Name: Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Leer virus-gebaseerde microRNA-silencing met aardappelvirus X voor functionele karakterisatie in Solanum tuberosum. Deze methode biedt snelle analyse zonder stabiele plantentransformatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Yule Liu van de Tsinghua University voor het leveren van de PVX-LIC vector. Dit werk werd ondersteund door een start-up fonds van het Texas A & M AgriLife Research en het Hatch Project TEX0-1-9675 van USDA National Institute of Food and Agriculture naar JS.

1. Kweek aardappelplanten.
<ol><li>Vermeerder in vitro aardappelplanten in kweekbuizen (25 x 150 mm) met Murashige en Skoog (MS) media plus Gamborg's vitamine (MS basaal zoutmengsel, Gamborg's vitamine, 30 g/L sucrose, 3,5 g/L agar, pH = 5,7). Plaats de buizen in de groeiruimte onder 20-22 °C, 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode en lichtintensiteit 120 μmol/m2∙s1. OPMERKING: Nieuwe scheuten en wortels ontwikkelen zich normaal gesproken binnen 1-2 weken van planten. Vermeerder planten elke maand met verse MS/Gamborg's vitaminemedia.</li>
	<li>Vier weken later, transplanteer in vitro planten in de grond en kweek ze in een kas onder 20-22 °C, 16 h licht / 8 h donkere fotoperiode en lichtintensiteit 120 μmol / m2 ∙ s1. LET OP: De planten met nieuw ontwikkelde wortels en bladeren zijn geschikt om te verplanten. Houd de eerste 3-4 dagen vocht vast voor de vers verplante planten.</li>
</ol>2. Construeer de VbMS-vectoren.
<ol><li>Ontwerp en kloon de korte tandem TM-moleculen (STTM, Figuur 1)22,53 voor het miRNA van belang. OPMERKING: Verkrijg miRNA-sequenties op basis van experimentele gegevens of uit de miRbase-database54,55,56,57,58,59. De miR166-sequentie die in deze studie wordt gebruikt, is eerder beschreven60.<ol>
<li>Ontwerp de TM-module door een mismatch-sequentie, normaal gesproken 5'-CTA-3', in de omgekeerde complementsequentie van miRNA in te voegen op de plaats die overeenkomt met de 10e-11e nucleotiden van het miRNA. OPMERKING: De Stu-miR160-reeks is bijvoorbeeld 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, waarbij de 10e-11e nucleotiden vetgedrukt zijn. De omgekeerde complementsequentie (in deoxynucleotiden) is 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' en de mismatch-uitstulpingsinbrengingsplaats wordt vetgedrukt weergegeven. De TM-molecuulsequentie (deoxynucleotide) moet 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' zijn.</li>
		<li>Ontwerpprimers voor het klonen van het STTM-fragment (figuur 1). Gebruik DNA-oligonucleotiden met de 48-nt spacersequentie als sjabloon voor PCR-klonen. De voorwaartse primer bestaat uit een LIC1-linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), de voorwaartse sequentie van het bovenstaande ontworpen voor TM-molecuul, en de partiële 5'-sequentie van de 48-nt spacer (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). De reverse primer bestaat uit een LIC2-linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), de omgekeerde complementsequentie van het TM-molecuul en een partieel omgekeerd complement op de 3'-sequentie van de 48-nt spacer (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). OPMERKING: De 48-nt spacersequentie is 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Voor STTM-miR160 moet de voorwaartse primer bijvoorbeeld 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3" zijn; de omgekeerde primer moet 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' zijn (figuur 1).</li>
		<li>Versterk het STTM-fragment in een volume van 50 μL door PCR met behulp van de gesynthetiseerde universele 48-nt spacer als sjabloon en een high-fidelity DNA-polymerase.<ol>
<li>Stel de PCR-reactie in door 0,5 μL van elke primer (40 μM), 0,5 μL 48-nt spacer oligo (40 μM), 5 μL van 10x PCR-buffer, 1 μL dNTP-mengsel (10 mM elk), 0,1 μL high-fidelity DNA-polymerase (10 U/μL) en 43 μL ddH2O tot een totaal volume van 50 μL te mengen. Voer standaard PCR-ampl als volgt uit: 94 °C gedurende 3 minuten, 32 cycli van 94 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 45 s en 72 °C gedurende 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zuiver het STTM-fragment door ethanolprecipitatie. Voeg 2,5 volume ethanol en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (pH = 4,0) toe aan de PCR-producten. Meng krachtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 x g . Verwijder het supernatant en spoel de pellet af met 1 ml 70% ethanol. Droog de pellet en los deze op in 20 μL ddH2O. OPMERKING: Gebruik DNA-elektroforese om de versterking van de STTM PCR-producten te controleren.</li>
		<li>Stel de T4 DNA-polymerasereactie op ijs in door 2,5 μL gezuiverd STTM PCR-product, 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 U/μL) en 1,6 μL ddH2O te mengen tot een totaal volume van 5 μL. Incubateer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 min, en behandel de producten bij 75 °C gedurende 20 minuten om het T4 DNA-polymerase te inactiveren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de PVX-gebaseerde VbMS-constructie voor.<ol>
<li>Verteer 5 μg PVX-LIC plasmide38 met 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in een volume van 100 μL.</li>
		<li>Voeg een gelijk volume fenol:chloroform:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) toe aan de verteerde PVX-LIC producten en meng krachtig. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 x g en breng het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg een gelijk volume chloroform:isopropanol (24:1) en vortex krachtig toe. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten. OPMERKING: De PVX-LIC-vector herbergt de LIC-cassette voor klonen. De LIC-cassette van PVX-LIC vector bevat een ccdB-gen en een chlooramfenicol-resistent gen en moet worden onderhouden /vermeerderd in de E. coli-stam DB3.1 met behulp van LB-medium dat kanamycine (50 μg / L) en chlooramfenicol (15 μg / L) bevat.</li>
		<li>Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 2,5 volume ethanol en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (pH = 4,0) toe en meng krachtig. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Spoel de pellet met 1 ml 70% ethanol en vortex krachtig af. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Droog de pellet en los het verteerde PVX-LIC plasmide op met 100 μL ddH2O.</li>
		<li>Stel de T4 DNA-polymerasereactie op ijs in door 2,5 μL verteerd PVX-LIC vector DNA, 0,5 μL 10x T4 DNA polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP en 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 E/μL) te mengen in een totaal volume van 5 μL. Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten en behandel de producten bij 75 °C gedurende 20 minuten tot 20 minuten tot inactiveer het T4 DNA polymerase.</li>
	</ol></li>
	<li>Kloon de STTM-sequentie in de PVX-LIC-vector met behulp van een LIC-reactie. Meng de met T4 DNA polymerase behandelde STTM PCR-producten (5 μL) en de met T4 DNA polymerase behandelde PVX-LIC plasmiden (5 μL). Incubeer bij 70 °C gedurende 5 minuten, koel af tot 22 °C bij een helling van 0,1 °C/s en houd gedurende 30 minuten op 22 °C met behulp van een PCR-machine. OPMERKING: Verleng de incubatietijd tot 's nachts bij 4 °C om een hogere efficiëntie van LIC-klonen te bereiken.</li>
	<li>Transformeer 5 μL van de LIC-reactieproducten in de E. coli DH5α en groei op een LB-plaat met 50 μg/ml kanamycine62,63. Kies en verifieer positieve kolonies door PCR met de kloonprimers en universele primer voor de PVX-LIC-vector gevolgd door sequencing.<ol>
<li>Voer kolonie PCR uit met de voorwaartse primer voor PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in combinatie met de omgekeerde primer voor STTM-klonen om positieve klonen te identificeren. De grootte van de PCR-band moet ~ 300 bp zijn. OPMERKING: Controleer de sequenties van STTM-fragmenten door terminatorcyclussequencing64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isoleer de PVX-STTM plasmiden uit de gevalideerde klonen en transformeer ze in Agrobacterium stammen GV3101, GV2260 of EHA10562,63. Controleer Agrobacterium kolonies door PCR. OPMERKING: Bevestig Agrobacterium-kolonies met PCR met behulp van de voorwaartse primer voor PVX-LIC en de omgekeerde primer voor STTM-klonen.</li>
</ol>3. Voer PVX-gebaseerde VbMS-test uit in aardappelplanten.
<ol><li>Transplanteer 4 weken oude in vitro aardappelplanten in de grond. De getransplanteerde planten worden 3-4 dagen later onderworpen aan vbms-test.</li>
	<li>Ent aardappelplanten met Agrobacterium die de PVX-STTM plasmiden bevat. OPMERKING: Voor de VbMS-test in aardappel worden agrobacterium-gemedieerde infiltratie en tandenstokerkrabinenting gelijktijdig uitgevoerd.<ol>
<li>Kies en ent positieve transformanten die PVX-STTM-vectoren bevatten in 50 ml vloeibare LB met 50 μg / ml kanamycine en 50 μg / ml rifampicine. Kweek in een incubator van 28 °C bij 220 rpm gedurende 16 uur tot OD600 = 1,0.</li>
		<li>Streep tegelijkertijd de positieve Agrobacterium-kolonies op ten minste twee nieuwe LB-platen met 50 μg / ml kanamycine en 50 μg / ml rifampicine en groei gedurende 1 dag bij 28 ° C. Voeg de PVX-LIC38,66-vector toe als controle en PVX-GFP67,68 om de verspreiding van het virus te controleren.</li>
		<li>Verzamel de agrobacterium vloeibare cultuur door centrifugering bij 3.400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend Agrobacterium-cellen met een gelijk volume infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES en 200 μM acetosyringon, pH = 5,6) en pas aan OD600 = 1,0. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 6 uur.</li>
		<li>Infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale kant van volledig geëxpandeerde bladeren met een naaldloze spuit van 1 ml.<ol>
<li>Draai om en houd een blad met één hand vast en gebruik vervolgens één vinger om de bladlamina vanaf de adaxiale kant op de infiltratieplaats te ondersteunen. Houd de spuit met de andere hand verticaal op het bladoppervlak en infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale kant van lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schraap de Agrobacterium-cultuur van de LB-platen en kras met een tandenstoker het stengeloppervlak van de eerste één of twee internodes van de geïnfiltreerde aardappelplanten. Krab voorzichtig aan de opperhuid van de stengel. Vermijd piercings door de stengel, wat ernstige schade aan de planten kan veroorzaken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kweek de geïnfiltreerde planten bij 22 °C met een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode en lichtintensiteit van 120 μmol/m2∙ s1 in een kas. OPMERKING: Fenotypen veroorzaakt door miRNA-uitschakeling verschijnen meestal binnen 2-4 weken na deinoculatie (figuur 2, figuur 3). Het duurt meestal 10-20 dagen voordat het VbMS-fenotype na infiltratie verschijnt. Het VbMS-fenotype is afhankelijk van de eigenschappen van het specifieke miRNA en doelgenen, groeiomstandigheden en aardappelrassen.</li>
</ol>4. Voer expressieanalyse uit.
<ol><li>Wanneer fenotypen verschijnen op 2-4 weken na deinoculatie, verzamel weefsels zoals scheuten, bladeren, bloemen of wortels met fenotypen van de VbMS-planten en weefsels van de controleplanten met een schaar. Isoleer totale RNA's uit de verzamelde weefsels.</li>
	<li>Controleer de RNA-kwaliteit door elektroforese62,63 en kwantificeer de RNA-concentratie door de OD260-absorptie te meten met een spectrofotometer.</li>
	<li>Gebruik stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) om de miRNA-expressie te analyseren.<ol>
<li>Ontwerp voor specifieke miRNA's een stem-loop reverse transcription primer. Stem-loop RT primers bevatten een universele 5' backbone en een 3' 6-nt extensie van een specifiek miRNA. Ontwerp een 5' universele backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') die een steel-loop structuur vormt. (De hoofdletter komt overeen met een omgekeerd herhaalde reeks en de kleine letter met het lusgebied).</li>
		<li>Een deel van de 5'-backbonesequentie die een lus vormt, dient als de omgekeerde primer voor daaropvolgende PCR-versterking (vet-cursieve sequentie in de backbone-sequentie). Voeg een 6-nt extensiesequentie toe die omgekeerd complementair is aan het 3'-uiteinde van het miRNA van belang voor de stam-loop primer om specificiteit te bieden voor omgekeerde transcriptie (aanvullende figuur 1A). OPMERKING: Ontwerp de stem-loop reverse transcription primer zoals beschreven door Chen et al.69 en Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. De stem-loop reverse transcription primer voor Stu-miR160 is bijvoorbeeld ontworpen als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. De steel-loop reverse transcription primer voor de aardappel miR165/166 familie is ontworpen als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (De vetgedrukte hoofdletters geven de specificiteit van omgekeerde transcriptie voor specifieke miRNA's).</li>
		<li>Stel de omgekeerde transcriptiereactie in door 50-200 ng totaal RNA, 1 μL van de stem-loop reverse transcriptieprimer (100 μM), 2 μL van 10x buffer, 0,2 μL RNase-remmer (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (10 mM elk) en 1 μL reverse transcriptase (200 U/μL) op ijs te mengen. Voeg nucleasevrije ddH2O toe aan een totaal volume van 20 μL.</li>
		<li>Voer reverse transcriptie uit met behulp van de gepulste reverse transcriptie procedure. Incubeer het omgekeerde transcriptiereactiemengsel bij 16 °C gedurende 30 minuten, voer een temperatuurcyclus uit van 30 °C gedurende 30 s, 42 °C gedurende 30 s en 50 °C gedurende 1 s, gedurende in totaal 60 cycli, en inactiveer het omgekeerde transcriptase door incubatie bij 85 °C gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voor real-time PCR-analyse van miRNA-expressie ontwerpt u de voorwaartse primer op basis van de miRNA-sequentie, maar bevat u geen sequenties die overlappen met de hierboven ontworpen stem-loop reverse transcription primer. Voeg een 3-7-nt extensie toe aan de 5 ' van de voorwaartse primer om de lengte, smelttemperatuur en GC-inhoud te optimaliseren (aanvullende figuur 1). OPMERKING: De universele omgekeerde primer is 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. De stem-loop reverse transcription primer voor Stu-miR160 is bijvoorbeeld ontworpen als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. De stem-loop reverse transcription primer voor de miR165/166 familie is 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. De vetgedrukte sequenties dienen als 5 '-extensies voor primeroptimalisatie. De stem-loop reverse transcription primers en de real-time PCR primers voor miRNA kunnen worden ontworpen met behulp van de miRNA Primer Design Tool73.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetiseer cDNA's van de doelmRNA's door standaard reverse transcription PCR (RT-PCR). Incubeer het omgekeerde transcriptiereactiemengsel bij 37 °C gedurende 60 minuten en inactiveer het omgekeerde transcriptase door verhitting tot 85 °C gedurende 5 minuten. OPMERKING: (1) Voorspel doel-mRNA's met behulp van het psRNATarget-programma74 als de doel-mRNA's niet bekend zijn. (2) De universele reverse transcriptieprimer voor mRNA is een verankerde primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</li>
	<li>Stel de real-time PCR-reactie in voor zowel het miRNA van belang als de doel-mRNA's. Meng 0,5 μL sjabloon cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-buffer met SYBR groen, 0,05 μL van elke voorwaartse en achterwaartse primer (40 μM) en 4,4 μL ddH2O in een totaal volume van 5 μL op ijs.</li>
	<li>Incubeer bij 95 °C gedurende 3 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 3 s en 60 °C gedurende 30 s. Voer vervolgens als volgt een smeltcurveanalyse uit: Incubeer bij 95 °C gedurende 15 s, koel af tot 60 °C bij een helling van 20 °C/s, houd gedurende 60 s bij 60 °C, verwarm tot 95 °C bij een helling van 0,2 °C/s en houd gedurende 15 s op 95 °C. Analyseer de Ct-waarden met behulp van de ΔΔCt-methoden76,77 en zet de middelen uit met standaardfouten. OPMERKING: (1) De real-time PCR-primers voor doel-mRNA's kunnen worden ontworpen zoals beschreven75. (2) Aardappelpolyubiquitine 10-gen kan dienen als een interne controle voor normalisatie in aardappel. De voorwaartse primer voor het aardappelpolyubiquitine 10-gen is 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' en de omgekeerde primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Voor real-time PCR-analyse kunnen verontreiniging en vorming van primer-dimeer vals-positieve resultaten opleveren. Om niet-specifieke versterking te bewaken en de aansprakelijkheid van real-time PCR-analyse te vergroten, wordt aanbevolen om controles zonder sjabloon en reverse transcriptase op te nemen voor real-time PCR-assays.</li>
</ol>

We presenteren een pvx-gebaseerd miRNA-uitschakelingssysteem om de functie van endogene miRNA's in aardappel te karakteriseren door het STTM-ontwerp te integreren in de PVX-vector. Het VbMS-systeem bleek effectief te zijn in het uitschakelen van miRNA165/166 in aardappel, een sterk geconserveerde miRNA-familie voor alle plantensoorten.
De TM-benadering is ontwikkeld om te interfereren met de expressie van miRNA's op basis van een kunstmatige miRNA-doelmimiek die is ontworpen om een mismatch-lu...

Plant microRNA's (miRNA's) worden gekenmerkt als 20-24 nucleotide-lange, nucleair gecodeerde regulerende RNA's1 en spelen een fundamentele rol in bijna elk aspect van plantbiologische processen, waaronder groei en ontwikkeling2,3, fotosynthese en metabolisme4,5,6,7, hormoonsynthese en signalering8,9, biotische en abiotische reacties10, 11,12,13, en nutriënten- en energieregulatie14,15. De regulerende rollen van miRNA's van planten zijn goed geprogrammeerd en worden meestal vervuld op posttranscriptieniveau door de doel-mRNA's te splitsen of translationeel te onderdrukken.
Er is enorme vooruitgang geboekt op het gebied van identificatie, transcriptionele profilering en doelvoorspelling van miRNA's in aardappel16,17,18,19,20,21. De functionele karakterisering van miRNA's in planten, waaronder aardappelen, is echter achtergebleven bij andere organismen vanwege het gebrek aan efficiënte en high-throughput genetische benaderingen. Het is een uitdaging om functionele analyse van individueel miRNA uit te voeren door standaard analyse van functieverlies, omdat de meeste miRNA's behoren tot families met een aanzienlijke genetische redundantie22. Bovendien kan een enkel miRNA meerdere doelgenen23 aansturen en kunnen verschillende miRNA's dezelfde moleculaire route gezamenlijk moduleren24,25. Deze eigenschappen maken het moeilijk om de functie van een specifiek miRNA of een miRNA-familie te karakteriseren.
Veel van de functionele analyse van miRNA's is sterk afhankelijk van gain-of-function-benaderingen met duidelijke beperkingen. De kunstmatige miRNA (amiRNA) methode maakt gebruik van de endogene primaire transcripten (pri-miRNA's) om miRNA's op een hoog niveau te produceren, wat leidt tot remming van doelgenexpressie26,27,28,29. Activatietags en miRNA-overexpressie met behulp van een sterke constitutieve 35S-promotor leiden echter vaak tot verhoogde expressie van miRNA's die niet representatief zijn voor in vivo omstandigheden en daarom mogelijk niet de endogene functie van miRNA's weerspiegelen30. Er is een alternatieve benadering ontwikkeld met expressie van miRNA-resistente vormen van doelgenen die onreine mutaties in de bindings- en/of splitsingsplaatsen bevatten31,32,33. Maar deze benadering kan mogelijk ook leiden tot een verkeerde interpretatie van het fenotype afgeleid van het miRNA-resistente doeltransgen als gevolg van transgene artefacten. Daarom moeten conclusies uit deze gain-of-function studies met de nodige voorzichtigheid worden getrokken34. Een andere belangrijke beperking van de hierboven beschreven benaderingen is dat ze transformatie vereisen, wat arbeidsintensief en tijdrovend is. Bovendien zijn de transgene-afhankelijke benaderingen nauwelijks toepasbaar voor transformatie-recalcitrante plantensoorten. Daarom is het essentieel om een snelle en efficiënte functieverliesbenadering te ontwikkelen om de functie van miRNA's te ontrafelen.
Om de voorwaarde van de transformatieprocedure te omzeilen, is virusgebaseerde microRNA-silencing (VbMS) vastgesteld door de doelmimiek (TM) -strategieën te combineren met van virussen afgeleide vectoren. In het VbMS-systeem worden kunstmatig ontworpen TM-moleculen tijdelijk uitgedrukt vanuit een virusbackbone, wat een krachtig, snel doorvoer- en tijdbesparend hulpmiddel biedt om de functie van plantaardige endogene miRNA's te ontleden35,36. VbMS werd aanvankelijk ontwikkeld in N. benthamiana en tomaat met het tabaksratelvirus (TRV)35,36,37 en is uitgebreid naar Arabidopsis, katoen, tarwe en maïs met behulp van verschillende andere virusexpressiesystemen, waaronder aardappelvirus X (PVX)38, katoenbladkremplaatvirus (ClCrV)39, komkommermozaïekvirus (CMV)40,41,42, Chinees tarwemozaïekvirus (CWMV)43 , en gerststreepmozaïekvirus (BSMV)44,45.
Aardappel (Solanum tuberosum) is het vierde belangrijkste voedselgewas en het meest geteelde niet-biologische gewas ter wereld, voornamelijk vanwege de hoge voedingswaarde, hoge energieproductie en relatief lage inputvereisten46. Verschillende kenmerken van aardappel maken het een aantrekkelijke tweezaadlobbige modelplant. Het is een vegetatief vermeerderd polyploïde gewas met een hoge uitsteeksnelheid, heterozygositeit en genetische diversiteit. Tot op heden is er echter geen rapport dat de functie van miRNA's in aardappelen met VbMS karakteriseert. Hier presenteren we een ligatie-onafhankelijke kloon (LIC)-aangepaste aardappel PVX-gebaseerde VbMS-benadering om de functie van miRNA's in aardappelplanten te evalueren38. We selecteerden de miR165/166-familie om de VbMS-test te illustreren omdat de miR165/166-familie en hun doel-mRNA's en klasse III homeodomain / Leu-rits (HD-ZIP III) transcriptiefactoren uitgebreid zijn gekarakteriseerd22,47,48. De HD-ZIP III-genen zijn belangrijke regulatoren van meristeemontwikkeling en orgaanpolariteit, en onderdrukking van de miR165/166-functie leidt tot een verhoogde expressie van de HD-ZIP III-genen, wat resulteert in pleotrope ontwikkelingsdefecten zoals verminderde apicale dominantie en afwijkende patronen van bladpolariteit22,35,38,41 . De gemakkelijk verschroeibare ontwikkelingsfenotypen gecorreleerd met het uitschakelen van miRNA165/166 maken een nauwkeurige evaluatie van de effectiviteit van de PVX-gebaseerde VbMS-test mogelijk.
In deze studie tonen we aan dat het PVX-gebaseerde VbMS-systeem de functie van miRNA's in aardappel effectief kan blokkeren. Omdat het PVX-gebaseerde virus-geïnduceerde gen-uitschakelingssysteem (VIGS) is vastgesteld in een aantal aardappelrassen49,50,51,52, kan deze OP PVX gebaseerde VbMS-benadering waarschijnlijk worden toegepast op een breed scala aan diploïde en tetraploïde aardappelsoorten.

<table><tbody><tr><td>100 &micro;M dATP and 100 &micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td>#S0297</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>voor het onderhoud van PVX-LIC en pTRV2e met het ccdB-gen</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td></td><td></td><td>voor de bestemmingsconstructies gegenereerd door LIC-klonering</td></tr><tr><td>Meststof: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High fidelity PCR reagentia: KAPA HiFi DNA Polymerase met dNTP's</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406, USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer met Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Benchtop pH / mV Meter - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vector: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia voor real-time PCR: KAPA SYBR&reg; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Restrictie-enzym: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia voor reverse transcriptie: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA-extractiekit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Grond: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase en buffer</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

aardappelvirus x-based microrna silencing (vbms) in aardappel.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virusgebaseerde microRNA-uitschakeling (VbMS) is een snel en efficiënt hulpmiddel voor functionele karakterisering van microRNA's (miRNA's) in planten. Het VbMS-systeem is ontwikkeld en toegepast voor verschillende plantensoorten, waaronder Nicotiana benthamiana, tomaat, Arabidopsis, katoen en eenzaadlobbige planten zoals tarwe en maïs. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol met pvx-gebaseerde VbMS-vectoren om endogene miRNA's in aardappel het zwijgen op te leggen. Om de expressie van een specifiek miRNA neer te halen, worden doel-mimic (TM) moleculen van miRNA van belang ontworpen, geïntegreerd in plantenvirusvectoren en uitgedrukt in aardappel door Agrobacterium-infiltratie om rechtstreeks te binden aan het endogene miRNA van belang en de functie ervan te blokkeren.

Figuur 2 toont de PVX-STTM165/166 aardappelplanten (Katahdin) met ectopische groei van bladweefsels vanaf de abaxiale kant van bladlamina langs de aderen. Meer ernstige fenotypen zoals trompetvormige bladvorming zijn ook waargenomen. Daarentegen werd geen fenotypische afwijking waargenomen in de PVX-controlefabrieken. Deze resultaten tonen aan dat het VbMS-systeem effectief was in het onderdrukken van de endogene miRNA-functie in tetraploïde aardappelplanten en het PVX-VbMS-systeem was een r...

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het op aardappelvirus X (PVX) gebaseerde microRNA-uitschakelingssysteem (VbMS) om endogene microRNA's (miRNA's) in aardappelen functioneel te karakteriseren. Target mimic (TM) moleculen van miRNA van belang worden geïntegreerd in de PVX-vector en tijdelijk uitgedrukt in aardappel om de doel miRNA- of miRNA-familie tot zwijgen te brengen.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

De traditionele benadering voor het analyseren van de functie van microRNA's in planten berust primair op het genereren van stabiele knockdown-planten. Dit op virus gebaseerde microRNA-silencing-systeem vereist geen vervelende en tijdrovende transformatie. Virusgebaseerde microRNA-silencing is een snelle en efficiënte tool voor functionele karakterisering van microRNA's in planten die kan worden toegepast op een breed scala aan diploïde en tetraploïde aardappelsoorten.Jinping Zhao, een post-doctoraal onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om de doelnabootsermodule te ontwerpen, voegt u een mismatch-sequentie toe aan de omgekeerde complementaire sequentie van het geïnteresseerde microRNA op de plaats die overeenkomt met de 10e tot 11e nucleotiden van het microRNA. Om het korte tandem doelnabootserfragment te versterken, zet u een PCR-reactie op met elk primer van belang, een 48 nucleotiden ruimte-oligo, 10 keer PCR-buffer, een dNTP-mengsel, high fidelity PCR DNA-polymerase en gedestilleerd water tot een eindvolume van 50 microliter.Vervolgens versterkt u het microRNA door standaard PCR met de aangegeven parameters. Om de korte tandem doelnabootsers te zuiveren, voegt u 2,5 volumes ethanol en een 1/10e volume van drie molaire natriumacetaat toe aan het PCR-product. Roer krachtig voordat u de reactie gedurende 10 minuten centrifugeert bij 14.000 keer G.Na het verwijderen van het supernatant, spoelt u de pellet met één milliliter 70% ethanol en laat u de pellet drogen, lost u de pellet vervolgens op in 20 microliter gedestilleerd water. Om een T4 DNA-polymerase-reactie op te zetten, mengt u het gezuiverde korte tandem doelnabootser PCR-product met 10 keer T4 DNA-polymerase-buffer, een molaire dithiothreitol, 100 millimolar dATP, T4 DNA-polymerase en gedestilleerd water tot een eindvolume van vijf microliter op ijs. Vervolgens incubeert u het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door een incubatie van 20 minuten bij 75 graden Celsius om de T4 DNA-polymerase te inactiveren.Om de PVX-gebaseerde VBMS-constructie voor te bereiden, verteerd u vijf microgram PVX ligatie-onafhankelijke kloneringplasmiden met 2,5 microliter SMA1 in een totaal volume van 100 microliter. Voeg een gelijk volume fenol toe aan chloroform tot isoamyalcohol, voeg een 25 tot 24 tot één verhouding toe aan de verteerde PVX ligatie-onafhankelijke kloneringsproducten met krachtig mengen en verzamel het product door centrifugatie. Voeg een gelijk volume chloroform tot isoamyalcohol in een 24 tot één verhouding toe aan het supernatant met vortexen voordat u de inhoud van de buis onderwerpt aan een tweede centrifugatie.Aan het einde van de draai, brengt u het supernatant over naar een nieuwe centrifugeerbuis en voegt u 2,5 volumes ethanol en een 1/10e volume van drie molaire natriumacetaat toe met krachtig mengen. Centrifugeer de buis en spoel de pellet met één milliliter 70% ethanol en krachtig vortexen. Centrifugeer de buis opnieuw en verwijder het supernatant om de pellet te laten drogen.Los vervolgens de verteerde PVX ligatie-onafhankelijke kloneringplasmidpellet op in 100 microliter gedestilleerd water. Om de T4 DNA-polymerase-reactie op te zetten, mengt u het verteerde PVX ligatie-onafhankelijke kloneringsvector DNA met 10 keer T4 DNA-polymerase-buffer, een molaire dithiothreitol, 100 millimolar dTTP en T4 DNA-polymerase tot een eindvolume van vijf microliter op ijs. Vervolgens incubeert u het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door een incubatie van 20 minuten bij 75 graden Celsius om de T4 DNA-polymerase te inactiveren.Om de korte tandem doelnabootsersequentie in de PVX ligatie-onafhankelijke kloneringvector te klonen, mengt u vijf microliter van het met T4 DNA-polymerase behandelde korte tandem doelnabootser PCR-product met vijf microliter van het met T4 DNA-polymerase behandelde PVX ligatie-onafhankelijke kloneringplasmid en incubeert u het mengsel gedurende vijf minuten bij 70 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, koelt u de inhoud van de buis af tot 22 graden Celsius in een PCR-machine met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde, waarbij u de buis 30 minuten in de thermocycler laat staan zodra de doeltemperatuur is bereikt. Aan het einde van de incubatie, transformeert u vijf microliter van het ligatie-onafhankelijke kloneringreactieproduct in E.coli DH5 alfa volgens standaard transformatieprotocollen en laat u de getransformeerde bacteriën groeien op een LB-plaat met 50 microgram per milliliter kanamycine.Na het verifiëren van de sequenties van de korte tandem doelnabootserfragmenten door terminatorcyclussequentiebepaling, isoleert u de PVX VBMS-plasmiden van de gevalideerde klonen en transformeert u deze in de geschikte Agrobacterium-stammen. Om vier weken oude in vitro aardappelplanten te inoculeren met Agrobacterium dat de PVX VBMS-plasmiden bevat, kiest u positieve transformanten die PVX VBMS-vectoren bevatten en inoculeert u de transformanten in 50 milliliter vloeibaar LB met 50 microgram per milliliter kanamycine en 50 microgram per milliliter rifampicine gedurende 16 uur bij 28 graden Celsius en 220 omwentelingen per minuut. Tijdens de incubatie, strekt u positieve Agrobacterium-kolonies uit op ten minste twee nieuwe LB-platen met kanamycine en rifampicine en laat u de culturen een dag groeien bij 28 graden Celsius.Wanneer de optische dichtheid bij 600 nanometer 1,0 bereikt, verzamelt u de Agrobacterium-vloeibare cultuur door centrifugatie en resuspendeert u de pellet in een voldoende volume infiltratiebuffer om de optische dichtheid bij 600 nanometer op 1,0 aan te passen. Na een incubatie van zes uur bij kamertemperatuur, laadt u een naaldloze spuit van één milliliter met de Agrobacterium-suspensie en gebruikt u één hand om een uitgebreid blad van een aardappelplant om te draaien en vast te houden. Met één vinger ondersteunt u de bladschijf van de adaxiale zijde op de gewenste infiltratieplaats.En terwijl u de spuit verticaal tegen het bladoppervlak houdt met de andere hand, infiltreert u 100 tot 200 microliter Agrobacterium-cultuur in de abaxial

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine ​​residuen van...

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em&gt; Maïs rayado fino virus</em&gt; Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP

Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

We beschrijven hier een methode voor het reguleren van picornavirus-tropisme door sequenties die complementair zijn aan specifieke microRNA's in het virale genoom op te nemen. Dit protocol kan worden aangepast aan alle verschillende klassen van virussen met aanpassingen op basis van de lengte en aard van hun levenscyclus.

MicroRNA-gebaseerde verordening van Picornavirus Tropism

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de snelheid van geprogrammeerde celdoodinitiatie door continu geïnoculeerde bladeren in beeld te brengen na celdoodinductie.

Het bestuderen van celdoodinitiatie met behulp van een digitale microscoop

Leer virus-gebaseerde microRNA-silencing met aardappelvirus X voor functionele karakterisatie in Solanum tuberosum. Deze methode biedt snelle analyse zonder stabiele plantentransformatie.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Meer video's verkennen