Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Het protocol dat we hier presenteren zal nuttig zijn voor ons om te begrijpen hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel auto-immuunziekte. Met deze methode kunnen lymfocyten in de hersenen per cel worden bestudeerd. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere modellen en de ziekte van het centrale zenuwstelsel die nodig zijn om de kenmerken en functies van immuuncellen te analyseren.

In deze video kan het protocol gemakkelijk aantonen hoe u model induceert en enkele cellen in de hersenen kan isoleren. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, gebruik een een milliliter spuit onderhuids injecteren verdoofd C57BL/6 muizen met 100 microgram van geëmulgeerde MOG 35-55 in 100 microliter van complete Freund's adjuvans in twee verschillende sites van de rug in de buurt van de nek. Op dezelfde dag en op dag twee na de communicatie, intraperitoneally injecteren van de muizen met 200 microliters van een nanogram per microliter pertus toxine toxine werkende oplossing.

Na de tweede injectie, breng de muizen terug naar hun kooi thuis met een opwarming pad en monitoring tot volledige recumbency. De volgende dag en in de loop van de ziekte, onderzoeken en beoordelen van alle muizen op een geblindeerde manier voor de neurologische symptomen beschreven in de tabel en voor eventuele veranderingen in gewicht. Snijd op het juiste experimentele eindpunt de schedel voorzichtig van de neus naar de nek en breng de hersenen van elk dier van de schedeldoos over in individuele 50 milliliter buizen met 10 milliliter RPMI-medium.

Meng de buizen goed om de aanhangende rode bloedcellen te verwijderen en verwijder het medium door aspiratie. Voeg 10 milliliter vers medium toe aan elke buis en breng de hersenen over in individuele 100 millimeter schotels. Tot slot hak elke hersenen met een scheermes en gebruik een plastic pipet om zo veel weefsel van een schotel op een moment en zes milliliter medium in een ijskoude zeven milliliter gecentreerd glas homogenisator.

Maal de hersenen met behulp van de losse zuiger van de stamper voor het gebruik van de strakke zuiger om het weefsel te brengen totdat de suspensie homogeen is. Giet vervolgens de resulterende weefseldrijfmest in een voorgekoelde conische buis van 15 milliliter op ijs. Wanneer alle monsters zijn gehomogeniseerd, pas het volume in elke buis aan op zeven milliliter met vers medium, voordat elke weefselsuspensie wordt toegevoegd aan een nieuwe gekoelde buis van 15 milliliter met drie milliliter van 100%keldermembraanmatrijs per buis.

Meng door inversie een paar keer en gebruik een drie milliliter pipet om zorgvuldig en langzaam een milliliter van 70 procent dichtheid gradiënt oplossing onder elk weefsel oplossing monster toe te voegen. Scheid de cellen door dichtheidgradiënt centrifugatie en verwijder bijna alle van de bovenste laag, waarbij ervoor wordt gezorgd dat alle myeline volledig te verwijderen. Breng de interface over in een nieuwe buis van 15 milliliter en pas het volume aan op 10 milliliter met vers medium.

Dan centrifugeren de monsters opnieuw en verwijder de supernatant alvorens de pellets opnieuw in ongeveer 100 microliter van medium per buis. Voor flow cytometrische analyse van de geoogste hersencellen, toewijzen ongeveer twee keer 10 aan de zes cellen in 100 microliter van medium in individuele putten van een 96-put plaat. Wanneer alle cellen zijn verguld, voeg 100 microliters van 500X cel stimulatie cocktail plus eiwit transport remmers aan de putten en plaats de plaat in de cel cultuur incubator voor vier uur.

Aan het einde van de incubatie pool de cellen aan de onderkant van de putten door centrifugatie en resuspend de pellets in 100 microliters van flow cytometrie buffer per goed. Pre-incubeer de cellen met drie microliters van Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius voordat u kleurt. Om niet-specifieke door de Fc gemedieerde interacties te blokkeren.

Voeg aan het einde van de incubatie de antilichaamcocktail van belang toe aan elke put en plaats de plaat op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Na 30 minuten, was de putten met 100 microliters van stroom cytometrie buffer per goed en sediment de cellen door centrifugatie. Na het verwijderen van de supernatants, voeg 200 microliters van intracellulaire fixatie buffer aan elke put.

Na een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur, verzamel de monsters door centrifugatie en resuspend de pellets in 200 microliters van 1X permeabiliteit buffer per goed. Centrifuge de monsters opnieuw, en na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellets in 100 microliters met verse permeabilisatie buffer. Voeg vervolgens de juiste antilichamen toe voor de detectie van intracellulaire antigenen van belang gedurende een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht.

Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliter 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke put en draai de monsters door centrifugatie. Vervolgens, resuspend de vlekcellen in 200 microliters van flow cytometrie kleuring buffer en analyseren van de cellen door stroom cytometrie volgens standaard protocollen. Een typisch klinisch verloop van EAE moet resulteren in een ziektecurve en verandering in lichaamsgewicht zoals afgebeeld.

C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOG 35-55 beginnen meestal ziektesymptomen te ontwikkelen rond dag 10 tot 12 en bereiken de piek van de ziekte rond dag 15 tot 21. Vóór het begin van de ziekte neemt het lichaamsgewicht van geïmmuniseerde muizen geleidelijk toe voordat het afneemt in correlatie met de toenemende ziektesymptomen De muizen tonen het laagste lichaamsgewicht aan op het hoogtepunt van EAE, waarbij het lichaamsgewicht enigszins herstelt naarmate de klinische symptomen afnemen. De muizen herstellen meestal echter niet volledig en ontwikkelen meestal een monofasische chronische ziektepathologie.

Zoals deze representatieve stroomanalyse illustreert, worden interferon gammaproducerende Th1- en IL17-producerende Th17-cellen aanzienlijk verhoogd in EAE-muizen. De belangrijkste stap is 3.10. De operator moet de middelste laag overbrengen en het licht, zorgvuldig zijnd, neem zo weinig mogelijk andere lagen.

Volgens dit protocol kunnen we verder T-lymfocyten voor verdere transcriptie-analyse om te bestuderen