ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jan Voorberg van de afdeling Plasma Eiwitten, Sanquin Research en Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, Nederland, voor zijn inbreng in dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Nederlandse CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] toegekend aan het Phaedra en het Reconnect consortium en de Impulse grant 2018 toegekend aan het Phaedra IMPACT consortium. Deze subsidies omvatten collectieve financiering door de Nederlandse Hartstichting, Nederlandse Federatie van Universitair Medische Centra, De Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en Ontwikkeling, en de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. Bovendien werd dit werk gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad in het kader van het Advanced Grant 'VESCEL'-programma (Grant number: 669768). XDM wordt gefinancierd door een onderzoeksbeurs van het Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) van het VU Medisch Centrum, Amsterdam.

<ol><li>Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+control+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cardiovascular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell control of thrombosis.</a> BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130(2015).</li>
<li>Pearson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and thrombosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).</li>
<li>Bochenek, M. L., Schafer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Endothelial+Cells+in+Acute+and+Chronic+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hamostaseologie%22%5BJournal%5D)">Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis.</a> Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).</li>
<li>Swieringa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Control+of+Fibrin+Distribution+and+Microelasticity+in+Thrombus+Formation+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).</li>
<li>Macfarlane, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Enzyme+Cascade+in+the+Blood+Clotting+Mechanism%2C+and+Its+Function+as+a+Biochemical+Amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier.</a> Nature. 202, 498-499 (1964).</li>
<li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).</li>
<li>Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+platelets%2C+the+coagulation+and+fibrinolytic+systems+to+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing.</a> Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).</li>
<li>Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cellular+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).</li>
<li>Karino, T., Motomiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+a+venous+valve+and+its+implication+for+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation.</a> Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).</li>
<li>ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+a+major+contributor+to+global+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).</li>
<li>Witkin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pulmonary+embolism%3A+the+role+of+the+pulmonary+embolism+response+team%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team.</a> Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915(2019).</li>
<li>Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+biomarkers+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480(2019).</li>
<li>Giri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interventional+Therapies+for+Acute+Pulmonary+Embolism%3A+Current+Status+and+Principles+for+the+Development+of+Novel+Evidence%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).</li>
<li>Sharma, S., Lang, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+pathophysiology+of+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).</li>
<li>Eisenberg, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinopeptide+A+levels+indicative+of+pulmonary+vascular+thrombosis+in+patients+with+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension.</a> Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).</li>
<li>Bochenek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+thrombosis+to+fibrosis+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).</li>
<li>Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+microfluidics+to+assess+the+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation.</a> Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).</li>
<li>Barendrecht, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+Imaging+of+Platelet+Degranulation+and+Secretion+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55658(2017).</li>
<li>Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57009(2018).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55917(2017).</li>
<li>Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stasis+Promotes+Erythrocyte+Adhesion+to+von+Willebrand+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>Szulcek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Microvascular+Shear+Adaptation+in+Pulmonary+Arterial+Hypertension.+Role+of+Platelet+Endothelial+Cell+Adhesion+Molecule-1+Cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).</li>
<li>Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high+shear+rate+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Role of high shear rate in thrombosis.</a> Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+whole+blood+thrombosis+in+a+microfluidic+device+lined+by+fixed+human+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium.</a> Biomedical Microdevices. 18 (4), 73(2016).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+prolonged+increase+in+endothelial+permeability+induced+by+histamine+and+thrombin%3A+role+of+protein+kinases%2C+calcium%2C+and+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA.</a> Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).</li>
<li>Smits, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Outgrowth+and+Proliferation+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+are+Related+to+Markers+of+Disease+Severity+in+Patients+with+Pulmonary+Arterial+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763(2018).</li>
<li>Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serial+hemodilution+with+hydroxyethyl+starch%2C+albumin%2C+and+0.9%25+saline+on+whole+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation.</a> Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+peptides+enhance+single+cell+adhesion+and+viability+on+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir-ACS%22%5BJournal%5D)">Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays.</a> Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).</li>
<li>Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+size-dependent+cell+adhesion+on+nanostructured+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces.</a> Journal of Nanobiotechnology. 12, 54(2014).</li>
<li>McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weibel-Palade+bodies+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Weibel-Palade bodies at a glance.</a> Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).</li>
<li>Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mast+Cell%2C+Contact%2C+and+Coagulation+System+Connection+in+Anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 846(2017).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Huveneers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+associates+with+endothelial+VE-cadherin+junctions+to+control+force-dependent+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling.</a> Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Yamasaki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+arterial+stiffness+and+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Association between arterial stiffness and platelet activation.</a> Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3958(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Stolling is een gevolg van het complexe en tijdelijk gecontroleerde samenspel tussen het endotheel en de bloedbestanddelen. Deze in vitro test presenteert een methode om trombogene eigenschappen van endotheelcellen in real-time te onderzoeken. Verschillende soorten primaire menselijke endotheelcellen kunnen worden gebruikt, waardoor in situ trombose op een orgaan- en patiëntspecifieke manier wordt vergemakkelijkt. In deze studie illustreerden we het gebruik van dit protocol waarbij trombogene eigenschappen van PAECs geïsoleerd van gezonde donoren vergeleken met CTEPH-patiënten worden vergeleken. Live trombusvorming werd bestudeerd door perfusie van volbloed van gezonde proefpersonen over histamine-geactiveerd endotheel, terwijl het effect van een DOAC werd getest als een antitrombotisch middel.
Naast het gebruik van commercieel verkrijgbare microkanalen, zoals blijkt uit de representatieve resultaten, maakt de introductie van de op maat gemaakte microfluïde kanalen het mogelijk om de invloed van vasculaire geometrieveranderingen op de trombusvorming te bestuderen. Bijvoorbeeld, stroom afneemt op een tak punt of stenose resulteert in een toename van schuifspanning en meer bloedplaatjes activering36. Een belangrijke beperking van deze op maat gemaakte microfluïde kanalen is echter de eis van hoge celnummers om een stabiele monolaag van EC's te vormen, zoals beschreven in stap 2.3.2. Dit kan een beperkende factor zijn wanneer patiënt-afgeleide cellen schaars zijn. De sterke punten van de commercieel beschikbare microglijbanen zijn dat oppervlaktes worden aangepast voor celkweek en groeigebieden groter zijn, waardoor EC's een confluent en stabiele monolaag kunnen vormen. Aan de andere kant, een groter oppervlak zal resulteren in een groter lumen. Volgens vergelijking 1vereist dit hogere bloedvolumes om vergelijkbare stroomsnelheden te bereiken als in de op maat gemaakte microfluidics.
Een verbetering van dit protocol zou kunnen zijn om levend EG-verlies of veranderingen in de integriteit van de belemmering te onderzoeken. Eg-schade in dit protocol wordt pas aan het einde van het experiment gemeten. Voor live tracking kunnen ECs worden getagd met mCherry VE-cadherin, bijvoorbeeld37. Echter, omdat dit een zeer geoptimaliseerd protocol met efficiënte virustransfectie nodig zou hebben, kan Electric Cell-substraat Impedance Sensing (ECIS) worden gebruikt als alternatief voor het bestuderen van endotheelintegriteit en barrièrefunctie38. Perfusie via speciale ECIS-stroomkanalen maakt longitudinale monitoring van de integriteit van de endotheliale barrière onder stroom mogelijk. Deze specifieke ECIS-kenmerken maken parallelle metingen van endotheelbarrière-eigenschappen en trombusvorming mogelijk. Alternatieve manieren voor parallelle EG-barrièremetingen, met name in de op maat gemaakte arrays, zijn het gebruik van fluorescerende dextrans in het perfusaat, dat zich uit het lumen verspreidt, afhankelijk van de eigenschappen van de EG-barrière.
Een beperking van het beschreven protocol is dat ECs uit het menselijk lichaam worden verwijderd en gekweekt op weefselkweekplastic, wat een stijf, kunstmatig substraat is. Cellen passen zich aan hun biofysische omgeving aan. Dit kan mogelijk van invloed zijn op de endotheelrespons op de activering van bloedplaatjes, omdat er een verband is tussen de activering van bloedplaatjes en de stijfheid van de wand39. Ondanks deze aanpassingen aan kweekplastics, houden cellen ziektespecifieke kenmerken die kunnen worden geïdentificeerd in directe vergelijking met EC's die zijn afgeleid van gezonde donoren, zoals aangetoond met controle, CTEPH-PAEC en HUVEC die verschillende patronen van bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting na 5 min bloedperfusie uitoefenden.
In tegenstelling tot andere protocollen gebruikt dit systeem volbloed, terwijl anderen de interactie van de EG bestuderen met een enkele bloedcomponent zoals bloedplaatjes en leukocyten19,20,21. Er zijn meer geavanceerde microfluïde modellen ontwikkeld die het mogelijk maken de studie van endotheelfunctie in een vasculaire model met een ronde vat geometrie en zachte extracellulaire matrix. Deze zijn echter geoptimaliseerd met HUVEC's40,41,42. De nieuwigheid van het beschreven protocol is het gebruik van primaire EU's in combinatie met volbloed waardoor de modellering van in situ trombose een stap dichter bij in vivo omstandigheden komt. Na het protocol voor het gebruik van door de patiënt afgeleide ECs en door patiënten afgeleid bloed te hebben geoptimaliseerd, optimaliseert het ziektemodellering in vitroverder, waardoor de beoordeling van gepersonaliseerde trombusvorming en medicamenteuze behandeling mogelijk is.
Het beschreven protocol kan worden toegepast om het effect van antistollingstherapieën op patiëntcellen te bestuderen. Terwijl we dabigatran gebruikten om de vorming van trombus te remmen, is het mogelijk om andere antistollingsmiddelen te gebruiken, zoals rivaroxaban, wat direct factor Xa in de stollingscascade remt. Direct-bloedplaatjes remmers zoals clopidogrel of aspirine kan ook worden bestudeerd, omdat deze werken op de primaire fase van hemostase waar bloedplaatjes binden aan ECs. Uiteindelijk kan de trombogene capaciteiten van patiëntspecifieke ECs in interactie met het eigen bloed van de patiënt worden gebruikt om het persoonlijke effect van antistollingstherapie op de individuele patiënt te voorspellen. Bovendien kan een knockdown van specifieke eiwitten extra functionele informatie opleveren.
Er zijn enkele stappen in het beschreven protocol die van cruciaal belang zijn voor een succesvol perfusie-experiment. Ten eerste is het tijdens de isolatie van primaire cellen noodzakelijk om een zeer zuivere EG-cultuur te verkrijgen. Ten tweede is het belangrijk dat de EU's een stabiele confluent monolayer vormen. Als dit niet het geval is, kan een lichte verandering in schuinspanning endotheliale schade en activering van de stollingscascade veroorzaken, of bloedplaatjes kunnen beginnen binden aan het keldermembraan, wat fout-positieve resultaten zal opleveren. Ten derde is het essentieel om luchtbellen te voorkomen, omdat die het endotheel kunnen beschadigen en daardoor de resultaten kunnen beïnvloeden.
Na herkalking van het citrated bloed met calciumchloride en magnesiumchloride is het belangrijk om onmiddellijk met het perfusie-experiment te beginnen. Recalcificatie induceert een snelle respons bij bloedplaatjesactivering en trombusvorming, wat resulteert in een snelle stolling in het monster.
Tot slot beschrijven we een zeer veelzijdig protocol om hele bloed-endotheelcelinteracties te bestuderen tijdens trombose.

Het endotheel vormt de binnenste cellaag van bloedvaten en scheidt bloed van het omliggende weefsel. Het is beschreven als een dynamisch orgaan dat actief reguleert zijn micro-omgeving en reageert op externe stimuli1. Vanwege het directe contact met stromend bloed is het endotheel cruciaal in de controle van hemostase en trombose en is het de primaire bron van veel van de belangrijkste regulerende moleculen die bloedplaatjesaggregatie, stolling en fibrinolyse2controleren. Gezonde, niet-geactiveerde endotheelcellen (EC) produceren verschillende moleculen die de activering van bloedplaatjes tegengaan en stolling en trombusvorming voorkomen om de bloedstroom te handhaven, zoals prostacyclin, trombomodulin of weefselfactorrouteremmer (TFPI)2,3. Dit voorkomt de hechting van bloedplaatjes, bloedplaatjes aggregatie, en trombus vorming. Letsel of activering van de vaatwand resulteert in een procoagulant endotheel fenotype dat gelokaliseerde bloedplaatjesver hechting en stolselvorminginitieert 2,4. Bij endotheelactivering houden bloedplaatjes zich aan von Willebrand Factor (VWF), een multimerisch eiwit dat vrijkomt uit EC's, of op blootgestelde bindingsplaatsen van de onderliggende subendothelial matrix. Vervolgens initiëren moleculaire veranderingen in bloedplaatjes en de blootstelling aan weefselfactor (TF) de activering van het stollingssysteem, wat trombbusvorming induceert door fibrinpolymerisatie5,6. Samen vormt het resulterende stolsel de basis voor wondsluiting door re-endotheelisatie7. Verstoringen van het stollingssysteem kunnen leiden tot bloedingsstoornissen, zoals de ziekte van Von Willebrand, hemofilie of trombose, die vaak het gevolg zijn van een geïmreguleerde pro- en antitrombotische balans van het endotheel hemostatische pad2,3.
Het proces van hemostase vindt plaats in zowel de arteriële als de veneuze circulatie. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan arteriële en veneuze trombose zijn fundamenteel verschillend. Terwijl arteriële trombose, zoals te zien is in ischemische hart-en vaatziekten, wordt meestal gedreven door de breuk van een atherosclerotische plaque onder omstandigheden van hoge shear stress, veneuze trombose ontwikkelt zich meestal bij afwezigheid van endotheelletsel in een toestand van stasis8,9,10. Een diepe ader trombus kan emboliseren en reizen naar de longslagaders, waar het veroorzaakt een longembolie. Dit kan leiden tot chronische vasculaire obstructies die leiden tot aanzienlijke verminderde functionele capaciteiten die de ontwikkeling van chonic longziekten kunnen bevorderen, waaronder de ontwikkeling van chronische trombo-embolische pulmonale hypertensie (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH wordt gekenmerkt door verhoogde longdruk als gevolg van obstructies van de longslagaders door trombo-embolisch materiaal na ten minste drie maanden antistollingstherapie15. Naast longsembololie wordt gepostuleerd dat het longendotheel een protrombotische omgeving in CTEPH biedt die in situ trombose en chronische obstakels van de pulmonale slagaders vergemakkelijkt, waardoor de toename van de bloeddruk ontstaat die uiteindelijk kan leiden tot hartfalen, indien onbehandeld16,17.
In de afgelopen jaren hebben verschillende studies geleid tot de ontwikkeling van tests om de vorming van trombus te onderzoeken door bloedplaatjesfunctie en stolling te meten18. De meesten van hen bestuderen echter de interactie van volbloed met enkele extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen of fibrins, of endotheelfunctie in interactie met enkele bloedbestanddelen, zoals endotheelplaatjes of endotheel-leukocyte interactie19,20,21,22. Deze tests worden meestal uitgevoerd met menselijke navelstrengader endotheelcellen (HUVEC), omdat deze cellen gemakkelijk kunnen worden verkregen. Hemostatische genen worden echter differentieel uitgedrukt over de vasculaire boom, vaattypen en orgaansystemen23,24, waardoor het gebruik van HUVECs om endotheelcellen te vertegenwoordigen die betrokken zijn bij arteriële trombose of longembolie problematisch23.
Naast ec-plasticiteit kunnen ziektespecifieke hemodynamische veranderingen en veranderingen in vasculaire morfologie de vorming van trombus bij het normale endotheel25bevorderen. Hogere afschuifsnelheden, als gevolg van lokale vasoconstrictie of veranderingen in de vaatgeometrie, bijvoorbeeld, kunnen leiden tot acute trorombusvorming, waardoor een stenose ontstaat die de stopzetting van de bloedstroom versnelt26. Het gebruik van op maat gemaakte micro-engineered flow kanalen maakt het mogelijk om specifiek vasculaire geometrieën te ontwerpen die representatief zijn voor de (patho)biologie. Op deze manier is het mogelijk om het effect van lokale biomechanische krachten op gezonde of zieke EC27te bestuderen.
Er zijn antistollingstherapieën beschikbaar voor het richten van verschillende fasen en moleculen in de stollingscascade, die allemaal bijzondere risico's en voordelen opleveren die specifiek kunnen zijn voor bepaalde aandoeningen. De in dit artikel beschreven benadering van ziektemodellering is bijzonder geschikt om de effecten van verschillende antistollings- en antiplaattherapieën op trombusdynamica te testen.
Het doel is om een model van trombose te presenteren dat primaire ELE's bevat, wat een veelzijdig model oplevert dat geschikt is voor de analyse van verschillende vormen van trombose, afhankelijk van het type primaire ED's dat wordt gebruikt. Ter illustratie gebruikten we longslagader endotheelcellen van CTEPH-patiënten in interactie met vol menselijk bloed dat alle componenten bevat die betrokken zijn bij trombbusvorming (bloedplaatjes, leukocyten, erytrocyten, stollingseiwitten en cofactoren). Deze aanpak kan worden toegepast in commerciële parallelle stroomkanalen of in op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen met een specifiek vasculair ontwerp. Als zodanig kan het model uiteindelijk worden gebruikt in de studie van trombusvorming en -resolutie, voor de beoordeling van ontstekingsreacties bij ziektemodellering, voor antiplatelet- of antistollingstherapie en uiteindelijk voor gepersonaliseerde geneeskunde.
Deze studie beschrijft de isolatie van primaire menselijke longslagader endotheelcellen. Voor de isolatie van andere primaire menselijke endotheelceltypes verwijzen we naar eerder gepubliceerde methoden, waaronder longmicrovasculaire endotheelcellen25, menselijke navelader endotheelcellen28en bloedcirculatievormende endotheliale koloniecellen Figuur 1A29.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 mL-spuit</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X objectief</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0.45</td></tr><tr><td>2-Propanol (IPA)</td><td>Boom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Aladdin-spuitpomp</td><td>Word Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogeen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug/mL</td></tr><tr><td>Alexa647-Geit anti-Konijn</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Biopsie punch 1 mm diameter</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Rund Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM-Rood</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Collagene Type I, rattenstaart</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Surface 60 mm Cultuurschaal</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>Cross-flow afzuigkap</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Endotheliaal Cell Medium (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Humaan Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Flow tubing</td><td>ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>micron-Slide VI 0.4 flow chambers</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Lab oven</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 Fluorescerende microscoop</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Luer-connector</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>Male elbow connectors, Female tube connectors</td></tr><tr><td>MACS magnetische kralen (anti-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Negatieve fotoresist, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Aminozuren (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PFA in PBS</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>geen calcium of magnesium</td></tr><tr><td>Plasma chamber, CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>natriumcitraat bloedverzamelbuisjes</td><td>BD</td><td>363048</td><td></td></tr><tr><td>trisodiumcitraat</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.05%), fenol rood</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin (D87F2)-XP</td><td>Cell Signaling</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

in vitro microfluidic disease model to study whole blood-endothelial interactions and blood clot dynamics in real-time

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

De vorming van bloedstolsels omvat complexe interacties tussen endotheelcellen, hun onderliggende matrix, verschillende bloedcellen en eiwitten. Het endotheel is de primaire bron van veel van de belangrijkste hemostatische moleculen die bloedplaatjes aggregatie, stolling en fibrinolyse controleren. Hoewel het mechanisme van trombose al tientallen jaren wordt onderzocht, richten in vitrostudies zich voornamelijk op situaties van vasculaire schade waarbij de subendothelial matrix wordt blootgesteld, of op interacties tussen cellen met enkele bloedbestanddelen. Onze methode maakt het mogelijk om interacties tussen volbloed en een intact, samenvloeiend vasculair celnetwerk te bestuderen.
Door gebruik te maken van primaire menselijke endotheelcellen biedt dit protocol de unieke kans om de invloed van endotheelcellen op trombosedynamiek te bestuderen en geeft het waardevolle inzicht in de pathofysiologie van trombotische ziekte. Het gebruik van op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen maakt toepassing van ziektespecifieke vasculaire geometrieën en modelspecifieke morfologische vasculaire veranderingen mogelijk. De ontwikkeling van een trombus wordt in real-time en kwantitatief geregistreerd door bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting. Het effect van endotheelfunctie in veranderde trombusdynamica wordt bepaald door postanalyse door immunofluorescentie kleuring van specifieke moleculen.
De representatieve resultaten beschrijven de experimentele installatie, gegevensverzameling en gegevensanalyse. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters voor elke sectie worden aangepast, waaronder celtype, schuifsnelheden, kanaalgeometrie, medicamenteuze therapie en postanalyseprocedures. Het protocol wordt gevalideerd door de vorming van trombus op het longslagader-entheel van patiënten met chronische trombo-embolische ziekte te kwantificeren.

De representatieve resultaten kunnen worden onderverdeeld in drie delen, die elk de respectieve stappen van experimentele installatie, gegevensverzameling en gegevensanalyse vertegenwoordigen. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters voor elke stap worden gewijzigd. De gepresenteerde gegevens worden toegepast om de invloed van het endotheel op de trombusvorming te bestuderen.
Experimentele installatie Het is algemeen bekend dat endotheelcellen zeer heterogeen zijn in structuur en functie, afhankelijk van locatie en tijd, tijdens gezondheid en ziekte23. Verschillende bronnen van endotheelcellen kunnen worden gebruikt om endotheelbloedinteractie te bestuderen, die in dit geval commercieel beschikbaar waren HUVECs en PAECs(figuur 1A). HUVECs zijn de meest gebruikte in laboratoriummodellen, terwijl PAECs zijn patiënt-afgeleide geïsoleerde cellen uit de longslagaders. Bovendien zijn er gevestigde protocollen beschikbaar om microvasculaire endotheelcellen (MVEC) te isoleren van de longcirculatie of bloedcirculatiecellen (ECFC)25,28,29.
Na isolatie werden endotheelcellen gekenmerkt door VE-cadherin, CD31 en TIE2-kleuring om een endotheel fenotype te bevestigen. Karakterisering voor de aanwezigheid van αSMA en cytokeratine duidde op het ontbreken van een fibroblast of epitheelachtig fenotype (figuur 1B). Na het verkrijgen van een zeer zuivere populatie van ECs, passage 3-5 cellen werden gebruikt om ofwel een commerciële microslide of op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen zaad (Figuur 1C). Hoewel de commercieel verkrijgbare microglijbanen voornamelijk parallelle stroomkamers zijn, of Y-vormige kanalen met specifiek gedefinieerde parameters in hoogte- of bifurcatiehoek, maakt het gebruik van microfluïde dia's het mogelijk om de experimentele parameters aan te passen aan in vivo geometrie en bloedstroomdynamiek31. Echter, op maat gemaakte microfluidic maten zijn kleiner en hebben de neiging om celverspreiding te beperken en meer celdood32,33induceren . Het gebruik van een overschot aan cellen compenseert het feit dat slechts een klein percentage van de cellen zich zal hechten. Dit werd waargenomen bij de introductie van een stenose, waarbij endotheelcellen een langwerpiger fenotype vertoonden in vergelijking met een parallel microfluïdisch kanaal(figuur 1D). Commerciële stroomkamers hebben een groter oppervlak waar cellen zich aan kunnen binden. Dit vereist minder celnummers voor zaaien.
Om endotheelcelbloedinteractie te bestuderen, werd volbloed geperfundeerd over een endotheelmonolaag. Citrated bloed werd verzameld op de dag van het experiment en onmiddellijk voor perfusie recalcified. Cellen werden met histamine gestimuleerd om VWF-afgifte en bloedplaatjes adhesie 30 min vóór perfusie(figuur 1E)34,35te induceren . Vanwege de kleine afmetingen, de op maat gemaakte microfluïde kanalen toegestaan gebruik van kleinere bloedvolumes.
Gegevensverzameling Om de vorming van trombus op PAECs te onderzoeken, werden Calcein AM-Red fluorescerend gelabelde bloedcellen en Alexa488-geconjugeerde fibrin gedurende 5 minuten geperfuseerd bij 2,5 dyne/cm2 (Figuur 2A–C). Aanhangende bloedcellen en gedeponeerde fibrine werden gekwantificeerd. Beelden werden verworven om de 30 s en gekwantificeerd met ImageJ. Het was belangrijk om de achtergrond af te trekken om de autofluorescentie van niet-kralen bloedplaatjes te elimineren. Het driehoeksalgoritme voor thresholding is gebruikt om minimale achtergrond te definiëren. Het was toegestaan voor het meten van kleine bloedplaatjes aggregaten (figuur 2D).
Naar verwachting was er onder niet-stimulerende omstandigheden geen binding van bloedplaatjes en fibrin aan het endotheel. Om vwf-afgifte en bloedplaatjesbinding te bevorderen, werden PAECs gestimuleerd met histamine, wat resulteerde in een onmiddellijke toename van de bloedplaatjesverkleving die na 2,5 min een plateau bereikte. Op dit moment begonnen bloedplaatjes autocrinefactoren af te scheiden die bloedplaatjesaggregatie en fibrinogen decolleté in fibrine veroorzaakten. Fibrin werd na 3 min gedeponeerd en vormde na 4 min een stabiel aggregaat met bloedplaatjes (figuur 2E).
Om te onderzoeken of dit effect kan worden geremd door een direct oraal antistollingsmiddel (DOAC), werd bloed behandeld met 10 nM dabigatran. Dabigatran werd toegevoegd aan de bloedverdunning, waar het factor IIa in de stollingsroute remt en het decolleté van fibrinogen verhinderde om fibrinevezels te vormen. Wanneer met dabigatranbehandeld bloed werd geperfuseerd over gestimuleerde PAECs, kon de stolselvorming direct worden geremd, voornamelijk door fibrindepositie uit te stellen (figuur 2F).
Gegevensanalyse Om de invloed van verschillende endotheelbronnen op trombusvorming te bestuderen, werden de cellulaire veranderingen op 5 min bloedperfusie geanalyseerd. Het endotheel werd bevestigd en aanhangende bloedplaatjes werden gelabeld met CD42b voordat beeldvorming onder een confocale microscoop. Dit leverde een gedetailleerde analyse op voor colocalisatie van bloedplaatjes en fibrin die kunnen wijzen op disfunctionele stollingsfactoren in het bloed. De invloed van EC op stolselvorming werd bepaald door standaard immunofluorescente kleuring. Endotheel cel-cel contacten werden gehandhaafd, zoals bevestigd door VE-cadherine vlekken, wat aangeeft dat de bloedstolsels gevormd op de top van de endotheel monolaag in plaats van op de onderliggende matrix tussen endothelial hiaten (Figuur 3). Bovendien resulteerde het gebruik van verschillende celbronnen in verschillende patronen van trombivorming op het endotheel. HUVECs zijn veneuze endotheelcellen en vertoonden beperkte bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting, terwijl zieke primaire PAEC van CTEPH-patiënten overvloedige bloedplaatjeshechting en meer fibrinafzetting vertoonde bij histaminestimulatie in vergelijking met gezonde PAEC. Dit suggereert dat het endotheel van CTEPH-patiënten een hogere respons op vasoactivatie vertoont, wat resulteert in verhoogde trombusvorming.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van het protocol. (A) Verschillende bronnen en verschillende soorten endotheelcellen werden geïsoleerd en gekweekt voor gebruik in een microfluïdisch stroomkanaal voor perfusieexperimenten. Representatieve brightfield beelden van verschillende soorten endotheelcellen. Schaalbalk = 50 μm. (B) Geïsoleerde cellen werden gekenmerkt door immunofluorescente kleuring om een endotheel fenotype te bevestigen. Schaalbalk = 50 μm.(C)Cellen kunnen worden gezaaid in commerciële stroomdia's of op maat gemaakte microfluïde kanalen. (D) Representatieve brightfield beelden van HUVEC gegroeid in verschillende kanaal geometrieën. Schaalbalk = 50 μm. (E) Experimentele opstelling van bloedperfusie-experimenten. Citrated bloed werd verzameld, verdund met zoutbuffer, en geperfundeerd over endotheliale cellen met een spuitpomp. De long- en navelstreng in dit cijfer werden gewijzigd van Servier Medical Art, gelicentieerd onder een Creative Common Attribution 3.0 Generieke Licentie. http://smart.servier.com/ Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Figuur 2: Beeldacquisitie en kwantificering van trombusvorming. (A) Representatieve time-lapse beeldvorming van aangehangen Calcein AM-Red gelabelde bloedplaatjes en gedeponeerd Alexa488-geconjugeerde fibrine op 1, 3 en 5 min na gehele bloedperfusie over niet-gestimuleerde PAECs(B)en over histamine gestimuleerd PAECs. (C) Representatieve time-lapse beelden van bloedplaatjes adhesie en fibrin depositie op 1, 3 en 5 min perfusie met volbloed geïncubeerd met dabigatran perfused over histamine-gestimuleerde PAECs. Schaalbalk = 50 μm.(D)Schematisch overzicht van beeldkwantificering in ImageJ. (E) Kwantificering van bloedplaatjes adhesie en fibrin afzetting voor elke 30 s op een niet-gestimuleerd en histamine gestimuleerd endotheel. (F) Kwantificering van het effect van dabigatran op trombusvorming gekwantificeerd door bloedplaatjesver hechting en fibrindepositie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Figuur 3: Representatieve confocale beelden van stroomexperimenten om de vorming van trombus in bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting op endotheelcellen te karakteriseren. Endotheel cel-celcontacten werden gekenmerkt door VE-cadherine en gemeten in controle PAECs, patiënt-afgeleide CTEPH PAECs, en HUVEC. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Dit In Vitro Disease Model, kan worden gebruikt om de interactie van volbloed en patiënt afgeleide cellen, met name de endotheel, te bestuderen om trombogeniciteit en de effectiviteit van antistollingsmiddelsmiddelen te evalueren. Dit is endotheel cellen kunnen worden gebruikt op verschillende omstandigheden en kan worden gewijzigd door de invoering van op maat gemaakte microfluidics of door het aanpassen van de bloedstroom parameters. Bovendien kan dit model worden gebruikt om de trombusdynamiek in ontstekingsaandoeningen te bestuderen of om de effecten van antistollings- en antiplatelettherapie te beoordelen.Uiteindelijk kunnen deze benaderingen worden gebruikt in een methode van gepersonaliseerde geneeskunde. Na het verkrijgen van een chirurgische menselijke longslagader weefsel monster, jas hoge affiniteit cel binding 60 milliliter cel cultuur schotel met twee milliliter van vijf microgram per milliliter fiboronectine en incubeer de schotel op 37 graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten. Gebruik aan het einde van de incubatie steriele tang in een laminaire stroomkast onder steriele omstandigheden om het weefsel over te brengen in een petrischaaltje PBS.Als het weefsel zich nog in een ring bevindt, snijd de slagader open met een schaar, waarbij u ervoor zorgt dat de binnenste laag van het vat niet wordt aangeraakt, omdat het endotheel gemakkelijk wordt beschadigd en verwijderd. Na het verwijderen van de fibronectine, voeg vier milliliter van volledige endotheelcelmedium toe aan de schotel en gebruik tangen om het weefselmonster in het medium over te brengen, gebruik een scalpel om de binnenste laag van het vat zorgvuldig in het medium te schrapen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat lipideophopingen die in de vaatwand worden waargenomen, worden voorkomen. Nadat de cellen zijn geoogst, plaats de plaat in de celcultuur incubator.Als fibroblasten de cultuur besmetten, gebruik dan magnetische affiniteit celscheiding voor een CD144, volgens de instructies van de fabrikant om de cellen te zuiveren. Over het algemeen wordt cultuur gedefinieerd als zuiver, wanneer stromingscytometrie 10% of minder vervuilende cellen detecteert. Wanneer het voldoende aantal endotheelcellen is verkregen voor experimenteel gebruik, kunnen de primaire endotheelcellen worden gekarakteriseerd voor de aanwezigheid van endotheelcelspecifieke markers en voor de afwezigheid van gladde spier- en epitheliale celmarkers.Voor de voorbereiding van de stroomkamer, code één kanaal van een zesputige stroomdia met 30 microliters van 0.1%gelatine en incubeer deze dia minstens 15 minuten bij 37 graden Van Celsius. Naast commerciële stroomkamers kunnen op maat gemaakte flowkamers met specifieke afmetingen worden gebruikt om de invloed van de vasculaire geometrie op de stolseldynamiek te bestuderen. Terwijl de dia is incubatie, verzamel de cellen van een confluent longslagader endotheelcelcultuur met EDTA en trypsine en sediment dat cellen door centrifugatie, opnieuw zweven de pellet in 600 microliter van volledige endotheelcel medium en krachtig maar voorzichtig, voeg 100 microliter cellen in elk kanaal, voeg een extra 50 microliter van volledige endothelial cell medium aan het kanaal , om voldoende medium te bieden voor nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide, verander het medium de volgende dag om de niet-gebonden cellen weg te wassen.Na zes dagen in cultuur, moeten de cellen een stabiele confluent monolayer hebben gevormd. Op dag zeven van longslagader endotheelcelcultuur, verwerven van een veneuze bloedmonsters van onderwerpen die geen behandeling tegen stolling ontvangen in 109 mononatrium citraat antistollingsmiddel buizen en breng het bloed in een 50 milliliter buis. Bloed kan virussen en andere besmettelijke stoffen bevatten.Daarom is het belangrijk om altijd handschoenen te dragen en de veiligheidsrichtlijnen te volgen voor het werken met menselijk materiaal. Fluorescerend gelabeld de bloedcellen met 1 tot 10,000 concentratie van Calcein AM Red en 50 microgram per milliliter en voeg Alexa 488 fibrinogen, dan incubeer het bloed op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten om volledige absorptie mogelijk te maken. Behandel 30 minuten voor de perfusie de longslagader endotheelcellen met 100 microliter van één micromolar histamine in endotheelcelmedium en 1%foetaal runderserum zonder andere toevoegingen.En gebruik een 20 milliliter spuit gevuld met wasbuffer om de stroom systeem buizen spoelen, laden een derde tot 20 milliliter spuit met twee milliliter wasbuffer en laad de spuit op een spuitpomp. Gebruik een tweede spuit van 20 milliliter om de stroombuizen te vullen met hippies plus buffer met 1%bovine serum albumine en gebruik een elleboogvorm Laura-connector om de buizen zorgvuldig aan te sluiten op de microschuif, sluit de uitlaat van de glijbaan aan op de spuit, herstel van microscopie door de cel met dia op het podium te plaatsen en de setup voor het experiment samen te stellen voor het experiment , pas de microscoop aan en stel de parameters voor beeldvorming in. Herkalking van nadrukkelijk bloed.En dit is een gelukkige co-sponsor van stolling, bovendien proberen om de vorming van luchtbellen te voorkomen, omdat dit zal beschadigen endotheel cel laag en invloed op uw resultaten. Verdun het bloed vlak voor de perfusie twee keer met recalcificatiebuffer en plaats de inlaatbuis van de microglijbaan in de buis van bloed, druk op de spuitpomp. Zodra het bloed over het endotheel begint te stromen, drukt u op de microscoop om beelden te verkrijgen met behulp van de vooraf geselecteerde actieve kanalen en interessegebieden, elke 15 seconden gedurende vijf minuten.Aan het einde van de analyse, stop de opname en de spuit pomp en goed opruimen. Etikettering van bloedplaatjes met Calcein AM Red en de toevoeging van Alexa 488 geconjugeerde fibrinogen, maakt het onderzoek van trombusvorming door bloedplaatjesver hechting en vezels en afzetting mogelijk. Onder niet-gestimuleerde omstandigheden is er geen binding van bloedplaatjes of fibrine aan het endotheel.Stimulatie met histamine resulteert in een onmiddellijke toename van de bloedplaatjesver hechting, die een plateau bereikt na 2,5 minuten, op dit moment beginnen de bloedplaatjes autocrinefactoren af te scheiden die een bloedplaatjesaggregatie en fibrinogen decolleté tot fibrine veroorzaken, wat resulteert in vezels en afzetting op drie minuten en de vorming van een stabiel aggregaat met de bloedplaatjes na vier minuten. Behandeling met een direct antistollingsmiddel remt zowel stolselvorming als bloedplaatjes in vergelijking met onbehandeld bloed. Immunofluorescente analyse van longslagader endotheelcelplaatjes interacties na vijf minuten van perfusie, onthult het onderhoud van de endotheelcel, celcontacten, zoals bevestigd door vasculaire endotheel cadherin vlekken, wat aangeeft dat de bloedstolsels vormen op endotheel model lagen in plaats van op de onderliggende matrix tussen endotheel hiaten.menselijke navelstreng endoek endothelial cellen tonen minder bloedplaatjes adhesie en fibrin afzetting in vergelijking met longslagader endotheel. Met name zieke primaire longslagader endotheelcellen van chronische trombo-embolische hypotheekpatiënten vertonen een verhoogde bloedplaatjesver hechting en meer fibrinafzetting in vergelijking met gezonde cellen. Trombogeniciteit van het endotheel is afhankelijk van meerdere factoren, zoals de oorsprong van het vaatbed of de delen van de biologische achtergrond.Met behulp van dit protocol kunnen intrinsieke disfuncties in vasculaire en bloedbestanddelen, evenals de effectiviteit van anti gestolde therapie worden getest tijdens verschillende fasen van trombosehemostase. Dit protocol kan worden gebruikt voor het begrijpen van bloed en Theo-interacties, in verschillende trombo-embolische ziekten met het uiteindelijke potentieel om patiëntspecifieke reacties op antistollingstherapie te voorspellen.

in-vitro-microfluidic-disease-model-to-study-whole-blood-endothelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

De toegankelijkheid van betrouwbare modellen om vasculaire bloedinteracties bij mensen te onderzoeken ontbreekt. We presenteren een in vitro model van gekweekte primaire humane endotheelcellen gecombineerd met menselijk volbloed om cellulaire interacties zowel in het bloed (ELISA) als in het vasculaire compartiment (microscopie) te onderzoeken.

A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

Hier gepresenteerd is een protocol voor een gestandaardiseerd in vitro hemodynamic loop model. Dit model maakt het mogelijk om de hemocompatibiliteit van perfusiebuizen of vasculaire stents te testen in overeenstemming met ISO (International Organization for Standardization) norm 10993-4.

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

In-vitro trombolyse-assays hebben vaak moeite om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, of het nu gaat om de modeltrombus die wordt verteerd of in de omgeving waarin trombolyse plaatsvindt. Hierin onderzoeken we hoe de koppeling van de Chandler-lus en Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) wordt gebruikt voor high-fidelity, ex-vivo, stolsellysisbewaking.

Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Hier presenteren we een protocol om een microfluïdisch systeem te fabriceren en te bedienen dat endotheelcellen blootstelt aan gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulserende schuifspanning. Deze benadering biedt een fysiologisch relevant in vitro model voor het bestuderen van diabetische endotheeldysfunctie. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van oxidatieve stress en endotheelcelresponsen mogelijk.

Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie

Leer een microfluïdische in vitro-ziekte­model om bloed-endotheel­interacties en trombusdynamiek in real-time te bestuderen. Dit model evalueert trombogeniteit en anticoagulantia-effectiviteit.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Meer video's verkennen