Name: Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de elektrochemiluminescentie-immunoassay (ECLIA) voor het kwantificeren van MeCP2-eiwitvarianten in een 96-well formaat. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid dan Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn Dr. Brigitte Sturm zeer dankbaar voor haar steun aan het ECLIA-instrument.

Goedkeuring voor huidbiopsie inkoop voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen van de Human Research Ethics Committee van het Children's Hospital in Westmead, Australië. Toestemming voor dierproeven werd verkregen van het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Economie, die werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
OPMERKING: Het beginsel van het ECLIA-systeem is afgebeeld in figuur 1.
1. Selectie van antilichamen
<ol><li>Evalueer de signaal-ruisverhouding voor een reeks verschillende MeCP2-antilichamen en identificeer de beste signaalsterkte en hoogste specificiteit binnen de combinatie van een primaire muismonoklonale MeCP2-antilichaam (kloon Mec-168) en konijnenpolyklonale MeCP2-detectieantilichaam (op maat gemaakt). Gebruik voor het secundaire antilichaam een systeemspecifiek antilichaam (Tabel van materialen),dat ook experimenteel werd geverifieerd. OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van alle geverifieerde antilichamen tijdens de mecp2-ECLIA-ontwikkeling en hun geteste verdunningsbereiken.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Functie</td>
			<td>Naam</td>
			<td>Kloon</td>
			<td>Verdunning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primaire</td>
			<td>Muis, anti-MeCP2</td>
			<td>Mec-168</td>
			<td>1:500−1:10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primaire</td>
			<td>Muis, anti-MeCP2</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250−1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primaire</td>
			<td>Muis, anti-MeCP2</td>
			<td>Mannen-8</td>
			<td>1:500−1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primaire</td>
			<td>Muis, anti-MeCP2</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500−1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primaire</td>
			<td>Konijn, anti-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500−1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundaire</td>
			<td>Konijn, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2.000−1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundaire</td>
			<td>Konijn, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2.000−1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detectie</td>
			<td>SULFO-TAG gelabeld anti-konijn</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500−1:1.000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lijst van antilichamen en gebruikte werkverdunningen.
<ol start="2"><li>U ook elk paar MeCP2-antilichamen gebruiken dat goed werkt met conventionele ELISA.</li>
</ol>2. Behandeling van HDF's met TAT-MeCP2-fusie-eiwit
OPMERKING: TAT-MeCP2 werd recombinantly uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van standaard chromatografische technieken zoals eerder beschreven8 en opgeslagen bij -80 °C.
<ol><li>Plaat 1 x 106 menselijke dermale fibroblast (HDF) cellen in 100 mm schotels en groeien de cellen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 totdat ze ongeveer 90% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Neem één flesje TAT-MeCP2-fusieeiwit. Ontdooi op ijs en meng zachtjes.</li>
	<li>Verdun TAT-MeCP2 tot een eindconcentratie van 500 nM in 50 mL hdf-cultuurmedia.</li>
	<li>Verwijder de media uit 100 mm schotels en incubeer de cellen met 500 nM TAT-MeCP2 bij 37 °C gedurende verschillende incubatieperioden tot 24 uur.</li>
	<li>Verwijder de TAT-MeCP2-oplossing uit de cellen. Was de cellen 2x met voorverwarmde Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).</li>
	<li>Behandel de cellen met 2 mL van 0,05% trypsin-EDTA-oplossing gedurende 5 min bij 37 °C10.</li>
	<li>Voeg 6 mL HDF-kweekmedia toe om de trypsine te activeren en de cellen in buizen van 15 mL te verzamelen.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugering op 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en was de cellen 2x met ijskoude DPBS. Bewaar de pellet op ijs en ga verder met monstervoorbereiding.</li>
</ol>3. Bereiding van de monsters
<ol><li>HDF lysates<ol>
<li>Bepaal de hoogste eiwitniveaus van MeCP2 met behulp van de REAP-methode voor subcellulaire fractionering in de cytoplasmaen en nucleaire subcellulaire compartimenten volgens Suzuki et al.11. Beperk fractionatie tot niet meer dan zes monsters per experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muis hersenen lysert<ol>
<li>Bereid 100 mL van elke hypotonische lyse reagens en extractiebuffer.<ol>
<li>Meng voor de hypotonische lysereagens goed 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride en 10 mM kaliumchloride.</li>
			<li>Meng voor de extractiebuffer goed 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride, 0,42 M natriumchloride, 0,2 mM EDTA en 25% (v/v) glycerol.</li>
			<li>Stel de pH van beide buffers aan op 7,9.</li>
			<li>Voeg 1 mM dithiothreitol (DTT) en 1x proteaseremmercocktail vers toe aan beide buffers. Chill op ijs voor gebruik.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schort 100 mg totale muishersenen op (stam: C57BL/6J, wildtype man en vrouw en B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous mannetje en heterozygoot vrouwtje; leeftijd: 4−8 weken oud) in 1 mL van ijskoud hypotonisch lysisreagens.</li>
		<li>Homogeniseer de hersenen met een voorgekoelde Dounce all-glas weefsel homogenisator door 15 slagen van homogenisator A (los, voor grote klaring) en B (strak, voor kleine klaring), respectievelijk.</li>
		<li>Breng de gehomogeniseerde cellen over in een schone buis en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg (of bewaar het als cytoplasmatische fractie voor verder gebruik).</li>
		<li>De pellet opnieuw opschorten in 140 μL extractiebuffer per 100 mg uitgangsmateriaal. Plaats de buis in een voorgekoeld thermoblok en meng zachtjes gedurende 30 min bij 4 °C.</li>
		<li>Centrifugeer de buis op 16.000 g gedurende 10 min bij 4 °C. Breng de supernatant (d.w.z. de kernfractie) over op een nieuwe voorgekoelde buis en bewaar bij -80 °C tot gebruik. OPMERKING: De eiwitconcentratie van lysaten afkomstig van muishersenen en HDF's kan worden beoordeeld door de BCA-eiwittest.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-ECLIA-protocol
<ol><li>Bereiding van wasoplossing, blokkerende buffer en testverdunningsoplossing (dag 1)<ol>
<li>Voeg 500 μL Tween 20 tot 1 L PBS toe om een 0,05% Tween 20 in PBS-oplossing te bereiden, meng krachtig en label als "wasoplossing". LET OP: Zorg ervoor dat alleen vers bereide wasbuffer wordt gebruikt.</li>
		<li>Bereid een blokkeraat van 3% A (Tabel van materialen) voor in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meng door zacht roeren, filter steriliseren en bewaar ze in de koelkast tot gebruik voor een maximum van twee weken.</li>
		<li>Voeg 5 mL blokkeringsoplossing toe aan 10 mL PBS om testverdunningsoplossing (1% blokker A in PBS) voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coating van hoge bindplaten<ol>
<li>Neem een 96-well multi-array single spot high bind plate. LET OP: Hoge bindplaten hebben een grotere bindingscapaciteit en dus een groter dynamisch bereik dan standaardplaten met hydrofobe oppervlakken.</li>
		<li>Ontdooi het monoklonale muisanti-MeCP2-antilichaam op ijs en meng 0,67 μL van het antilichaam met 4 mL PBS (1:6.000 antilichaamverdunning in PBS). Draai de antilichaamoplossing om goed te mengen en de buis te labelen als "coatingoplossing".</li>
		<li>Bedesudeer voorzichtig 25 μL coatingoplossing in de onderste hoek van elke put met behulp van een meerkanaals pipetor; dit wordt de oplossingscoatingmethode genoemd. Tik voorzichtig op de 96-putplaat aan elke kant om ervoor te zorgen dat de coatingoplossing de bodem van elke put bedekt.</li>
		<li>Sluit de plaat af met een kleeffolie en broed de plaat 's nachts op 4 °C (12-16 uur) in de koelkast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blokkeren (dag 2)<ol>
<li>Haal het bord uit de koelkast en verwijder de folie.</li>
		<li>Verwijder de antilichaam coating oplossing door flicking het in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle coating oplossing te verwijderen uit de putten.</li>
		<li>Voeg 125 μL blokkeringsoplossing per put toe. Sluit de plaat opnieuw af en plaats deze op een orbitale microplate shaker.</li>
		<li>Incubeer de plaat voor 90 min bij kamertemperatuur met constante schudden bij 800 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereidingen van normen en monsters<ol>
<li>Bereid tijdens de incubatietijd de MeCP2- en/of TAT-MeCP2-eiwitnormen en diverse monsters voor. OPMERKING: De Lysisbuffer die wordt gebruikt voor standaardverdunning moet dezelfde zijn als die welke in de geanalyseerde monsters wordt gebruikt.</li>
		<li>Neem één flacon MePC2 en/of TAT-MeCP2 eiwitvoorraadoplossing (250 μg/mL), muishersenlysaten en HDF-lysaten van -80 °C. Ontdooi ze op ijs.</li>
		<li>Verdun de standaard voorraadoplossing (MeCP2 en/of TAT-MeCP2) in schone buizen volgens tabel 2.</li>
		<li>Verdun de monsters in lysisbuffer als volgt: 1−20 μg muishersenlysaat per 25 μL lysisbuffer en 0,25−1 μg HDF lysaat per 25 μL lysisbuffer. Bereid voldoende volume van elk monster voor om een analyse in drievoud uit te voeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standaard</td>
			<td>Concentratie</td>
			<td>Verdunning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 1</td>
			<td>1.800 ng/mL</td>
			<td>1,08 μL Standaard voorraadoplossing + 148,92 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 1 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 2 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 4</td>
			<td>66,67 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 3 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 4 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 5 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 7</td>
			<td>2,47 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 6 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 8</td>
			<td>0,82 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 7 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 9</td>
			<td>0,27 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standaard 8 + 100 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standaard 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>150 μL Lysis buffer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Standaardreeks van 0 tot 1800 ng/mL.
<ol start="5"><li>Het toevoegen van de monsters en standaardoplossingen<ol>
<li>Verwijder de blokkeringsoplossing door deze in de prullenbak te vegen en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle blokkeringsoplossing uit de putten te verwijderen.</li>
		<li>Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 25 ul van normen en monsters aan de onderste hoek van de put met behulp van een enkele kanaal pipet.</li>
		<li>Sluit de plaat af en broed de plaat 4 uur lang in bij kamertemperatuur met constant schudden bij 800 tpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antilichaam zonder label<ol>
<li>Ontdooi het polyklonale konijn anti-MeCP2 antilichaam op ijs. Verdun het antilichaam 1:6.000 in testverdunningsoplossing.</li>
		<li>Verwijder de normen en monsters door het flicking in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek.</li>
		<li>Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 25 μL ongelabelde detectieantilichaam toe aan elk goed met de meerkanaals pipettor. Sluit de plaat af en incubeer deze gedurende 1 uur met constant schudden bij 800 rpm bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Specifiek geconjugeerd antilichaam<ol>
<li>Haal het specifieke secundaire antilichaam (Table of Materials) uit de koelkast en plaats het op ijs. Verdun het antilichaam 1:666.67 in testverdunningsoplossing en meng voorzichtig.</li>
		<li>Verwijder het gratis secundaire antilichaam zonder label door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.</li>
		<li>Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 25 μL van specifieke geconjugeerde antilichaam (Tabel van materialen) aan elk goed met de multichannel pipettor. Sluit de plaat af en incubeer 1 uur met constant schudden bij 800 tpm bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het lezen van de plaat<ol>
<li>Verwijder het gratis geconjugeerde antilichaam (Table of Materials) door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.</li>
		<li>Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing.</li>
		<li>Voeg 150 μL van 1x Tris-gebaseerde Gold read buffer (Table of Materials) met oppervlakteactieve stof met tripropylamine als een co-reactant voor lichtopwekking aan de plaat. Vermijd luchtbellen door gebruik te maken van omgekeerde pipettertechnieken.</li>
		<li>Plaats de plaat op het microplaatdetectieplatform (Materiaaltafel)en start de meting onmiddellijk. Gebruik de instellingen voor 96-well plaat acquisitie.</li>
		<li>Leg de elektrochemiluminescentiesignalen vast door een ingebouwde CCD-camera in een elektrochemiluminescentiedetectiesysteem (Tabel van materialen)en leg de signaaltellingen vast, die overeenkomen met relatieve lichteenheden (RLU) en direct evenredig zijn met de intensiteit van het licht. OPMERKING: Bij elektrochemische stimulatie zendt het rutheniumlabel dat gebonden is aan de koolstofelektrode luminescentielicht uit op 620 nm. Gegevens analyseren met de instrumentgestuurde software (Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
<li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li>
<li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li>
<li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2+mutations%3A+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).</li>
<li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2%2C+a+key+contributor+to+neurological+disease%2C+activates+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li>
<li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+a+complex+disorder+with+simple+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li>
<li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+Syndrome%3A+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li>
<li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).</li>
<li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaccone%2C+FA+%22Synthetic+MeCP2+sequence+for+protein+substitution+therapy%22">Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy</a>. , Canada. CA2647125C (2007).</li>
<li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAP%3A+A+two+minute+cell+fractionation+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294(2010).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells%3A+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li>
<li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li>
<li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MECP2+Duplication+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li>
<li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om endogene MeCP2-, recombinant MeCP2- en TAT-MeCP2-niveaus te meten, werd een 96-well plaat ECLIA ontwikkeld. Het is aangetoond dat verlies van MeCP2 eiwitfunctie leidt tot RTT-syndroom6, waarvoor de behandeling momenteel beperkt is tot symptoombestrijding en fysiotherapie. Een veelbelovende behandelingsweg is de zogenaamde eiwitvervangende therapie, waarbij MeCP2-niveaus kunnen worden getitreerd tot hun benodigde concentratie12,13,<...

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is gebaseerd op een proces dat gebruik maakt van etiketten die zijn ontworpen om luminescentie uit te stoten wanneer elektrochemisch gestimuleerd. Het is een breed toepasbare techniek voor de kwantitatieve detectie van biologische analyten in de basisindustrie en academisch onderzoek, de voedingsindustrie en in klinische diagnostiek1. Vaak wordt een wegwerp 96-well plaat met koolstofinkt elektroden gebruikt. Deze elektroden fungeren als een vaste fase drager voor de immunoassay. Een secundair antilichaam wordt geconjugeerd tot een elektrochemiluminescent label en wanneer elektriciteit wordt toegepast op het systeem, licht emissie van het chemische label wordt geactiveerd. Een ultralage geluidsbelastinggekoppelde inrichting (CCD) registreert de lichtintensiteit die rechtstreeks evenredig is met het antigeen dat aan het opname-antilichaam is gebonden, wat resulteert in de kwantificering van de beoogde analyt van het monster2. In vergelijking met de enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) wordt ECLIA als voordelig beschouwd omdat het een hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, evenals een betere automatisering en consistentie3.
Hier analyseerden we de methyl-CpG bindende eiwit 2 (MeCP2) niveaus in monsters van menselijke en murine oorsprong evenals verschillende varianten van het recombinant eiwit met behulp van de nieuw ontwikkelde ECLIA systeem. MecP2 is een X-gebonden nucleïnezuurbindende eiwit waarvan bekend is dat het interageren met gemethyleerde DNA-sequenties. Dit eiwit is betrokken bij de regulatie van genexpressie4,5. Verlies-van-functie mutaties in het gen dat dit eiwit codeert zijn de belangrijkste boosdoeners veroorzaakt Rett syndroom (RTT), een ernstige neuroontwikkelingsstoornis6. Een andere MeCP2-gerelateerde aandoening, MECP2 duplicatie syndroom, leidt ook tot neurologische symptomen die kunnen overlappen met die van RTT7. Met name worden vrouwen meestal beïnvloed door RTT, terwijl mannen6meestal worden getroffen door MECP2-duplicatiesyndroom 6,7. MECP2
Deze aandoeningen worden geassocieerd met respectievelijk onvoldoende of overtollige MeCP2-niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS). Daarom zouden behandelingsopties voor RTT die het verhogen van mecp2-niveaus in het CNS inhouden, de schadelijke effecten van een overmaat aan MeCP27moeten vermijden . Vanwege dit feit is een zeer gevoelige en nauwkeurige kwantificering van MeCP2-eiwitniveaus, zoals geboden door het ECLIA-systeem, van cruciaal belang voor de vooruitgang van RTT en mecp2-dubbelsyndroomonderzoek. De precieze metingen van endogene en exogene MeCP2-niveaus uit menselijke cellijnen en muizenweefselmonsters, evenals een recombinanteiwit bestaande uit menselijke MeCP2-isoform B (ook bekend als isoform e1), en een minimaal N-terminal HIV-TAT transductiedomein (TAT-MeCP2) dat het potentieel heeft om de bloed-hersenbarrière8over testeken,9 worden in dit werk gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>Sample preperation</td></tr><tr><td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R32AB-1</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Discovery workbench 4.0</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Sample preperation</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s PBS (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Extraction Buffer</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Sample preperation</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Extraction Buffer</td></tr><tr><td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 ECLIA protocol</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Sample preperation</td></tr><tr><td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td><td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 ECLIA protocol</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td></tr><tr><td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Cell treatment</td></tr><tr><td>Microseal B seal</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>for plate sealing</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td><td>Antibody, Coating solution</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R93BA-4</td><td>Blocker</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIA protocol</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well Plate</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA protocol</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Sample preperation</td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>custom-designed</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Hypotonic lysis reagent</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td></tr><tr><td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>custom</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Extraction Buffer</td></tr><tr><td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>W0015528S</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2 fusion protein</td><td>in-house production</td><td></td><td>Cell treatment</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Cell treatment</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Washing solution</td></tr></tbody></table>

een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor mecp2-eiwitvarianten

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

De ECLIA is een veelzijdige methode die in staat is om endogene en recombinante eiwithoeveelheden in een 96-put formaat te kwantificeren. Om eclia-efficiëntie aan te tonen, werd deze test gebruikt om intrinsieke niveaus van MeCP2 in muishersenweefsel en de opname van TAT-MeCP2 bij menselijke huidfibroblasten te analyseren. De MeCP2-ECLIA produceert zeer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met een lage intra- en inter-assay fout. Samengevat hebben we een kwantitatieve methode ontwikkeld voor de evaluatie van MeCP2-eiwitvarianten die kunnen worden gebruikt in schermen met een hoge doorvoer.

Het beginsel van het ECLIA-systeem is beschreven in figuur 1. Standaardcurven voor twee MeCP2-varianten worden weergegeven in figuur 2. Nauwkeurige kwantificering was mogelijk over een breed scala van concentraties (1−1.800 ng/mL). In figuur 3werden MeCP2-niveaus van lysaten afgeleid van muishersenen en HDF's geanalyseerd. MeCP2-expressie in kernlysatataatstoffen in de hersenen van heterozygoot, wildtype en knock-outmuizen werden ve...

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

De ECLIA is een eenvoudige maar efficiënte methode om cellulaire niveaus van MeCP2 te kwantificeren. De ECLIA is snel, gevoeliger en gemakkelijker te hanteren in vergelijking met andere kwantificeringsmethoden zoals de westelijke vlek en de ELISA. Om de wasoplossing, die 0,5%Tween 20 in PBS is, voor te bereiden, voeg 500 microliter tween 20 toe aan een liter PBS en meng krachtig.Bereid een blokkeringsoplossing van 3% Blocker A en PBS voor en roer voorzichtig. Steriliseren van de blokkerende oplossing door filtratie. Om de testverwijdtingsoplossing, 1%Blocker A en PBS voor te bereiden, voegt u vijf milliliter blokkeringsoplossing toe aan 10 milliliter PBS.Vervolgens ontdooien de monoklonale muis anti-MeCP2 antilichaam op ijs. Meng 0,67 microliter van het antilichaam met vier milliliter PBS en draai de oplossing. Om de 96-goed hoge bindplaat te coaten, moet u voorzichtig 25 microliter coatingoplossing in de onderste hoek van elke put afgeven met behulp van een multichannel pipetter.Dep de 96-put plaat voorzichtig aan elke kant om ervoor te zorgen dat de coating oplossing de bodem van elke put bedekt. Verzegel de plaat met kleeffolie en broed 's nachts uit op vier graden Celsius. Haal

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

In this video, we demonstrate the electrochemiluminescence immunoassay for the quantitation of target protein levels in different samples. This assay is based on the luminescence produced in the electrochemical reaction. The intensity of light emitted is proportional to the quantity of the target protein in the sample.

Electrochemiluminescence Assay for Quantification of Target Protein Levels in Brain Lysate

This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Wij rapporteren een kleine haarspeld RNA (shRNA) en de volgende generatie sequencing-gebaseerd protocol voor het identificeren van de regelgevers van de inactivering van het x-chromosoom in een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten aan de methyl CpG bindende eiwit 2) MeCP2) gen op het X-chromosoom inactief.

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Leer de elektrochemiluminescentie-immunoassay (ECLIA) voor het kwantificeren van MeCP2-eiwitvarianten in een 96-well formaat. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid dan Western blot.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Meer video's verkennen