Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Virusbacteriële interacties kunnen belangrijk zijn voor een succesvolle virale infectie en stimulatie van een gastheer immuunrespons. Maar op dit moment, sterk geconcentreerde en gezuiverde voorraad van menselijk norovirus kan niet worden geproduceerd in het lab. Deze techniek kan worden gebruikt met elk virus dat zich bindt aan bacteriën, waarvoor virusachtige deeltjes of levend virus beschikbaar zijn.

Het stelt ons in staat om interacties tussen deze virussen en bacteriën te kwantificeren. Inoculeren vijf milliliter vloeibaar medium met een enkele geïsoleerde kolonie Enterobacter cloacae uit een agarplaat rechtstreeks uit bevroren glycerolvoorraad. Laat de bacteriën 's nachts groeien.

De volgende dag, breng 1,3 milliliter aliquots van de cultuur in twee aparte 1,5 milliliter centrifuge buizen. Centrifugeren de buizen op 10, 000 x g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatants, dan was de monsters twee keer met behulp van een milliliter steriele 1X PBS voor elke wasbeurt.

Centrifugeren de monsters opnieuw op 10, 000 x g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1,3 milliliter steriele 1X PBS. Beginnend met 0,5 milliliter gewassen cultuur, verdun de bacteriën in 1X PBS in serie van 10 tot min 10 tot min vier.

Met behulp van een spectrofotometer meet u de optische dichtheid van de gewassen onverdunde cultuur en elk van de vier verdunningen op 600 nanometer. Voer 10-voudige seriële verdunningen uit in 1X PBS voor elk van de vorige verdunningen. Verspreid 100 microliter van de laatste drie verdunningen voor elke serie op agarplaten om het aantal kolonievormende eenheden per milliliter per monster te bepalen.

Laat de platen vijf minuten drogen op kamertemperatuur. Keer de platen om en broed ze in de couveuse. Na het voorbereiden van de reagentia, antilichamen en bacteriën zoals beschreven in het manuscript, assembleren alle materialen in een BSL-2 biosafety kabinet.

Virusachtige deeltjes voor menselijk norovirus worden vermeld als BSL-2-pathogenen en alle werkzaamheden uitvoeren met VLP moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidskast. Voeg 10 microgram menselijk norovirus VLPs toe aan elke buis van bacteriën en meng grondig door pipetting. Incubeer de buizen gedurende een uur bij 37 graden Celsius met constante rotatie.

Na incubatie, centrifugeren de buizen op 10, 000 x g gedurende vijf minuten. Aspirate en gooi de supernatant en resuspend de bacteriële pellet in een milliliter pbs. Na het herhalen van de wasstappen eenmaal, centrifugeren de buizen weer op 10, 000 X g gedurende vijf minuten.

Gooi de supernatant weg en stel de VLP-bacteriepellet opnieuw op in 150 microliter van 5% blokkerende buffer. Een veel voorkomende fout die optreedt is dat buizen worden verwisseld en de verkeerde behandeling wordt toegevoegd. Om dit te voorkomen, schik alle buizen in lijnen die overeenkomen met de juiste behandeling en voeg een behandeling in een keer aan de buizen.

Voor elk bacterieel monster, bereid 50 microliter van verdunde menselijke norovirus GII antilichaam. Verdun het antilichaam met 5% tot 125 voor E.cloacae-monsters. Bereid 50 microliter van verdund isotype antilichaam voor elk bacterieel monster met dezelfde verdunningsverhoudingen.

Verdeel elk bevestigingstestmonster in 350 microliter aliquots door ze over te brengen in schone 1,5 milliliter centrifugebuizen. Als u niet-bevlekte besturingselementen wilt maken, voegt u 50 microliters blokkeringsbuffer toe aan de eerste aliquot van elk bacterieel monster. Voeg voor de gekleurde monsters 50 microliter van de GII-antilichaamverdunning toe aan de tweede reeks aliquoten.

Maak de isotyperegelaars door 50 microliter van het verdunde isotypeantilichaam toe te voegen aan de derde reeks aliquots. Broed alle monsters op ijs en in het donker gedurende 30 minuten. Dan centrifugeren alle monsters op 10,000 X g gedurende vijf minuten.

Gooi de supernatants weg en verleg elk monster in 150 microliter van FCSB. Nogmaals, centrifuge alle monsters op 10,000 X g gedurende vijf minuten. Nogmaals, gooi de supernatants en resuspend de monsters in 100 microliters van FCSB.

Na het centrifugeren van de monsters een laatste keer en het weggooien van de supernatants, resuspend de monsters in 150 microliters van FCSB. Breng elk monster over op een buis met 400 microliter FCSB voor een totaal volume van 550 microliter. Bewaar de monsters op 4 graden Celsius totdat ze worden geanalyseerd door stroomcytometrie.

VLP-bijlage werd gemeten met behulp van stroomcytometrie. Ten eerste, dichtheid percelen werden gebruikt om poort uit cellulaire puin, gevolgd door de daaropvolgende punt plot gating om bacteriële doubletten en cellulaire klonten te verwijderen. Representatieve histogrammen tonen een gebrek aan PE signaal in bacteriële alleen monsters en een verschuiving in PE signaal intensiteit in VLP: bacterie monsters in vergelijking met onbevlekte en isotype controles.

Na een uur incubatie met 10 microgram VLP, stroom cytometrie gedetecteerd deeltjes binding aan zowel E.colacae en L.gasseri. Om de grens van bindende kwantificering voor deze test te bepalen, werd een verdunningsreeks van de VIP's gegenereerd voorafgaand aan de toevoeging aan de bacteriën. Verminderingen van de hoeveelheid VLP resulteerden in overeenkomstige reducties tot de procentbacteriën die gebonden zijn door VLP.

Het kennen van het virus: bacterie verhouding en het houden van de verhouding consistent tussen experimenten is belangrijk bij het interpreteren van resultaten. Bacteriële en virale mutanten kunnen worden gegenereerd om specifiek te bepalen van de microbiële oppervlaktestructuren die deze interactie bemiddelen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om vragen te beantwoorden over omstandigheden en aandoeningen die invloed hebben op norovirus-bacteriële interacties, met inbegrip van hoe veranderingen in het virus genotype, bacteriële groei voorwaarden, en veranderingen in bacteriële oppervlaktestructuren veranderen virale binding.