In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding
1 mei 2020
Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire verdringing om een in vitro menselijk hypertrofisch littekenweefselmodel te creëren dat lijkt op in vivo omstandigheden. Wanneer gecultiveerd in een drukke macromoleculaire omgeving, menselijke huid fibroblasten vertonen fenotypes, biochemie, fysiologie, en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.
We creëerden een individueel collageenrijk model om de omgeving na te bootsen die cellen in vivo ervaren met behulp van de macromoleculaire verdringingstechniek. Huid is een drukke omgeving, in tegenstelling tot de vloeibare omgeving die we al gebruiken om cellen in vitro te kweken. Vergeleken met de traditionele monolayer cel cultuur systeem, dit model reconstrueert de drukke moleculaire omgeving die cellen ervaren in vivo, vooral in littekenweefsel waar overvloedige extracellulaire matrix verdringt vloeibaar water.
Naast hypertrofische littekens kan deze macromoleculaire verdringingstechniek worden gebruikt voor studies waarbij de extracellulaire matrix overvloedig aanwezig is, zoals longfibrose. Groeien litteken-afgeleide en normale fibroblasten volgens manuscript richtingen. Dan zaad ze in 24 goed platen op 50.000 cellen per put in een milliliter van medium.
Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Bereid macromoleculaire verdringing of MMC-media voor door Ficoll 70, Ficoll 400 en ascorbinezuur te mengen tot 10%FCS DMEM. De media in een waterbad uitbroeden om de crowders in de oplossing te verspreiden.
Steriliseer het vervolgens met een filter van 0,2 micrometer. Aspirate de gebruikte media van de fibroblasten en vervang het door vers gemaakte MMC media. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius gedurende zes dagen, het veranderen van de MMC media om de drie dagen.
Bereid een Sirius Red oplossing door het oplossen van 0,2 gram Direct Red 80 poeder in 200 milliliter gedestilleerd water met een milliliter azijnzuur. Aspirate de MMC media uit de cellen en voeg 300 microliter van Sirius Red oplossing aan elke put. Breng de cellen vervolgens 90 minuten terug naar de couveuse.
Na de incubatie spoel je de Sirius Red-oplossing voorzichtig af met kraanwater en laat je de plaat 's nachts drogen. Op de volgende dag, extract de Sirius Red door het toevoegen van 200 microliters van 0,1 molaire natriumhydroxide in elke put en schudden van de plaat gedurende vijf tot 10 minuten. Breng 100 microliter van de geëxtraheerde vlek over in een transparante 96 putplaat en meet de absorptie op 620 nanometer met een microplaatlezer.
Was elk goed met 200 microliters PBS en bevestig de cellen met methanol op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 3%BSA toe aan de putten en broed de plaat 30 minuten uit bij kamertemperatuur. Aspirate de blokkerende oplossing en voeg 200 microliter anti-collageen een antilichaam aan elke put.
Broed de plaat 90 minuten in. Spoel dan het antilichaam aan en was de putten drie keer met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voeg 200 microliters van Goat Anti-Rabbit-FITC Secondary Antibody en DAPI toe aan elke put.
Bedek de plaat met aluminiumfolie en broed deze 30 minuten uit bij kamertemperatuur. Gooi het secundaire antilichaam en DAPI weg en herhaal de wasbeurten met PBS. Visualiseer vervolgens de fluorescentie direct onder een microscoop.
Na het wassen van de cellen twee keer met PBS, voeg 40 microliters van lyse buffer in elke put en schraap de cellaag met een pipet tip. Breng vervolgens het eiwitlysaat over in microcentrifugebuizen om de eiwitconcentratie te meten. Laad 10 microgram eiwit in elke put van een vier tot 12%Bis-Tris eiwitgel en voer SDS-PAGE uit op 200 volt gedurende 30 minuten.
Breng het eiwit na het einde over op een nitrocellulosemembraan door gedurende 90 minuten een westelijke vlek op 90 volt te laten lopen, waarbij u ervoor zorgt dat bellenvorming tussen de gel en het membraan wordt vermeden. Blokkeer het membraan met 10 milliliter blokkeerbuffer. Dan uitbroeden met primaire antilichamen op vier graden Celsius 's nachts.
Op de volgende dag, was het membraan vijf keer met 0,1 procent TBS Tween 20 voor vijf minuten per wasbeurt. Vervolgens broeden het membraan met een soort-geschikte secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur. Herhaal de wasbeurten en visualiseer fluorescentie met een beeldvormingssysteem.
Na het zuiveren van het totale RNA met een commerciële RNA-extractiekit, meet u de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer voor microvolumes. Gebruik vervolgens een cDNA synthese kit om een eerste streng DNA synthese uit te voeren. Meng de cDNA met 10 microliters van SYBR Green Supermix en breng de monsters over naar een aangepaste 96 putplaat voorgecoat met oligonucleotide primers.
Pas het totale volume aan op 20 microliter per put met water en voer RT-PCR uit volgens de handbeschrijvingen van het manuscript. Celdichtheid van hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huid fibroblasten aanzienlijk toegenomen na het kweken met Ficoll in vergelijking met het gebruik van PVP of de controle. Macromoleculaire verdringing met Ficoll bij 9% fractionele volume bezetting aanzienlijk versterkt de afzetting van collageen, met inbegrip van collageen een, in vergelijking met andere formuleringen.
Dit werd verder aangetoond met kwantitatieve analyse. Scar-afgeleide fibroblasten en normale huidfibroblasten gekweekt in MMC omgevingen bleken de expressie van ECM soorten te reguleren in aanvulling op collageen. Met name, een verhoogde expressie van matrix metalloproteinases of MMP's bleek te accumuleren in hypertrofische littekenweefsels in vergelijking met inheemse weefsels.
Opgemerkt werd dat de expressie van MMP2, negen en 13 waren aanzienlijk up-geregeld in beide celculturen gecultiveerd in macromoleculaire verdringing voorwaarden. MMP's spelen een belangrijke rol bij wondgenezing en littekenvorming, het reguleren van ECM-assemblage en remodellering. Synthese van interleukine zes en vasculaire endotheel groeifactor was niet op te sporen in een westelijke vlek.
Maar RT-PCR analyse bleek dat de expressie van interleukine zes was aanzienlijk up-gereguleerd, terwijl de expressie van vasculaire endotheel groeifactor was down-gereguleerd in fibroblasten gecultiveerd in MMC voorwaarden. Bij het proberen van dit protocol, is het zeer belangrijk om huidfibroblasten die zeer weinig CO-pathogenen hebben kiezen. We moeten ook in gedachten houden dat ascorbinezuur is een essentieel ingrediënt in het MMC medium.
We zijn vooral geïnteresseerd in het verder detecteren van de collageendepositie en uitlijning in dit MMC-model. We zijn van plan om geavanceerde microscopische technieken te gebruiken om dit in vitro model te vergelijken met inheemse littekenweefsels in vivo. We moedigen anderen aan om deze macromoleculaire verdringingstechniek te gebruiken om de in vitro authenticiteit van de bijkomende modale weefsels te verbeteren.
Natuurlijk kan macromoleculaire verdringing ook worden gebruikt om modellen van ziekte en pathologie in vitro te herberekenen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire crowding om een in vitro model van menselijk hypertrofisch littekenweefsel te creëren dat lijkt op in vivo condities. Wanneer ze worden gekweekt in een macromoleculair crowded milieu, vertonen menselijke huidfibroblasten fenotypen, biochemie, fysiologie en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Tissue Engineering
Achtergrond
- De huid is een dichtbevolkte omgeving, in tegenstelling tot traditionele vloeibare celculturen.
- Hypertrofische littekens vertonen unieke cellulaire kenmerken.
- Macromoleculaire crowding kan de in vivo condities voor fibroblasten nabootsen.
- Deze techniek kan mogelijk ook worden toegepast op andere aandoeningen, zoals longfibrose.
Doel van de studie
- Om een model te ontwikkelen dat de in vivo-omgeving van littekenweefsel nauwkeurig weerspiegelt.
- Om het gedrag van fibroblasten in een dichtbevolkte extracellulaire matrix te bestuderen.
- Om het begrip van littekenweefselvorming en aanverwante aandoeningen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Creatie van een collageenrijk model met behulp van macromoleculaire crowding.
- Vergelijking met traditionele monolayer-celluulturesystemen.
- Uitplaten van litteken-afgeleide en normale fibroblasten in 24-wellplaten.
- Toepassing van specifieke groeiomstandigheden volgens de aanwijzingen in het manuscript.
Belangrijkste resultaten
- Fibroblasten in de overvolle omgeving vertonen littekenachtige kenmerken.
- Het model bootst de extracellulaire matrix van littekenweefsel succesvol na.
- De bevindingen suggereren potentiële toepassingen bij het bestuderen van andere fibrotische aandoeningen.
- De belangrijkheid van omgevingsfactoren voor het celgedrag is aangetoond.
Conclusies
- De techniek van macromoleculaire crowding is effectief voor het modelleren van hypertrofische littekens.
- Deze benadering kan inzicht bieden in het gedrag van fibroblasten bij fibrotische ziekten.
- Toekomstige studies kunnen dit model verder uitbreiden voor diverse toepassingen binnen de tissue engineering.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Macromoleculaire crowding (MMC) maakt de creatie mogelijk van in vitro-modellen die de omgeving van de extracellulaire matrix van menselijke hypertrofische littekens nauwkeurig nabootsen, waarmee een kritisch gat in translationeel onderzoek naar fibrose wordt gedicht. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen voor targetvalidatie in een vroeg stadium en ondersteunt mechanistische risicoreductie in pipelines voor fibrotische aandoeningen. De fysiologische relevantie en schaalbaarheid van het model positioneren het als een herbruikbaar platform voor portfoliobrede studies naar fibrose en ECM-remodellering.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar fibrotische routes en mechanismen voor ECM-remodellering in een fysiologisch relevante context.
- Ondersteunt de functionele validatie van targets die betrokken zijn bij collageendepositie en de regulatie van matrixmetalloproteïnasen.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid voor de verdere ontwikkeling van anti-fibrotische kandidaten door in vivo-achtige kenmerken van littekenweefsel na te bootsen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar systeem voor de kwantitatieve beoordeling van de depositie van collageen en ECM-eiwitten.
- Maakt robuuste screening mogelijk van verbindingen die gericht zijn op littekenvorming en matrixremodellering.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de assay en het hergebruik van het platform voor high-content analyse van fibrotische responsen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt in vitro-bevindingen af op ziekterelevante biomarkers, zoals de expressie van collageen I, MMP2, MMP9 en MMP13.
- Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door de biologie van menselijk littekenweefsel te modelleren zonder gebruik van diermodellen.
- Vermindert de risico's bij translationele vooruitgang door mechanistische inzichten te verschaffen in ECM-dynamiek en fibrotische signalering.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit MMC-gebaseerde model is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinische fase voor programma's op het gebied van fibrose en wondgenezing.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests over ECM-regulatie en activering van fibrotische pathways in menselijke fibroblasten.
- Screening: Levert kwantitatieve resultaten van collagedepositie en matrixproteïne-expressie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van ECM-gerelateerde gen- en proteïne-expressie over verschillende experimentele condities mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Biedt continuïteit voor biomarker-afstemming en mechanistische studies die relevant zijn voor menselijke pathologie.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een schaalbaar, ethisch preferabel alternatief voor diermodellen voor diverse onderzoeken naar fibrotische ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van fibrose-targets.
- Operationele waarde: Standardiseert in vitro modellering van ECM-rijke weefsels met reproduceerbare, schaalbare protocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van vroege risicoreductie van anti-fibrotische strategieën.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van assets voor fibrose en wondgenezing.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de kweek van primaire menselijke fibroblasten en ECM-analyse.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie, plaatlezers en instrumentatie voor moleculaire biologie is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van MMC-media en kwantitatieve assay-protocollen.
- Aanpasbaar aan andere ziektebeelden met veel ECM, zoals longfibrose, mits het protocol wordt geoptimaliseerd.
- Afhankelijk van hoogwaardige fibroblastbronnen met weinig contaminanten en een nauwkeurige omgang met reagentia.
