Name: Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een verbeterd protocol voor whole-mount immunostaining van Drosophila testes met NP40 en heptane voor 3D confocale analyse. Deze methode maakt kwantitatieve colocalisatiestudies van grote spermatocyten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura voor antilichamen en A. Debec, de Bloomington en Vienna stock centers for flies. Met dank aan C. Jackson voor suggesties en stimulerende discussies.

1. Drosophila testes collectie
OPMERKING: Jonge mannetjes (0-15 uur post-eclosie) zijn nodig voor het onderzoeken van diploïde kiemcellen (d.w.z. spermatogonia en spermatocyten).
<ol><li>Selecteer jonge vliegen zoveel mogelijk om interferentie door het ontwikkelen van spermatids te minimaliseren.</li>
	<li>Verdoof vliegen door korte blootstelling aan kooldioxide en breng over op een vliegenkussen14,15.</li>
	<li>Gebruik onder een ontleedmicroscoop (10x vergroting) een tang om het hoofd te verwijderen.</li>
	<li>Breng 5 tot 10 onthoofde vliegen over naar 100 μL ringersbuffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, complete eiwitremmer, pH 6,8) op een glazen glijbaan met siliconencoating op een zwarte achtergrondsteun.</li>
	<li>Gebruik met een ontleedmicroscoop bij een vergroting van 40x één paar nummer 5-tangen om een vlieg tussen de thorax en de buik vast te houden en trek met een andere tang de buik weg van de thorax. Isoleer snel de teelballen en aangrenzende weefsels van het vliegkarkas15 en plaats in een nieuwe druppel Ringer's buffer op dezelfde dia.</li>
	<li>Zodra alle teelballen klaar zijn, reinigt u de teelballen van de resterende weefsels (accessoireklier en uitwendige genitaliën).</li>
	<li>Verwijder overtollige buffer uit de druppel met de ontlede teelballen. Gebruik meestal een p200 pipet met een tip van 10 μL bovenop een tip van 200 μL. Dit maakt het mogelijk om het overtollige vocht door een klein diafragma te verwijderen. Plaats een druppel van 4% paraformaldehyde fixatief bovenop de druppel met de ontlede teelballen en breng de teelballen vervolgens snel over in een buis met verse fixatieve oplossing.</li>
</ol>2. Paraformaldehyde fixatie
<ol><li>Bereid vlak voor gebruik 2 ml fixatieve oplossing: 600 μL 4% paraformaldehyde verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 30 μL NP40 20% plus 1200 μL heptaan in een 2 ml gesiliconiseerde microcentrifugebuis. Gebruik 4% paraformaldehyde in PBS bereid in 600 μL aliquots en bewaard bij -20°C. Let op: Heptaan en paraformaldehyde zijn giftig en moeten in een zuurkast worden behandeld. Gooi ze weg volgens de voorschriften van het gastinstituut.</li>
	<li>Breng de teelballen met behulp van een p200 micropipet met een brede diafragmatip over naar de PFA/NP40/heptaanoplossing. Schud de buis 30 s met de hand op en neer. Blijf de teelballen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op een roterende mixer bevestigen.</li>
	<li>Stop de roterende mixer en plaats de buis in een buizenrek om fasescheiding mogelijk te maken en voor de teelballen om zich op de bodem van de buis te nestelen.</li>
	<li>Verwijder alle heptaan en de fixatieve oplossing en spoel de teelballen drie keer snel af met 1x PBS.</li>
	<li>Breng over op een schone individuele buis van 200 μL. Voer alle incubaties uit in deze kleine buisjes om de hoeveelheden gebruikte antilichamen te minimaliseren.</li>
	<li>Verwijder overtollige buffer met behulp van een 200 μL micropipet met zowel een P200 als een P10 tip bevestigd. Zorg ervoor dat je geen teelballen aspireert.</li>
	<li>Houd teelballen in 1x PBS op ijs totdat alle monsters klaar zijn.</li>
</ol>3. Antilichaamkleuring in oplossing
<ol><li>Gooi de PBS weg en laat de teelballen 30 minuten in 0,3% PBS-T bij kamertemperatuur staan om celmembranen te permeabiliseren.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur in dezelfde buffer plus 5% normaal geitenserum (NGS).</li>
	<li>Voeg 200 μL van het primaire antilichaam verdund in 0,3% PBS-T plus 5% NGS (Tabel van materialen) toe.</li>
	<li>Incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C (of kamertemperatuur) met zachte agitatie op een rocker.</li>
	<li>Was 3 keer in 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Laat de teelballen zich door de zwaartekracht op de bodem van de buis nestelen.</li>
	<li>Voeg 200 μL secundair antilichaam verdund 1:500 uit de DyLight geconjugeerde serie toe.</li>
	<li>Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 4 uur bij kamertemperatuur in een donkere kamer.</li>
	<li>Was 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Herhaal dit vervolgens met 0,2% PBS-T en 0,1% PBS-T, telkens gedurende 30 min op een rocker bij kamertemperatuur. Was het wasmiddel 30 minuten in 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 180 μL DAPI-oplossing toe bij 1 μg/ml in 1x PBS gedurende 15 min. De stamoplossing is 10 mg/ml in H2O. Vermijd het maken van voorraadoplossing in PBS, die het DAPI-kleuringssignaal op diffuse chromatine in grotere spermatocyten kan verminderen.</li>
	<li>Was 3x voor elk 5 minuten.</li>
	<li>Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel op een schone dia te tekenen.</li>
	<li>Aspireer teelballen en zet ze op de glijbaan. Het voorspoelen van de brede diafragmatip met 0,1% PBS-T voorkomt dat de teelballen aan de punt blijven plakken. Verwijder overtollige PBS.</li>
	<li>Voeg een druppel (ongeveer 100 μL) Citifluor AF1 toe.</li>
	<li>Plaats voorzichtig een glazen afdeklip over het weefsel en zorg ervoor dat er geen luchtbellen vallen.</li>
	<li>Sluit de afdeklip af op de glijbaan met duidelijke nagellak.</li>
	<li>Observeer dia's op een microscoop.</li>
</ol>4. Colocalisatie analyses
<ol><li>Verkrijg confocale afbeeldingen. We gebruikten een Zeiss LSM 710 confocale microscoop (63x Plan Apochromatische olie) met een z-resolutie van 0,5 of 1 μm.</li>
	<li>Selecteer verschillende cellen uit onafhankelijke teelballen.</li>
	<li>Importeer afbeeldingen in verwerkingssoftware (bijv. Imaris).</li>
	<li>Definieer de kern door handmatige segmentatie om de naburige kernen uit te sluiten. Gebruik de Coloc software; het verzamelt de correlatiecoëfficiënten (PCC's) van Pearson binnen het gehele volume tussen 2 fluoroforen.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
<li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li>
<li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li>
<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
<li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li>
<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).</li>
<li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup154%2C+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li>
<li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li>
<li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dit protocol biedt een methode voor succesvolle immunolabeling van volwassen Drosophila-teelballen. Zoals gemeld in andere procedures moeten jonge mannetjes worden gebruikt (we hebben zelfs de leeftijd verkort tot minder dan 20 uur na eclosie) om de aanwezigheid van zich ontwikkelend sperma te minimaliseren, wat de spermatocyten dreigt te belemmeren. De dissectie moet snel zijn en de antilichaamverdunning moet worden aangepast om de signaal-ruisverhouding21,22<su...

Drosophila-teelballen zijn een waardevol model voor de studie van nucleaire architectuur. In mitotische spermatogoniale cellen wordt het nucleaire volume grotendeels ingenomen door chromatine. Deze cellen ondergaan vier delingsrondes en produceren een cyste van 16 primaire spermatocyten. In de komende dagen passeren de spermatocyten 6 ontwikkelingsstadia (S1-S6), sterk toenemend in volume, ongeveer 20-voudig1,2. Ze veranderen ook hun nucleaire morfologie. De omtrek van de kern, onthuld door de lamin Dm0, wordt onregelmatig en vertoont diepe invaginaties1,3. Dit gaat gepaard met uitgebreide genexpressieveranderingen en wijzigingen in chromatineorganisatie1,4,5,6,7. De interfasechromosomen zijn goed gedefinieerd in stadium S4-S5 en vormen drie verschillende massa's die overeenkomen met de 2 grote bivalente autosomen en het X-Y-paar aangemeerd met de nucleolus.
Mad1 werd oorspronkelijk geïsoleerd als een belangrijk onderdeel van het mitotische controlepunt (beoordeeld in8). In interfase wordt beschreven als voornamelijk gelegen aan de nucleaire envelop, maar ook in het nucleoplasma9,10,11. In Drosophila testis meldden we dat Mad1 prominent aanwezig is in het nucleoplasma, nauw verbonden met de twee belangrijkste autosomale chromatinemassa's en in mindere mate met de XY chromatine. We definieerden deze chromatine-geassocieerde structuur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Vier andere eiwitten werden geassocieerd met MINT's in spermatocyten: de nucleoporine Mtor/Tpr, het SUMO peptidase Ulp1, het mitotische checkpoint-eiwit Mad2 en een subeenheid van een Polycomb-achtig complex Raf212.
Om de beschrijving van DE's te voltooien, moesten we antilichamen gebruiken en werden we geconfronteerd met de technische problemen die over het algemeen worden ondervonden met immunostaining bij testis: een slechte permeabiliteit die resulteert in een significante niet-uniformiteit van kleuring in de diepte van de testis, met name in de grote spermatocyten. Svernietigde preparaten verhoogden de toegang tot antilichamen, maar leidden tot gecomprimeerde beelden, waardoor de 3D-analyses werden beperkt en het meten van kwantitatieve fluorescentie, waaronder colocalisatie, werdvoorkomen. Het probleem van antilichaampenetratie kan ook worden aangepakt door permeabiliserende middelen zoals 0,3% Na-deoxycholaat13, maar deze procedure leverde in onze handen geen reproduceerbare resultaten op. Omdat we veel co-labeling experimenten hebben uitgevoerd, hebben we gekeken naar het verbeteren van het permeabilisatieprotocol. De combinatie van 1% NP40 plus heptaan resulteerde in meer reproduceerbaarheid, met name in het bestuderen van de grote spermatocyten.
Dit protocol voert fixatie en immunostaining van teelballen in suspensie uit, verbetert de monsterkwaliteit en verbetert de reproduceerbaarheid en maakt het geschikt voor confocale microscopie. We gebruikten het protocol om de ruimtelijke relaties van bepaalde nucleaire envelopeiwitten met de nucleoplasmatische structuren van grote spermatocyten beter te definiëren. Deze methode zal een beter onderzoek mogelijk maken naar de veranderingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van spermatocyt, bijvoorbeeld de dynamische structurele veranderingen van de kern, waaronder chromatine, nucleoplasma en de nucleaire poriën.

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift van A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Parijs, Frankrijk)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 15 mei;124(Pt 10):1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>Vienna Drosophila RNAi Center</td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>Voorraad moet worden bereid in H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP Wide Bore Pipette Tips</td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Tip met brede opening</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;0.2 mL Individuele Tube</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml microcentrifugebuisjes&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>Gesilicificeerd 2ml buisje</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>Paraformaldehyde (4%) opgelost in PBS 1X&nbsp;; aliquot per 600 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td></tr><tr><td>0.1% (0.2 of 0.3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&nbsp; met 0.1% (0.2 % of 0.3%) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100, voor moleculaire biologie,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Muis anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 geschenk van J. Johansen, Iowa State University</td></tr><tr><td>Rat anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 geschenk van H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td></tr><tr><td>Guinea-varken anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>1/200 geschenk van C. P. Verrijzer, Erasmus Universiteit, Rotterdam</td></tr><tr><td>Konijn anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>1/200 geschenk van C. P. Verrijzer, Erasmus Universiteit, Rotterdam</td></tr><tr><td>DyLight geconjugeerde serie&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Ezelsanti-(guinea-varken, muis,&nbsp; konijn of rat) als tweede antilichamen</td></tr></tbody></table>

immunostaining van whole-mount drosophila testes voor 3d confocale analyse van grote spermatocyten

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila-teelballen zijn een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van biologische processen, waaronder stamcelbiologie, nucleaire architectuur, meiose en spermaontwikkeling. Immunolabeling van de hele Drosophila-testis wordt echter vaak geassocieerd met significante niet-uniformiteit van kleuring als gevolg van antilichaampenetratie. Geplette preparaten overwinnen het probleem slechts gedeeltelijk, omdat het de 3D-kwaliteit van de analyses vermindert. Hierin beschrijven we een whole-mount protocol met NP40 en heptaan tijdens fixatie samen met immunolabeling in vloeibare media. Het behoudt het volume dat geschikt is voor confocale microscopie samen met reproduceerbare en betrouwbare etikettering. We laten verschillende voorbeelden zien van 3D reconstitutie van spermatocytkernen uit confocale secties. De reproduceerbaarheid van intra- en intertesten maakt 3D-kwantificering en vergelijking van fluorescentie tussen afzonderlijke cellen van verschillende genotypen mogelijk. We gebruikten verschillende componenten van de intranucleaire MINT-structuur (Mad1-bevattend Intra Nuclear Territory) en twee componenten die verband houden met het nucleaire poriecomplex om dit protocol en de toepassingen ervan op de grootste cellen van de testis, de S4-S5 spermatocyten, te illustreren.

Het belangrijkste obstakel voor het verkrijgen van adequate kleuring van Drosophila-teelballen is de beperkte penetrante doordringbaarheid van antilichamen, die gedeeltelijk is opgelost door het gebruik van geplette preparaten, maar ten koste van het induceren van een beperking van de 3D-analyses (bijvoorbeeld 3D-representatie of meting van colocalisatie). De procedure maakt uniforme etikettering mogelijk en behoudt het volume van alle cellen van de testis. Hier hebben we de illustratie van de methode gericht op de 3D-re...

We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Totale kleuring van Drosophila-weefsels, zoals testis-monsters, is vaak problematisch vanwege beperkte antilichaampenetratie. Ons fixatieprotocol dat NP40 en heptaan gebruikt, maakt een uniform en reproduceerbaar labelen mogelijk. Door de weefselvorm te behouden terwijl diepe antilichaampenetratie wordt toegestaan, vergemakkelijkt deze procedure de reproduceerbare, kwantificerbare verwerving van immunokleuring in drie dimensies, zowel afzonderlijk als in colocaliserende studies.Voor diploïde kiemcelbeoordeling, nul tot 15 uur na uitkomen, verdooft u de vliegen door een korte blootstelling aan koolstofdioxide en brengt u de vliegen over naar een vliegpad. Plaats de pad onder een dissectief microscoop met een 10X-vergroting en gebruik pincetten om de koppen te verwijderen van vijf tot 10 mannelijke vliegen. Breng de onthoofde lichamen van de vliegen over naar 100 microliter Ringer's buffer op een siliconencoating glazen plaat op een zwarte achtergrondsteun en gebruik de 40X-vergroting en een paar nummer vijf pincetten om een vlieg tussen de thorax en de buik vast te grijpen.Trek vervolgens de buik weg van de thorax en isoleer snel de testes en aangrenzende weefsels van het vliegkarkas. Zodra alle testes zijn verzameld, reinigt u de monsters van eventueel achtergebleven weefsel en gebruikt u een 200 microliter pipettentip om de overtollige buffer rond de gedissekteerde testes te verwijderen. Plaats vervolgens een druppel van 4% paraformaldehyde op de testes en breng de weefsels snel over in een buisje met twee milliliter vers bereide 4% paraformaldehydeoplossing aangevuld met 20% NP40 en heptaan.Voor grondige fixatie van de testes-monsters, schudt u de buis verticaal gedurende 30 seconden voordat u de testes incubeert op een roterende mixer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aan het einde van de incubatie, brengt u de buis over naar een buisjesrek en laat u de testes naar de bodem van de buis zakken. Verwijder alle heptaan en fixeervloeistof en spoelt u de testes snel drie keer af met PBS.Na de laatste wassing, brengt u de testes over in een nieuwe 200 microliter buis en gebruikt u een 200 microliter pipet uitgerust met een 10 microliter pipettentip om eventueel overtollig buffer te verwijderen. Voeg vervolgens 200 microliter vers PBS-Toe aan de buis toe en plaats de testes op ijs. Voor antilichaamlabeling van de testes-monsters, vervangt u het PBS door 200 microliter 0,3% PBS-T voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur.Na permeabilisatie, blokkeert u eventuele niet-specifieke binding met 0,3% PBS-T plus 5% normaal geitenserum gedurende een uur bij kamertemperatuur voordat u 200 microliter van het primaire antilichaam van belang toevoegt, verdund in 0,3% PBS-T plus 5% normaal geitenserum voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius of kamertemperatuur met schudden. De volgende ochtend wast u de monsters met drie 15-minuten wasbeurten met vers 0,3% PBS-T en schudden bij kamertemperatuur per wasbeurt en laat u de testes door zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken. Voeg 200 microliter van een geschikt secundair antilichaam toe aan de buis voor een vier uur durende incubatie met schudden bij kamertemperatuur beschermd tegen licht voordat u de monsters wast in vers 0,3% PBS-T per wasbeurt, zoals gedemonstreerd.Na de 0,3% PBS-T-wasbeurt, wast u de monsters eenmaal in 0,2% PBS-T en eenmaal in 0,1% PBS-T gedurende 30 minuten per wasbeurt op de rocker, gevolgd door een laatste 30-minuten wasbeurt in alleen PBS. Na de PBS-was, labelt u de monsters met 180 microliter van een oplossing van een microgram per milliliter DAPI in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, gevolgd door drie 5-minuten wasbeurten in vers PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, gebruikt u een hydrofobe barrièrepen om een cirkel op een schone plaat te tekenen en gebruikt u een 0,1% PBS-T geprimede pipettentip om de testes naar de plaat over te brengen.Zuigt u eventueel overtollig PBS af en voegt u 100 microliter Citifluor AF1 toe. Plaats voorzichtig een glazen dekglas over het weefsel, zorg ervoor dat u luchtbellen niet vastlegt, en gebruik helder nagellak om het dekglas aan de plaat te verzegelen voordat u de platen observeert door confocale fluorescentiemicroscopie. Na het verkrijgen van confocale beelden van de monsters, importeert u de beelden in een geschikt beeldanalysesoftwareprogramma.Gebruik vervolgens handmatige segmentatie om de kern binnen elke cel te definiëren en bepaal de Pearson's correlatiecoëfficiënten binnen het hele volume tussen twee fluoroforen. Dit protocol maakt het mogelijk om confocale beelden van een voldoende kwaliteit te verwerven om te worden behandeld voor 3D-reconstructie. Bijvoorbeeld, in deze vier aangrenzende seriële secties van een stadium S5 spermatocyt, wordt een laag niveau van Mad1 waargenomen aan de kernmembraan en kan een hoge accumulatie van Mad1 worden gevisualiseerd in combinatie met DAPI-kleuring binnen de kern.In dit 3D-gereconstrueerde beeld, kan de lage aanwezigheid van Mad1 aan het kernoppervlak en hoge accumulatie van Mad1 binnen de kern samen met het DNA worden waargenomen. In deze 3D-reconstructies kunnen grote S5 spermatocyt geverfd met Nucleoporin 62 en Mad1 of Importin-beta en DAPI worden waargenomen. In beide reconstructies lijken de kernporie-geassocieerde componenten niet-uniform verdeeld over de kernrand als stippen van onregelmatige grootte.Terwijl het 3D-volume van de cellen wordt behouden, vergemakkelijkt dit protocol ook een uniforme penetratie van antilichamen van belang in de diepte van elke cel, waardoor kwantitatieve analyses, zoals colocalisering, mogelijk zijn. Omdat het protocol een betrouwbare meting van colocalisaties uit onafhankelijke testes toestaat, kan het ook worden gebruikt om kleuring in verschillende vlieggenotypen te vergelijken. De hoeveelheid NP40 die wordt gebruikt, is cruciaal voor voldoende permeabilisatie.Als de procedure goed wordt ge

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hoe niches en stamcellen vorm tijdens de ontwikkeling is een belangrijke vraag met praktische implicaties. In...

Dissectie en kleuring van de Drosophila Larvale Eierstokken

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.

Imaging Centrosomes in Fly Testikels

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer een verbeterd protocol voor whole-mount immunostaining van Drosophila testes met NP40 en heptane voor 3D confocale analyse. Deze methode maakt kwantitatieve colocalisatiestudies van grote spermatocyten mogelijk.

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Meer video's verkennen