Name: In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer de in situ chemotaxis assay (ISCA) om microbieel gedrag in aquatische ecosystemen te bestuderen. Deze microfluïdische methode kwantificeert chemotaxis en isoleert micro-organismen voor metabole analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede gefinancierd door het Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, via subsidie GBMF3801 aan J.R.S. en R.S., en een Investigator Award (GBMF3783) aan R.S., evenals een Australian Research Council Fellowship (DE160100636) aan J.B.R., een prijs van de Simons Foundation aan B.S.L. (594111), en een subsidie van de Simons Foundation (542395) aan R.S. als onderdeel van de Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.

We raden u aan sectie 1 uit te voeren voorafgaand aan veldexperimenten om de resultaten te optimaliseren.
1. Laboratoriumoptimalisatie
LET OP: De volumes beschreven in de optimalisatieprocedure zijn voldoende voor een enkele ISCA (samengesteld uit 20 putten).
<ol><li>Bereiding van de chemische stof van belang OPMERKING: De optimale concentratie voor elke chemoattractant moet vaak worden bepaald onder laboratoriumomstandigheden voorafgaand aan veldinzet. Het chemische concentratieveld zal afnemen in omvang met een afstand tot de bron (ISCA goed), wat betekent dat de concentratie ervaren door micro-organismen in het milieu lager zal zijn dan die aanwezig zijn in het apparaat. De optimale concentratie in de ISCA hangt af van de diffusiesnelheid van de chemoattractant. Als de concentratie in de put te laag is (dicht bij de detectielimiet van de microben), worden er geen positieve chemotaxi's waargenomen. Omgekeerd, als de concentratie in de put te hoog is, zal de concentratie ook hoog zijn in de directe omgeving en zal microbiële accumulatie optreden boven de ISCA-putten in plaats van binnen. Daarom moeten verdunningsreeksen voor elke verbinding in laboratoriumomstandigheden worden uitgevoerd om de optimale concentratie voor veldinzet te bepalen. Idealiter moet ook een concentratiebereik in het veld worden getest om laboratoriumresultaten te bevestigen.<ol>
<li>Bereid 2,5 L van een geschikt medium met de juiste zoutconcentratie (bijvoorbeeld fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] of kunstmatig zeewater). Filter het medium met een 0,2 μm filter met behulp van een peristaltische of vacuümpomp en autoclave.</li>
		<li>Bereid een 10 mM-oplossing van chemoattractant voor in 1 mL van het steriele medium. Filter de chemoattractante oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm om deeltjes en potentiële verontreinigingen te verwijderen. OPMERKING: Idealiter mogen er geen andere organische verbindingen dan de chemoattractant aanwezig zijn in de uiteindelijke oplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentratiebereik door verdunningsreeks<ol>
<li>Verdun de gefilterde chemoattractant stock oplossing in serie, variërend (bijvoorbeeld) van 10 mM tot 100 μM. LET OP: Per geteste concentratie is minimaal 0,7 mL nodig.</li>
	</ol></li>
	<li>Het laden van de ISCA<ol>
<li>Vul een 1 mL spuit met de gefilterde chemoattractant en sluit deze aan op een 27 G spuit. Houd de ISCA met de poort naar boven gericht, langzaam injecteren van de stof totdat een kleine druppel verschijnt op de top van de haven. OPMERKING: 1) Elke verdunning of stof moet worden geïnjecteerd met een aparte spuit en naald om kruisbesmetting te voorkomen. 2) Deze kleine druppel is belangrijk omdat het ervoor zorgt dat er geen luchtbel is gevangen in de haven, die het vermogen van microben om te migreren via de haven zou kunnen schaden. 3) Het wordt aanbevolen om een hele rij per stof of concentratie (vijf putten) te vullen om een voldoende minimaal volume te leveren voor verdere analyses. 4) Een rij per ISCA moet fungeren als negatieve controle en moet worden gevuld met het gefilterde medium waarin de microben worden opgehangen. Deze behandeling is verantwoordelijk voor het effect van willekeurige beweeglijkheid door microben in de ISCA-putten en moet worden gebruikt om de behandelingen met een chemoattractant te normaliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Inzet in het laboratorium<ol>
<li>'s Nachts, incubeer een 5 mL cultuur verrijkt met 1% mariene bouillon (voor mariene bacteriën) of 1% lysogeny bouillon (LB, voor zoet water bacteriën). OPMERKING: Motile bacteriële isolaten of natuurlijke bacteriële gemeenschappen kunnen worden gebruikt voor laboratoriuminzet.</li>
		<li>Broed de cultuur voor 12 uur bij kamertemperatuur (RT) en 180 rpm. Zorg er na 12 uur voor dat de microbiële gemeenschappen motile zijn door directe observatie onder een microscoop.</li>
		<li>Draai de cultuur op 1.500 x g gedurende 10 minuten en resuspend 1/100 in 150 mL van geschikt medium (bijvoorbeeld gefilterd zeewater, gefilterd zoet water).</li>
		<li>Plaats twee kleine stukjes dubbelzijdige plakband op het vlakke oppervlak van een lade met een capaciteit van 200 mL (de deksels van 1 mL tipboxen hebben hiervoor de ideale afmetingen en kunnen gemakkelijk automatisch worden geautoclaveerd). Plaats een ISCA op de top, ervoor te zorgen dat het stevig hecht aan de tape. Vul de implementatielade langzaam met de bacteriële oplossing met behulp van een serologische pipet van 50 mL. OPMERKING: Vul de lade totdat de ISCA onder ongeveer 1-2 cm vloeistof is ondergedompeld. Als u meerdere trays gebruikt, gebruikt u hetzelfde volume voor iedereen.</li>
		<li>Laat de ISCA 1 uur incubeer om bacteriële chemotaxi's toe te staan. Na 1 uur, verwijder het medium zeer voorzichtig met een 50 mL serologische pipet om turbulente stroom te minimaliseren.</li>
		<li>Haal de ISCA uit de implementatielade zonder het bovenste oppervlak aan te raken. Gebruik een pipet en wegwerpruitenwissers om de resterende vloeistof op het ISCA-oppervlak te verwijderen. OPMERKING: Het is belangrijk om te voorkomen dat het aanraken van de poorten tijdens dit proces, als de resulterende veranderingen in de druk kan verwijderen of bacteriën toe te voegen uit de buitenomgeving in de put en daardoor bias de bacteriële dichtheid en samenstelling in de put.</li>
	</ol></li>
	<li>Ophalen van de monsters<ol>
<li>Houd de ISCA met de poort naar beneden gericht, haal het volume van de putten met behulp van een steriele 27 G spuit naald bevestigd aan een 1 mL spuit. OPMERKING: Elke rij (indien met dezelfde stof) kan worden samengevoegd tot een werkmonster van ongeveer 550 μL. Dit monster kan vervolgens in verschillende buizen worden gesalteerd, afhankelijk van de vereiste downstreamtoepassingen.</li>
		<li>Bepaal het aantal bacteriën aangetrokken tot elke chemoattractant concentratie door het analyseren van de monsters met flow cytometrie12. Kies de concentratie chemoattractant die chemotaxi's maximaliseert voor latere veldinzet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Voorbereiding op veldinzet
OPMERKING: De voorbereiding van materiaal en de constructie van de stroomdempingsbehuizing (punt 2) moet vóór de implementatie worden uitgevoerd.
<ol><li>Bereiding van materialen<ol>
<li>Bereid alle in tabel 1genoemde materialen voor . LET OP: Voor één ISCA zijn materiële hoeveelheden beschikbaar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouw en voorbereiding van de stroomdempingsbehuizing OPMERKING: De stroomdempingsbehuizing minimaliseert ongewenste turbulenties die anders de vestiging van chemische gradiënten die afkomstig zijn van de ISCA, verhindert.<ol>
<li>Snijd de stukken voor de inzetbehuizing met een lasersnijder van een 3 mm acrylplaat. OPMERKING: Het bestand voor de stukken is te vinden via de volgende link: <https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>.</li>
		<li>Monteer de lasergesneden stukken zoals aangetoond in figuur 2 met behulp van acryllijm. LET OP: Monteer de stukken met zorg. Gaten of verkeerde uitlijning kunnen lekken veroorzaken bij implementatie, wat direct van invloed is op de kwaliteit van de gegevens.</li>
		<li>Laat de geassembleerde behuizing 's nachts drogen.</li>
		<li>Was de behuizing met gedeïsized water.</li>
		<li>Identificeer mogelijke lekkage door gedeïsized water in de behuizing te gieten. Fix eventuele lekkende gewrichten door het toevoegen van meer acryl lijm, herhaal dan stappen 2.2.3–2.2.5.</li>
		<li>Snijd de schroefdraden in het acrylstuk dat zal worden gebruikt om de ISCA te beveiligen. Dit kan worden bereikt met behulp van een kraan met een diameter en toonhoogte die overeenkomen met de montageschroeven.<ol>
<li>Breng eerst de kraan in een tapsleutel aan en bevestig vervolgens het acrylstuk dat in een benchtop vice moet worden getapt. Voor de beste resultaten, zorg ervoor dat de acryl stuk is zo vlak mogelijk. Zorg ervoor dat de kraan loodrecht op het acrylstuk staat en begin met het draaien van de kraansleutel (met de klok mee), waarbij u lichtdruk op de kraan uitoefent.</li>
			<li>Na een aantal volledige omwentelingen in het acrylstuk, draait u de rotatie van de kraan (tegen de klok in) om voor een kwart van een rotatie om acryl uit de kraan te halen. Herhaal het proces totdat de gehele diepte van het acrylstuk is aangetikt.</li>
			<li>Ten slotte, verwijder de kraan (draaien tegen de klok in) en test de draden met behulp van een schroef.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedure ter plaatse
<ol><li>Waterfiltratie<ol>
<li>Verzamel water van de veldsite wanneer het experiment klaar is om te beginnen. Filter 5 mL water per ISCA door een spuitfilter van 0,2 μm (met een spuit van 50 mL) in een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. OPMERKING: Ongeveer 3 mL gefilterd water is nodig om alle putten van een ISCA te vullen; het wordt echter aanbevolen om 1) filter 5 mL per apparaat om rekening te houden met verliezen tijdens het viervoudige filtratieproces, en 2) aliquots van de filtraten te behouden als negatieve controles voor zowel stroomcytometrie als moleculaire procedures.</li>
		<li>Filtreer het filtraat twee keer door een 0,2 μm hydrofiele GP filtercartridge (beide keren met dezelfde) met een nieuwe spuit van 50 mL in een nieuwe kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. Filtreer het filtraat door een 0,02 μm spuitfilter (met een nieuwe spuit van 50 mL) in een nieuwe 50 mL conische buis. OPMERKING: Deze viervoudige filtratie moet bijna alle micro-organismen en deeltjes uit het water verwijderen. Houd het uiteindelijke filtraat uit de buurt van elke warmtebron tot gebruik. Dit water zal worden gebruikt om alle chemische stoffen die in de ISCA worden gebruikt, opnieuw op te zetten en moet op dezelfde temperatuur worden gehouden als het water op de inzetplaats. Convectieve stromen veroorzaakt door temperatuurverschillen tussen de ISCA-putten en de buitenomgeving kunnen anders optreden.</li>
		<li>Gebruik aliquots van het filtraat om alle chemoattractants van belang (meestal droog) opnieuw op te geven aan de gewenste concentraties in 15 mL conische centrifugebuizen.</li>
		<li>Filtreer de geresuspended chemoattractants door een spuitfilter van 0,2 μm met een spuit van 10 mL in steriele conische centrifugebuizen van 15 mL om ongewenste deeltjes of wateroplosbare verbindingen te verwijderen (bij gebruik van extracten). LET OP: Filter voorzichtig om te voorkomen dat deeltjes door het filter gaan. Het is belangrijk om de chemoattractants in het ultragefilterde water van de veldsite opnieuw op te stellen en ze niet op te nemen in andere oplossingen. Het gebruik van water van de veldplaats is noodzakelijk om (1) dezelfde zoutconcentratie in de putten te verkrijgen als die in het bulkmilieuwater om dichtheidsgestuurde stroming te voorkomen, en (2) garanderen dat de achtergrondvoedingsniveaus binnen en buiten de put gelijk zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>ISCA-vulling<ol>
<li>Voer punt 1.3 uit om de ISCA te vullen. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om één rij (vijf putten) per stof te vullen (d.w.z. drie verschillende stoffen per ISCA en één ultragefilterde zeewatercontrole).</li>
	</ol></li>
	<li>Implementatie in het veld<ol>
<li>Schroef de ISCA (figuur 3A) aan stuk 9 van de behuizing(figuur 2K en figuur 3B). OPMERKING: De hierboven beschreven stroomdempingsbehuizing kan twee ISCA's naast elkaar of één ISCA in het midden bevatten.</li>
		<li>Sluit de behuizing(figuur 3C)en sluit deze af met plakband(figuur 3D). LET OP: Rimpels moeten worden vermeden om een perfecte afdichting te garanderen. Verzegel eerst alle zijden en verzegel vervolgens (in een tweede stap) de zijgaten, die worden gebruikt om water uit de behuizing af te voeren aan het einde van de bemonstering. Sluit de boven- en onderkant niet af. Plaats de ISCA niet ondersteboven, omdat dichtheidsgestuurde stroom kan optreden in putten die chemoattractants bevatten, wat het aantal cellen in de putten zal beïnvloeden.</li>
		<li>Omdat de behuizing tijdens de inzet stabiel moet blijven, wordt aanbevolen deze met behulp van bungee-koorden aan door de mens gemaakte structuren (bijvoorbeeld ponton, ladder) te bevestigen. OPMERKING: De behuizing kan worden bevestigd aan een inzetarm (hier, een aangepaste klem met een loodrecht platform) met behulp van bungee koorden voor onderdompeling in het water. Als alternatief kan de behuizing worden gevuld en beveiligd met een klein gewicht op ondiepe substraten. Als de implementaties zijn bedoeld in de pelagische oceaan, kan de behuizing worden bevestigd aan een net met een boei aan de ene kant en duikgewicht aan de andere kant.</li>
		<li>Dompel de behuizing volledig onder om te beginnen met vullen. Houd tijdens het vullen de behuizing stevig vast om overmatige waterbewegingen binnen te voorkomen. Zodra het niveau van het water de bovenkant van de behuizing bereikt, zorg ervoor dat er geen lucht in zit. OPMERKING: In het geval dat sommige luchtbellen zijn gevangen, kantel de behuizing voorzichtig met de vent gat naar boven gericht, waardoor de bellen te ontsnappen.</li>
		<li>Eenmaal volledig vol, verzegelen de onderste en bovenste gaten met twee stekkers, die kunnen worden gemaakt van silicium of rubber of door het afdichten van de uiteinden van 20 μL pipet tips (Figuur 4). LET OP: Deze stap voorkomt doorstroming in de behuizing tijdens de bemonstering.</li>
		<li>Laat de ISCA 1-3 uur voor bemonstering. OPMERKING: De ideale inzettijd wordt voornamelijk bepaald door de temperatuur van het water en de verdubbelingstijd van de bacteriële gemeenschap. Wanneer de watertemperatuur boven de 20 °C ligt, wordt afgeraden om de ISCA langer dan 1 uur in te zetten, omdat celdeling kan optreden in de putten die chemoattractants bevatten na 1,5-2,0 uur. Optimale implementatietijd kan echter voorafgaand aan het ISCA-experiment worden getest door natuurlijke gemeenschappen te wijzigen met de geladen chemicaliën en het aantal cellen door de tijd te kwantificeren.</li>
		<li>Haal de behuizing uit het water. Plaats het over een container waardoor het water uit de behuizing kan worden afgevoerd.</li>
		<li>Verwijder het bovenste deel van de plakband heel voorzichtig uit de voorste gaten. LET OP: De stroming van het water dat de behuizing verlaat, moet een druipende snelheid hebben. Ga één gat tegelijk te werk, van de bovenkant van de behuizing naar de bodem. Het duurt ongeveer 10-15 minuten om de behuizing volledig af te voeren.</li>
		<li>Zodra de waterlijn onder de bovenkant van de ISCA passeert, verwijdert u de onderste stekker en voert u de rest van het water af.</li>
		<li>Terwijl de ISCA's nog steeds aan de behuizing zijn bevestigd, moet u het water dat op de ISCA is vastzit voorzichtig verwijderen met een pipet van 1 mL.</li>
		<li>Verwijder de ISCA zonder het bovenste oppervlak aan te raken en gebruik een wegwerpdoek om de resterende vloeistof op het oppervlak te verwijderen. OPMERKING: Het is belangrijk om de poorten niet aan te raken tijdens dit proces, omdat de resulterende veranderingen in druk bulkbacteriën kunnen verwijderen of toevoegen aan de put en bias van de bacteriële tellingen.</li>
		<li>Haal de monsters uit de ISCA op door stap 1.5.1 te herhalen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Downstreamtoepassingen
OPMERKING: Volumes worden gegeven op basis van een monster van 550 μL (één rij van een ISCA).
<ol><li>Fix 100 μL van put inhoud met glutaraldehyde (2% laatste concentratie) voor flow cytometrie om chemotaxi's te kwantificeren aan elke attractant. OPMERKING: Bewaar op ijs (of bij 4 °C) en analyseer de monsters op dezelfde dag. Als alternatief kunnen monsters na fixatie in vloeibare stikstof worden ingevroren als analyse op dezelfde dag niet haalbaar is. Flow cytometrie is de aanbevolen methode om het aantal cellen in de ISCA-putten te kwantificeren, omdat het eenvoudig, snel en nauwkeurig is12.</li>
	<li>Snap bevries 300 μL putgehalte in vloeibare stikstof voor latere DNA-extractie en -analyse11. LET OP: Bewaar de monsters op -80 °C tot de analyse.</li>
	<li>Voeg 90 μL putinhoud toe aan 10 μL TE-glycerolbuffer en vries de monsters voor eencellige genomics13uit.</li>
	<li>Verspreid 10-20 μL op agarplaten met het gewenste medium voor bacteriële isolatie.</li>
</ol>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li>
<li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li>
<li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li>
<li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li>
<li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li>
<li>Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for bacterial chemotaxis.</a> Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).</li>
<li>Hol, F. J. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in+to+see+the+bigger+picture%3A+microfluidic+and+nanofabrication+tools+to+study+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria.</a> Science. 346, 1251821(2014).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li>
<li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaworzewska%2C+ET+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , (1982).</li>
<li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudation+and+rhizosphere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Op de schaal van aquatische micro-organismen is het milieu verre van homogeen en wordt het vaak gekenmerkt door fysische/chemische gradiënten die microbiële gemeenschappenstructureren 1,15. De capaciteit van motile micro-organismen om gedrag te gebruiken (d.w.z. chemotaxis) vergemakkelijkt het foerageren binnen deze heterogene micro-omgevingen1. Het direct in het milieu bestuderen van chemotaxi's heeft het potentieel om belangrijke intersp...

Diverse micro-organismen gebruiken beweeglijkheid en chemotaxi's om fragmentarische voedingsomgevingen te benutten, hosts te vinden of schadelijke aandoeningen te vermijden1,,2,,3. Deze microbiële gedragingen kunnen op hun beurt de tarieven van chemische transformatiebeïnvloeden 4 en symbiotische partnerschappen bevorderen in terrestrische, zoetwater- en mariene ecosystemen2,5.
Chemotaxis is uitgebreid onderzocht onder laboratoriumomstandigheden voor de afgelopen 60 jaar6. De eerste kwantitatieve methode om chemotaxi's te bestuderen, de capillaire test, omvat een capillaire buis gevuld met een vermeende chemoattractant ondergedompeld in een suspensie van bacteriën6. Diffusie van de chemische stof uit de buis creëert een chemische gradiënt, en chemotactische bacteriën reageren op dit gradiënt door te migreren naar de buis7. Sinds de ontwikkeling van de capillaire test, die vandaag de dag nog steeds veel wordt gebruikt, zijn er veel andere technieken ontwikkeld om chemotaxi's te bestuderen onder steeds gecontroleerdere fysische/chemische omstandigheden, waarbij de meest recente waarbij microfluidics8,9,10betrokken zijn .
Microfluidics, samen met high-speed video microscopie, maakt het bijhouden van het gedrag van enkele cellen in reactie op zorgvuldig gecontroleerde gradiënten. Hoewel deze technieken ons begrip van chemotaxi's enorm hebben verbeterd, zijn ze beperkt tot laboratoriumgebruik en vertalen ze zich niet gemakkelijk naar veldinzet in milieusystemen. Als gevolg daarvan is het vermogen van natuurlijke gemeenschappen van bacteriën om chemotaxi's te gebruiken binnen natuurlijke ecosystemen niet onderzocht; dus, het huidige begrip van het potentiële ecologische belang van chemotaxis is bevooroordeeld in de richting van kunstmatige laboratoriumomstandigheden en een beperkt aantal laboratorium-gekweekte bacteriële isolaten. De recent ontwikkelde ISCA overwint deze beperkingen11.
De ISCA bouwt voort op het algemene principe van de capillaire test; het maakt echter gebruik van moderne microfabricagetechnieken om een zeer gerepliceerd, gemakkelijk inzetbaar experimenteel platform te leveren voor de kwantificering van chemotaxi's naar verbindingen van belang in de natuurlijke omgeving. Het maakt ook identificatie en karakterisering van chemotactische micro-organismen door directe isolatie of moleculaire technieken. Terwijl het eerste werkende apparaat zelf vervaardigd en gebouwd van glas en PDMS11was, is de nieuwste spuitgegoten versie samengesteld uit polycarbonaat, met behulp van een sterk gestandaardiseerde fabricageprocedure (voor interesse in de nieuwste versie van het apparaat, kunnen de overeenkomstige auteurs gecontacteerd worden).
De ISCA is credit card-sized en bestaat uit 20 putten verdeeld in een 5 x 4 put array, elk gekoppeld aan de externe aquatische omgeving door een kleine haven (800 μm in diameter; Figuur 1). Putatieve chemoattractants geladen in de putten verspreiden zich in de omgeving via de haven, en chemotactische microben reageren door te zwemmen via de haven in de put. Aangezien veel factoren de uitkomst van een ISCA-experiment in de natuurlijke omgeving kunnen beïnvloeden, zal dit stapsgewijze protocol nieuwe gebruikers helpen potentiële obstakels te overwinnen en effectieve implementaties te vergemakkelijken.

```html
<table><tbody><tr><td>Acrylic glue</td><td>Evonik</td><td>1133</td><td>Acrifix 1S 0116</td></tr><tr><td>Acrylic sheet</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K725</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Adhesive tape</td><td>Scotch</td><td>3M 810</td><td>Scotch Magic tape</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002451</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Bungee cord</td><td>Paracord Planet</td><td>667569184000</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Centrifuge tube - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546-500EA</td><td>Eppendorf tube</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tube - 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td>Falcon tube</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tube - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>Falcon tube</td></tr><tr><td>Deployment arm</td><td>Irwin</td><td>1964719</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Deployment enclosure plug</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Zie alternatieven in manuscript</td></tr><tr><td>Disposable wipers</td><td>Kimtech - Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman</td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Green fluorescent dye</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9430</td><td>SYBR Green I - 1:10.000 eindverdunning</td></tr><tr><td>Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 &micro;m</td><td>Merck</td><td>C3235</td><td>Sterivex filter</td></tr><tr><td>In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)</td><td>-</td><td>-</td><td>Neem contact op met de corresponderende auteurs</td></tr><tr><td>Laser cutter</td><td>Epilog Laser</td><td>Fusion pro 32</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Marine Broth 2216</td><td>VWR</td><td>90004-006</td><td>Difco</td></tr><tr><td>Nylon slotted flat head screws</td><td>McMaster-Carr</td><td>92929A243</td><td>M 2 &times; 4 &times; 8 mm</td></tr><tr><td>Pipette set</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Pipette tips - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Pipette tips - 20 &micro;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Pipette tips - 200 &micro;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-1</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Sea salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9883</td><td>Voor kunstmatig zeewater</td></tr><tr><td>Serological pipette - 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL1490-100EA</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Syringe filter - 0.02 &micro;m</td><td>Whatman</td><td>WHA68091002</td><td>Anatop filter</td></tr><tr><td>Syringe filter - 0.2 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10695211</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Syringe needle 27G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td>0,4 &times; 12 mm</td></tr><tr><td>Syringes - 1 mL</td><td>Codau</td><td>329650</td><td>Insulin Luer U-100</td></tr><tr><td>Syringes - 10 mL</td><td>BD</td><td>303134</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Syringes - 50 mL</td><td>BD</td><td>15899152</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Tube rack - 15 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Tube rack - 50 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap</td><td>McMaster-Carr</td><td>8305A77</td><td>Of een andere bedrijf</td></tr><tr><td>Vacuum filter - 0.2 &micro;m</td><td>Merck</td><td>SCGPS05RE</td><td>Steritop filter</td></tr></tbody></table>
```

in situ chemotaxis assay to examine microbial behavior in aquatic ecosystems

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Microbiële gedragingen, zoals beweeglijkheid en chemotaxi's (het vermogen van een cel om de beweging te veranderen in reactie op een chemische gradiënt), zijn wijdverspreid over de bacteriële en archaeale domeinen. Chemotaxis kan resulteren in aanzienlijke voordelen voor het verkrijgen van hulpbronnen in heterogene omgevingen. Het speelt ook een cruciale rol in symbiotische interacties, ziekte, en mondiale processen, zoals biogeochemische fietsen. De huidige technieken beperken het chemotaxis-onderzoek echter tot het laboratorium en zijn niet gemakkelijk toepasbaar in het veld. Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap protocol voor de inzet van de in situ chemotaxis test (ISCA), een apparaat dat robuuste ondervraging van microbiële chemotaxi's direct in de natuurlijke omgeving mogelijk maakt. De ISCA is een microfluïdisch apparaat bestaande uit een 20 put array, waarin chemische stoffen van belang kunnen worden geladen. Eenmaal ingezet in waterige omgevingen verspreiden chemicaliën zich uit de putten, waardoor concentratiegradiënten ontstaan die microben voelen en erop reageren door via chemotaxi's in de putten te zwemmen. De putinhoud kan vervolgens worden bemonsterd en gebruikt om (1) de sterkte van de chemotactische reacties op specifieke verbindingen te kwantificeren door middel van stroomcytometrie, (2) isolaat en cultuur responsieve micro-organismen, en (3) karakteriseren de identiteit en genomische potentieel van de reagerende populaties door middel van moleculaire technieken. De ISCA is een flexibel platform dat kan worden ingezet in elk systeem met een waterige fase, inclusief mariene, zoetwater- en bodemomgevingen.

Deze sectie presenteert laboratoriumresultaten met behulp van de ISCA om de chemotactische respons van mariene microben te testen op een concentratiebereik van glutamine, een aminozuur waarvan bekend is dat het bodembacteriën aantrekt14. De concentratie glutamine die de sterkste chemotactische respons in de laboratoriumtests opduwde, werd gebruikt om een chemotaxistest uit te voeren in het mariene milieu.
Om de laboratoriumtests uit te voeren, werden zeewatergemeenschap...

Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Ons protocol stelt ons in staat om microbiële chemotaxi's direct in hun thuishabitat robuust te kwantificeren. Zo kunnen we micro-organismen isoleren en kunnen we het metabolische potentieel beter kwantificeren en begrijpen. De in situ chemotaxis test, of ISCA in het kort, is een flexibel, gebruiksvriendelijk en eenvoudig apparaat dat nieuw inzicht in microbiële gedrag en dus de rol en functie van micro-organismen in elke omgeving die een vloeibare fase heeft mogelijk maakt.Estelle Clerc, die momenteel promovendus is in mijn onderzoeksgroep, toont de procedure voor inzet in zowel het laboratorium als in het veld. Voordat u de chemoattractant voorbereidt, filtert u het medium met een filter van 0,2 micrometer en maakt u de gefilterde oplossing automatisch omgefilterd. Bereid vervolgens een 10 millimolar-oplossing van chemoattractant in 1 milliliter van het steriele medium en filter de chemoattractant-oplossing met een spuitfilter van 0,2 micrometer om eventuele deeltjes en potentiële verontreinigingen te verwijderen.Verdun vervolgens de gefilterde chemoattractant voorraadoplossing in serie, volgens het experimentele protocol. Om een ISCA te vullen, bevestigt u een naald van 27 meter aan een spuit van 1 milliliter en laadt u één spuit voor elke concentratie van de gefilterde chemoattractant. Houd het apparaat met de poort naar boven gericht, injecteer langzaam elke concentratie van de stof in elk van de vijf putten van een rij van het apparaat totdat er een kleine druppel op elke poort verschijnt.Wanneer alle putten zijn gevuld, overdracht 1,5 milliliter van de mariene of zoetwater bacteriën cultuur van belang in 150 milliliter van de juiste bacteriële cultuur medium. Plaats vervolgens twee kleine stukjes dubbelzijdige plakband op het vlakke oppervlak van een lade van 200 milliliter. En zet één ISCA op elk stuk tape.Met behulp van een serologische pipet van 50 milliliter vult u de implementatielade langzaam met de bacteriële oplossing. En laat de bacteriën om te reageren op de chemoattractant van belang voor een uur. Gebruik om de analyse te beëindigen een nieuwe pipet van 50 milliliter om het medium voorzichtig uit de ISCA-lade te verwijderen.Om de monsters op te halen, plaatst u eerst de ISCA zodat de poort naar beneden gericht is. Gebruik vervolgens een steriele spuit van 1 milliliter uitgerust met een naald van 27 meter om de oplossing uit elke put te trekken. Het trekken van de monsters van elke rij van dezelfde concentratie in een enkele buis.Analyseer vervolgens de monsters per stroomcytometrie om het aantal bacteriën te bepalen dat wordt aangetrokken door elke chemoattractantconcentratie. Om een ISCA voor te bereiden op veldinzet, verzamel eerst 5 milliliter water per ISCA van de veldzijde en filter het water door een spuitfilter van 0,2 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Geef de spuit gefilterd water twee keer door een hydrofiele GP filtercartridge en verzamel het filtraat in een nieuwe kegelvormige centrifugebuis van 50 milliliter, na elke spoeling.Vervolgens filter het water door een spuitfilter van 0,02 micrometer in een nieuwe buis van 50 milliliter. Gebruik aliquots van het filtraat om alle chemoattractants van belang te resuspend aan de gewenste concentraties in individuele 15 milliliter conische buizen. Gebruik vervolgens 10 milliliter spuiten om de geresuspended chemoattractants te filteren door middel van individuele 0,2 micrometer spuitfilters in steriele 15 milliliter conical centrifugebuizen om ongewenste deeltjes of water onoplosbare verbindingen te verwijderen.Voor isca-veldimplementatie u elke ISCA op stuk 9 van de behuizing van het apparaat schroeven en de behuizing sluiten. Verzegel de behuizing met plakband en gebruik bungee koorden om de behuizing te beveiligen tot een inzetarm en een door de mens gemaakte structuur. Als alternatief kan de behuizing worden beveiligd met een klein gewicht op een ondiep substraat of bevestigd aan een net in de Pelagische oceaan.Dompel de behuizing volledig onder om de vulling te starten, waardoor de behuizing stevig wordt vastgehouden om overmatige waterbewegingen binnen te voorkomen. Zodra het waterniveau de bovenkant van de behuizing heeft bereikt, moet u ervoor zorgen dat er geen lucht in zit. Wanneer de behuizing volledig vol is, sluit u de onderste en bovenste gaten af met twee stekkers.Laat vervolgens de ISCA 1 tot 3 uur staan. Verwijder aan het einde van de bemonsteringsperiode de behuizing uit het water. Plaats de behuizing over een container om het water af te voeren en verwijder voorzichtig het bovenste deel van de plakband uit de voorste gaten.Zodra de waterleiding onder de bovenkant van de ISCA is gepasseerd, verwijdert u de onderste stekker en voert u de rest van het water af. Terwijl de ISCA's nog steeds aan de behuizing zijn bevestigd, gebruikt u een pipet van 1 milliliter, of een spuit van 1 milliliter, om het water dat bovenop elke ISCA zit zorgvuldig te verwijderen en de ISCA's te verwijderen zonder het bovenste oppervlak aan te raken. Gebruik vervolgens een wegwerpdoek om de resterende vloeistof op het oppervlak te verwijderen en haal de monsters op zoals aangetoond voor het ophalen van het laboratoriummonster.In deze representatieve in vitro analyse, 1 millimolar werd vastgesteld dat de optimale glutamine inzet concentratie als het leidde tot een aanzienlijke chemotactische reactie die 18 keer hoger was dan de gefilterde zeewatercontrole. Hogere en lagere concentraties glutamine ook veroorzaakt significante, maar zwakkere, chemotactische reactie. In dit veld implementatie analyse, vijf ISCA replica's gevuld met 1 millimolar glutamine werden ingezet voor 1 uur op een kustplaats in de buurt van Sydney, Australië.En de glutamine gevulde ISCA trok bijna drie keer meer bacteriën dan de controle putten gevuld met gefilterd zeewater. Het belangrijkste om te onthouden bij het inzetten van de ISCA, zowel in het lab als in het veld, is om te voorkomen dat er sterke vloeistofstromen ontstaan die chemotaxi's zullen voorkomen. ISCA afgeleide monsters kunnen worden gebruikt om specifieke organismen of genen te identificeren, om het genomische potentieel van chemotactische organismen te karakteriseren en voor gerichte isolatie van specifieke stammen op selectieve media.

in-situ-chemotaxis-assay-to-examine-microbial-behavior-aquatic

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

De fabricage van microfluïdische kanalen en de uitvoering daarvan in experimenten voor het bestuderen van de chemotactische foerageergedrag van mariene microben in een fragmentarische voedingsstof zeegezicht en het zwemgedrag van de bacteriën in shear stroming worden beschreven.

Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen

Studies van Bacteriële Chemotaxis gebruik Microfluidics - Interview

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Dit werk beschrijft een nieuw protocol voor de beoordeling van de ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen, waaronder opkomende verontreinigingen zoals nanomaterialen, met behulp van de mariene bacterie Vibrio anguillarum . Deze methode laat de bepaling van de LC 50 of sterfte toe, de concentratie die een kweekbaarheid van 50% van de bacteriën veroorzaakt, na een 6 uur blootstelling.

Ecotoxicologische methode met mariene bacteriën<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; De acute toxiciteit van milieuverontreinigende stoffen beoordelen

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Hier presenteren we een verbeterd chemotaxis-testprotocol. Het doel van dit protocol is om de stappen en kosten van traditionele bacteriële chemotaxismethoden te verminderen en te dienen als een waardevolle bron voor het begrijpen van plant-microbe interacties.

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Rookgas van energiecentrales is een goedkope CO 2 bron voor algengroei. We hebben prototype "rookgas teelt van algen" gebouwd systemen en beschreef hoe de opschaling van de algen teeltproces. We hebben het gebruik van een massa-overdracht bio-reactie model te simuleren en het ontwerp van de optimale werking van rookgas voor de groei van Chlorella sp aangetoond. in algen foto-bioreactoren.

Optimaliseer Rookgas instellingen ter bevordering van microalgen groei in fotobioreactoren via Computersimulaties

Leer de in situ chemotaxis assay (ISCA) om microbieel gedrag in aquatische ecosystemen te bestuderen. Deze microfluïdische methode kwantificeert chemotaxis en isoleert micro-organismen voor metabole analyses.

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Meer video's verkennen