat, of 1 mL medium per put voor een 6 put plaat. Bewaar de plaat in een 37 °C, 5% CO2 bevochtigde couveuse tot gebruik. LET OP: Het medium en de supplementen kunnen worden geoptimaliseerd, afhankelijk van weefselsoorten en experimentele doelen. De hoeveelheid medium moet net genoeg zijn om het poreuze membraan van een kweekinsert te weken. Niet hoger zijn dan het niveau van het membraan. Pas het gemiddelde volume aan als het gemiddelde niveau te laag of te hoog is. Als onderzoekers immunomodulatory agents testen, raden we aan om het medium aan te vullen met IL-210.</li>
	<li>Als het gebruik van tumorweefsel afkomstig van muizen, euthanaseren muizen met een aanbevolen procedure, ontsmetten de blootgestelde huid van muizen door het spuiten van 70% ethanol, en ontleden tumoren met aseptische technieken. Bewaar het tumorweefsel in een buis met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).</li>
	<li>Bij gebruik van verse patiënt tumorweefsels, op te slaan in ijskoude HBSS voor de korte termijn, of ijskoude Belzer University of Wisconsin (UW) oplossing voor opslag op langere termijn (tot 24 uur) om weefsel levensvatbaarheid te behouden. OPMERKING: Plakjes van een PDX-weefsel dat 's nachts in ijskoude UW-oplossing wordt verzonden, zijn met succes voorbereid.</li>
	<li>Breng het tumorweefsel over in een kweekplaat van 10 cm met ijskoude HBSS. Snijd de tumor in tweeën met een scalpel terwijl ondergedompeld in ijskoude HBSS. Vorm tumorweefsels in cilinders met behulp van een biopsiepunch met een diameter van 6 mm en trim één kant om een vlak oppervlak te creëren. Bewaar de weefsels in ijskoude HBSS tot gebruik. OPMERKING: Vermijd het opnemen van het necrotische gebied van het weefsel, dat over het algemeen in het midden staat en een ondoorzichtig en fragiel uiterlijk heeft.</li>
	<li>Stel het vibratome in. Desinfecteer alle apparatuur met 70% ethanol. Plaats de vibratome buffer lade bedekt met een acryl glazen deksel in het midden van het vibratome ijsbad. Voeg ijs toe aan het ijsbad en vul de bufferlade met gekoelde HBSS om het weefsel koel te houden tijdens het snijden. Bevestig een scheermesje aan de meshouder. OPMERKING: Hoewel het houden van vibratomen in een semi-steriele omgeving eerdere experimenten niet heeft beïnvloed, wordt aanbevolen om het vibratome op te slaan onder een bioveiligheidskast indien beschikbaar.</li>
	<li>Til voorzichtig een biopsie-geponste tumorweefsel van de HBSS met behulp van getande tangen en verwijder overtollige buffer door deppen het weefsel met een pluis-vrije papieren handdoek.</li>
	<li>Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm van medische kwaliteit op de plaat van het monster en plaats het weefsel op deze druppel. Droog de lijm 2-3 min door de lucht en plaats de plaat in de bufferbak. Vul aan met wat HBSS totdat het weefsel volledig is ondergedompeld in de buffer. LET OP: Het monteren van weefsels in een rechtopstaande, stabiele positie is van cruciaal belang om gelijkmatig gesneden plakjes te genereren. Als gemonteerde weefsels onstabiel zijn, voeg dan meer lijm toe aan het omringende weefsel om een rechtopstaande positie te behouden of het weefsel te lossen, de bodem plat te maken en het opnieuw te lijmen. Elastische weefsels hebben de neiging om gemakkelijker geduwd en gebogen te worden tijdens het snijden, in welk geval kortere lengtes (<5 mm) en meerdere runs geschikt kunnen zijn. Voor extreem kwetsbare weefsels kunnen papieren handdoeken het weefsel vernietigen. In dit geval kan het weefsel op een plastic oppervlak worden geplaatst om een aantal overtollige HBSS af te voeren.</li>
	<li>Pas de instellingen van het vibratomom aan. De volgende instellingen worden gebruikt: snijdikte = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, snijsnelheid = 0,01–0,25 mm/s en bladhoek = 15°–21°. LET OP: Optimaliseer de snijinstellingen, afhankelijk van de stijfheid van het weefsel. Zachtere weefsels worden gemakkelijker gesneden met een diepere bladhoek bij lagere snelheid. Een bladhoek van 18°, snijsnelheid tussen 0,10-0,18 mm/s en een amplitude van 3,00 mm werkt goed voor muis 4T1- en PDX HCI010-tumoren. Stijver weefsel kan worden gesneden met een hogere bladsnelheid.</li>
	<li>Stel de begin- en eindlocaties van het blad in en pas de hoogte van het podium aan. Voer het instrument met continue modus om plakjes te snijden gedurende meerdere cycli totdat de weefsels gelijkmatig worden gesneden.</li>
	<li>Ga door met het snijden van het weefsel. Breng de plakjes samen met een kleine hoeveelheid HBSS buffer op de celcultuur insert met medium met een breed-tip transfer pipet, met behulp van zuigkracht om het hele segment te tillen. Plaats een plakje per insert op een 24 put plaat. Een insert voor 6 goed platen is geschikt voor maximaal vier plakjes voor een repliceren test. OPMERKING: Als de laatste rand van het weefsel deel is nog steeds bevestigd aan het ongesneden weefsel, stop het vibratome en scheiden het weefsel slice met twee paar fijne tip tangen zonder aan te raken of porren het weefsel plakjes. Een apart scheermesje kan nuttig zijn bij het verwijderen van opknoping weefsel.</li>
	<li>Verwijder elke overtollige buffer met een fijne tip transfer pipet.</li>
	<li>Wanneer het blad dicht bij de gelijmde weefsels reikt, stopt u het instrument, laat het stadium zakken, verwijdert u het verstijfde weefsel met een apart mes en monteert u een nieuw weefsel. Ga door met snijden totdat er voldoende plakjes zijn verzameld.</li>
	<li>Kweek de platen in een bevochtigde couveuse op 37 °C, 5% CO2. De weefselplakjes worden gekweekt bij de lucht-vloeibare interfase op de celcultuurtussenvoegsel. De weefselplakjes zijn 24-48 uur na de eerste snijvoorbereiding klaar voor experimenten. Voor langdurige teelt, ruil het medium om de 2-3 dagen.</li>
</ol>2. Levensvatbaarheidsmeting
<ol><li>Voor de levensvatbaarheidsmeting van het weefselsegment u het medium uitwisselen met een op luminescentie gebaseerd levensvatbaarheidsregenagenagens dat zowel luciferase als prosubstrate met 1:1.000 verdunning in TSC-medium bevat volgens de instructies van de fabrikant. Het reagens meet de reductieactiviteit van levende cellen van gemetaboliseerd prosubstraat tot luciferin11. Breng 50 μL enzymsubstraatmengsel over op elk weefselsegment.</li>
	<li>Incubeer met zachte agitatie op een orbitale shaker in een bevochtigde couveuse op 37 °C met 5% CO2 's nachts.</li>
	<li>Lichtgevende signalen kunnen worden gemeten met behulp van een microplaatlezer of een in vivo beeldvormingsinstrument voor weefsels die in een 24-putplaat worden gekweekt. Om de individuele levensvatbaarheid van meerdere weefsels op een 6-putplaat te meten, moet een in vivo beeldvormingssysteem worden gebruikt.<ol>
<li>Wanneer u een microplaatlezer gebruikt, stelt u de microplaat in zonder het deksel. Elk type microplaatlezer dat de lichtsterkte kan meten, moet geschikt zijn voor het experiment. We gebruikten de volgende instellingen: leestijd = 1 s, meting vanaf de top, gain = 200. OPMERKING: Voor een hogere nauwkeurigheid gebruikt u een microplaat met witte wand om het experiment in te stellen. White-wall, clear-bottom 24 goed platen zijn getest, en in de meeste gevallen, duidelijke goed platen niet in gevaar brengen van de resultaten.</li>
		<li>Wanneer u een in vivo beeldvormingssysteem gebruikt om de levensvatbaarheid te meten, plaatst u de plaat in het midden van het podium en verwijdert u het deksel. Verwerf normale fotografische beelden gevolgd door lichtgevende beelden met een veld van podiuminstelling bij C, automatische belichtingstijd, f-stop = 1, objectieve instelling als microplaat met onderwerphoogte = 0,0 cm.</li>
		<li>Kwantificeer de lichtsterkte intensiteit met behulp van de imaging software vergezeld van het in vivo imaging systeem. Teken consistente gebieden van belang (ROI) rond elk weefselsegment. Dit protocol gebruikt een cirkel met een diameter van 1 cm als ROI (zie figuur 1). Meet de totale flux (p/s) van het gebied.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Evaluatie van het drugeffect op de weefselsegmenten
<ol><li>Meet de levensvatbaarheid van de basislijn vóór de behandeling met behulp van het op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidsreagens zoals uiteengezet in punt 2. OPMERKING: Als meerdere weefsels aanzienlijk minder levensvatbaar zijn dan andere, laat de weefsels van de test weg.</li>
	<li>Los geneesmiddelen op in dimethylsulfoxide (DMSO) om voorraadoplossingen te maken. Bereid een 10x drugoplossing voor met TSC of ander kweekmedium (25 μL/well voor een 24-putplaat met 250 μL medium) bij de gewenste concentraties. Bereid voor voertuigcontrole medium met een gelijkwaardig volume DMSO.</li>
	<li>Vul de 10x drug oplossing aan de cultuur medium aan de onderkant van de put. Meng door te pipetteren en breng 50 μL van het medium over de weefsels. OPMERKING: Als er meerdere weefselsegmenten beschikbaar zijn, test duplicaat of drievoud voor elke aandoening.</li>
	<li>Incubeer 's nachts met voorzichtig schudden op een orbitale shaker in een 37 °C, 5% CO2,bevochtigd incubator.</li>
	<li>Haal de plaat uit de shaker en incubeer statisch in de 37 °C, 5% CO2,bevochtigde couveuse.</li>
	<li>Meet op gewenste tijdpunten de lichtsterkte intensiteit van de weefsels met behulp van een microplaatlezer of een in vivo beeldvormingssysteem. Meestal worden drugseffecten detecteerbaar na 1-6 dagen behandeling. OPMERKING: Het op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidsreagens is stabiel gedurende ten minste 3 dagen onder kweekomstandigheden. Echter, het substraat kan worden uitgeput tijdens de test, afhankelijk van de metabolische activiteit van het weefsel. Als een significante signaaldaling wordt waargenomen in weefsels met eerder hoge signalen, vul het substraat in alle putten aan.</li>
	<li>Bereken de resterende levensvatbaarheid van de behandelde tumorweefsels met behulp van de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> De levensvatbaarheid van het behandelde weefsel wordt genormaliseerd door de uitgangslevensvatbaarheid en levensvatbaarheid verschuiving van controle tumorweefsels.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol tonen we een platform voor kwantitatieve en real-time onderzoek naar de werkzaamheid van geneesmiddelen op organotypic tumorweefselsegmenten. Het weefsel slice cultuursysteem biedt duidelijke voordelen ten opzichte van de traditionele cel-gebaseerde in vitro methoden door het vastleggen van cel heterogeniteit en fysiologische kenmerken van de inheemse tumor micro-omgeving. Dit platform maakt ook een hogere doorvoer mogelijk voor medicijnwerkzaamheidstests, waardoor de kloof tussen celkweekstudies en in vi...

Kankercelinteracties met de fysische en biochemische eigenschappen van het omringende stromale weefsel vormen de TME. TME kan tumorgroei stimuleren, metastase, en moduleren tumor reactie op therapie1. In conventionele preklinische geneesmiddelen ontwikkeling, kandidaat-geneesmiddelen worden meestal eerst gescreend met behulp van gekweekte kanker cellijnen, een test platform dat kritisch ontbreekt de TME2. Dit gebrek aan fysiologische TME in celgebaseerde prescreeningstadia kan de ontdekking van effectieve middelen in tumordragende diermodellen beperken en kan bijdragen aan het hoge uitputtingspercentage van veel veelbelovende oncologische geneesmiddelen in latere klinische stadia van ontwikkeling3.
Ondanks het belang van TME bij het moduleren van tumormedicijnreacties, beperken experimentele beperkingen de toepassing van meer fysiologisch relevante systemen in de vroege stadia van de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen. Het is onpraktisch om honderden therapeutische middelen te screenen op tumoren van diermodellen of tumormonsters van patiënten. Chirurgische specimens zijn immers schaarse middelen met uiteenlopende genetische achtergronden en het screenen van duizenden kandidaat-moleculen in diermodellen is niet haalbaar vanwege experimentele schaal, kosten en dierenwelzijn.
Tumorweefsel slice cultuur, waar precies gesneden, dunne tumor secties worden gekweekt ex vivo, kan de beperking van fysiologische TME in drug screening testen aan te pakken. Historisch, het gebied van de neurowetenschappen pionier en maakte uitgebreide optimalisaties van slice cultuur voor hersenweefsel4. Onlangs hebben veel studies aangetoond voorbereiding van plakjes uit verschillende soorten tumorweefsel, waaronder cellijn-afgeleide tumoren, spontane tumormodellen, patiënt-afgeleide xenografts (PDX), en primaire patiënt tumoren. Ex vivo tissue slice cultuur integreert voordelen van zowel in vivo als in vitro cultuur5. Tumorweefselsegmenten behouden intacte weefselarchitectuur en bonte celsamenstelling, waardoor kankercellen binnen de TME-context kunnen worden bestudeerd.
Dit protocol introduceert een organotypic tumor weefsel slice cultuursysteem gecombineerd met een real-time, zeer gevoelige levensvatbaarheid test om de reacties van geneesmiddelen te evalueren. De werkzaamheidstests van de drug op organotypic tumorweefselplakken in eerder geïntroduceerde protocollen zijn gebaseerd op het meten van veranderingen in de levensvatbaarheid van de cel door fluorescerende kleurstofopname, immunohistochemie (IHC) of MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenyltetrazoliumbromide) test6,7,8,9. Al deze methoden zijn echter eindpunttesten en hebben last van lage gevoeligheid, lange verwerkingstijd, complexe gegevensanalyses, een smal signaalbereik en een hoge experimentele fout. Onze luminescentie-gebaseerde live cel-compatibele reagens verbetert deze tests door het verstrekken van een breed signaal bereik en momentane (~ 5 min) meting zonder voorafgaande verwerking en minimale nabewerking. Dit reagens is zeer gevoelig en kan naast elkaar bestaan in de celcultuur media, waardoor continue en tijd-cursus meting van de levensvatbaarheid van de cel. Dit testsysteem is van toepassing op screening met hoge doorvoer van kandidaat-geneesmiddelen op weefselsegmenten in de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen.

<table><tbody><tr><td>10 cm schaal</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24-wells schaal</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>6 mm diameter Biopsy punch</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6-wells plaat</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>Belzer UW koude opslagoplossing (UW oplossing)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membraan Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Dubbele rand roestvrijstalen snijbladen</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>Voor snijden</td></tr><tr><td>Doxorubicin (hydrochloride)</td><td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Fijne tip tang</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Fijne tip tang</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>HBSS zonder Calcium, Magnesium of Fenol Rood</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, University of Utah</td><td>Borstkanker PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>Millicell Celcultuur Insert, 12 mm, hydrofiel PTFE, 0,4 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Celcultuur Insert, 30 mm, hydrofiel PTFE, 0,4 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Lijm</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Cel Levensvatbaarheid Assay</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Eenvoudige rand Industriële Scheermessen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Voor het verwijderen van gelijmde weefsels</td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>Voor TSC medium</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tandvormige tang</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetten</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Brede tip</td></tr><tr><td>Transfer pipetten</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Fijne tip</td></tr><tr><td>William's medium E, zonder glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>Voor TSC medium</td></tr></tbody></table>

het meten van real-time drug respons in organotypic tumor tissue slices

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Tumorweefsels zijn samengesteld uit kankercellen, geïnfiltreerd immuuncellen, endotheelcellen, fibroblasten, en extracellulaire matrix. Dit complexe milieu vormt de tumormicroomgeving (TME) en kan de respons op therapie in vivo of medicamenteuze respons ex vivo moduleren. Conventionele kanker drug ontdekking schermen worden uitgevoerd op cellen gekweekt in een monolayer, een systeem kritisch ontbreekt de invloed van TME. Zo zullen experimentele systemen die gevoelige en hoge doorvoertesten integreren met fysiologische TME het preklinische medicijndetectieproces versterken. Hier introduceren we ex vivo tumorweefselslicecultuur als platform voor screening van middelhoge doorvoervan geneesmiddelen. Organotypic weefsel slice cultuur vormt precies gesneden, dunne tumor secties die worden gehandhaafd met de steun van een poreus membraan in een vloeibare lucht interface. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding en het onderhoud van weefselsegmenten bereid uit muistumoren en tumoren van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen. Om veranderingen in de levensvatbaarheid van het weefsel te beoordelen in reactie op de behandeling van geneesmiddelen, maakten we gebruik van een biocompatibele op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidstest die real-time, snelle en gevoelige meting van levensvatbare cellen in het weefsel mogelijk maakt. Met behulp van dit platform evalueerden we dosisafhankelijke reacties van weefselschijfjes op de multi-kinase-remmer, staurosporine en cytotoxische agent doxorubicine. Verder tonen we de toepassing van weefselsegmenten voor ex vivo farmacologie aan door 17 klinische en preklinische geneesmiddelen te screenen op weefselsegmenten bereid uit één PDX-tumor. Ons fysiologisch relevante, zeer gevoelige en robuuste ex vivo screeningplatform zal de ontdekking en besluitvorming van preklinische oncologiegeneesmiddelen sterk versterken.

Hier tonen we een tijd-cursus, meerdere drug werkzaamheid evaluatie protocol voor tumorweefsel plakjes bereid uit muis 4T1 borsttumor weefsels en een borstkanker PDX model, HCI01012. We hebben met succes weefselplakjes voorbereid van verschillende muis-afgeleide tumoren, PDX, en verse patiënt tumoren10. De algehele workflow van de tumorweefselvoorbereiding en de werkzaamheidstest van geneesmiddelen wordt beschreven in figuur 1. In het algemeen ...

We introduceren een protocol voor het meten van real-time reactie van geneesmiddelen in organotypic tumorweefsel plakjes. De hier geschetste experimentele strategie biedt een platform voor het uitvoeren van medium-high throughput drug schermen op weefselsegmenten afgeleid van klinische of muistumoren in ex vivo omstandigheden.

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Ons protocol is compatibel met andere moleculaire analysemethoden en maakt de beoordeling mogelijk van hoe geneesmiddelen de levensvatbaarheid van in-tact weefselplakken en de prestaties van medium doorvoerscreening beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de levensvatbaarheid van een hele weefselschijf in real time kunnen meten met zeer weinig voor- of nabewerking. Deze techniek versnellen pre-klinische geneesmiddelen ontwikkeling en oncologie door het testen van kandidaat-lidstaten of weefsels plakjes rechtstreeks verworven uit patiënt tumor weefsel monsters.Onze real-time weefsel levensvatbaarheid beoordeling methode is heel veelzijdig en kan worden toegepast op kanker biologie, neurowetenschappen, en ontwikkelingsbiologie studies. Het voorbereiden van in-tact levensvatbare weefselschijfjes is de sleutel tot het succes van de procedure. De vibratome-instellingen in gemiddelde samenstelling moeten worden aangepast aan het weefseltype en de stevigheid.Op de dag van de tumor weefsel slice acquisitie, aliquot 250 microliter van weefsel slice cultuur medium per goed in een 24 goed plaat en plaats een weefsel cultuur invoegen in elke put. Plaats de plaat ver

measuring-real-time-drug-response-in-organotypic-tumor-tissue-slices

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Source: Ciraku, L., et. al. An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the imaging of luciferase-expressing tumor cells in an organotypic mouse brain slice. Luciferin is added to the medium, and the plate is placed inside the chamber of the in vivo imaging system. Parameters for image capture are adjusted, and the tumor's shape and size are defined. The bioluminescent signals emitted by the tumor...

Bioluminescence Imaging to Assess Tumor Growth in an Organotypic Mouse Brain Slice

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Veel typen menselijke hersentumoren zijn gelokaliseerd in specifieke gebieden in de hersenen en zijn moeilijk te laten groeien in cultuur. Dit protocol behandelt de rol van de tumormicro-omgeving en onderzoekt nieuwe medicamenteuze behandelingen door fluorescerende primaire hersentumorcellen te analyseren die groeien in een organotypische muizenhersensnede.

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Wij bieden een methode voor de generatie, de teelt en de systematische analyse van organotypic plakjes afgeleid van lymfkliertest Long tumoren. Ook beschrijven we hoe u kunt optimaliseren voor segment dikte en drug concentraties te behandelen tumor segmenten te selecteren.

Vaststelling en analyse van Tumor segment Explants als een voorwaarde voor het kenmerkende testen

Dit protocol beschrijft de bereiding van organotypische plakculturen (OTSC's). Deze techniek vergemakkelijkt de ex vivo kweek van intact meercellig weefsel. OTSC's kunnen onmiddellijk worden gebruikt om te testen op hun respectieve respons op geneesmiddelen in een meercellige omgeving.

Organotypische plakculturen als preklinische modellen van tumormicro-omgeving bij primaire alvleesklierkanker en metastase

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde methode voor medium- tot high-throughput organoïde medicijnscreenings en microscoop-agnostische, geautomatiseerde beeldanalysesoftware om multiparametrische, single-organoïde geneesmiddelresponsen te kwantificeren en te visualiseren om intratumor heterogeniteit vast te leggen.

Multiparametrische tumor organoïde drug screening met behulp van Widefield Live-Cell Imaging voor bulk en single-organoïde analyse

We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

Leer hoe u real-time medicijnrespons meet in organotypische tumorsnijden voor oncologisch onderzoek. Deze methode versnelt preklinische medicijnontwikkeling door middel van medium-throughput screening op intact weefsel.

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Meer video's verkennen