Name: Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor isolatie, transfectie en lange termijn cultuur van volwassen muis- en ratcardiomyocyten. Deze methode maakt overleving mogelijk van meer dan 20 dagen met hoge transfectie-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door financiering van het Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, College of Medicine, aan Dr. Onur Kanisicak; een subsidie van de National Institutes of Health (R01HL148598) aan Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wordt ondersteund door de American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam wordt ondersteund door de Postdoctorale subsidie van de American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey wordt ondersteund door een NIH T32-subsidie (HL 125204-06A1).

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door het Amerikaanse National Institute of Health (NIH). Alle protocollen weergegeven in de video werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati, College of Medicine.
1. Voorbereiding vóór hartextractie van volwassen muizen (en ratten)
<ol><li>Bereid de overeenkomstige perfusie-, enzym- en stopoplossingen volgens de recepten in tabel 1 en tabel 2voor respectievelijk ratten- en muizenisolement. Filtreer de oplossingen door een filter van 0,22 μm om verontreinigingen of onopgeloste deeltjes te verwijderen.</li>
	<li>Reinig en steriliseer de chirurgische instrumenten door ze 15 minuten in 70% alcohol te weken en vervolgens te wassen met dubbel gedestilleerd water. Laat het gereedschap drogen op een schone papieren handdoek.</li>
	<li>Verwarm het waterbad voor op 37 ºC. Controleer het waterpeil in het waterbad om tijdens de procedure een ononderbroken circulatie van warm water door het perfusieapparaat te garanderen.</li>
	<li>Reinig het perfusieapparaat door 5 min. OPMERKING: Verhoog de stroomsnelheid, wat helpt om de slang schoon te maken.</li>
	<li>Na de alcohol flowthrough, reinig de resten van alcohol door het uitvoeren van dubbele gedestilleerd water gedurende 10 min.</li>
	<li>Stel 3 middelgrote wegwerp polystyreen weegschotels op om het hart schoon te maken na excisie. Vul de gerechten met 20 mL myocyte buffer.</li>
	<li>Voeg 2-3 druppels heparine toe aan elke schotel met behulp van Pasteur pipet en meng goed door meerdere keren te pipetten.</li>
	<li>Neem een spuit van 10 mL met een stompe naald canule. LET OP: Een stompe naald canule kan worden bereid door het snijden van de punt van een schone, steriele naald. Een 21 G naald en 14 G naald werden gebruikt om de canule voor de muis en rat te maken, respectievelijk.</li>
	<li>Vul de spuit met perfusiebuffer(tabel 1). Verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit en plaats deze in de derde schotel in een schuine positie. Beveilig het met tape. OPMERKING: Voor ratten werd oplossing A(tabel 2)gebruikt in plaats van myocyte perfusiebuffer.</li>
	<li>Bereid een losse knoop met een chirurgische hechting en plaats het rond de naald.</li>
	<li>Injecteer de muis met heparine (100 USP-eenheden/muis) door intraperitoneale injectie, 20 min voor de anesthesie-injectie.</li>
	<li>Circuleert de myocyte perfusiebuffer(tabel 1)door het perfusieapparaat. Verlaag de debiet tot 3 mL/min. OPMERKING: Voor ratten werd oplossing A(tabel 2)gebruikt in plaats van myocyte perfusiebuffer.</li>
	<li>Vervang na 5 min de perfusiebuffer door de enzymoplossing(tabel 1). Verzadig de enzymoplossing met zuurstof tijdens het proces. Gebruik een stroomsnelheid van 3 mL/min. OPMERKING: Gebruik voor de isolatie van rat CM in plaats daarvan oplossing E (Tabel 2).</li>
	<li>Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van anesthesie. Gebruik de juiste dosis anesthesie, aanbevolen door IACUC, voor de terminale operatie.</li>
	<li>Bevestig voldoende diepte van anesthesie door het ontbreken van een reactie op een teensnuifje. Zet vervolgens de muis op het chirurgische platform.</li>
</ol>2. Extractie van hart van volwassen muizen (en ratten)
<ol><li>Steriliseren van de huid door af te vegen met 70% alcohol.</li>
	<li>Open voorzichtig de borst.</li>
	<li>Accijns het hart. Vermijd niet-hartweefsels tijdens excisie.</li>
	<li>Leg het hart op de eerste schotel, gevuld met perfusiebuffer(Tabel 1). LET OP: Gebruik oplossing A voor de rat(tabel 2).</li>
	<li>Maak het bloed uit het hart door zachtjes te knijpen.</li>
	<li>Breng het hart naar het tweede gerecht.</li>
	<li>Reinig het bloed uit het hart en verwijder niet-cardiale weefsels. Breng vervolgens het hart over naar het derde gerecht.</li>
	<li>Knip longen en ander omringend weefsel af en kanule via de opgaande aorta. Deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd (<5 min) om de kwaliteit en kwantiteit van CM te verbeteren.</li>
</ol>3. Vertering van het hart
<ol><li>Spijsvertering van het muishart OPMERKING: Alle oplossingen/buffers die door het muizenhart circuleren, moeten tijdens de procedure worden zuurstofrijk.<ol>
<li>Verwijder de afzuignaald voorzichtig uit de spuit en sluit deze aan op het Langendorff perfusieapparaat.</li>
		<li>Vermijd luchtbellen die in het hart gaan, wat de doorstroom van de enzymoplossing en de spijsvertering kan beïnvloeden.</li>
		<li>Verplaats de waterjas omhoog om een homogene omgeving aan het hart te bieden. Laat de enzymoplossing met een snelheid van 2-3 mL/min door het hart stromen. OPMERKING: De snelheid van de passerende oplossing is van cruciaal belang en heeft een aanzienlijke impact op de uitkomst van CM kwantiteit en kwaliteit.</li>
		<li>Laat de enzymoplossing 2 min door het hart stromen.</li>
		<li>Voeg op 2 min 40 μL van 100 μM CaCl2-oplossing toe aan de enzymoplossing en meng. Laat de enzymoplossing nog 10-15 minuten door het hart gaan. OPMERKING: Zodra de stroom glad wordt, wordt het hart bruinachtig en zacht, wat de gelijkmatige verdeling van het collagenase-enzym en de juiste vertering van het hart aangeeft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spijsvertering van het rattenhart OPMERKING: Alle oplossingen/buffers die door het rattenhart circuleren, moeten tijdens de procedure worden zuurstofrijk.<ol>
<li>Verwijder de afzuignaald voorzichtig uit de spuit en sluit deze aan op het Langendorff perfusieapparaat.</li>
		<li>Vermijd luchtbellen die in het hart gaan, wat de doorstroom van de enzymoplossing en de spijsvertering kan beïnvloeden.</li>
		<li>Verplaats de waterjas omhoog om een homogene omgeving aan het hart te bieden.</li>
		<li>Start de stroom van oplossing A met een snelheid van 2-3 mL/min gedurende 3-5 min om bloed uit het hart te verwijderen. OPMERKING: De snelheid van de passerende oplossing is van cruciaal belang en heeft een aanzienlijke impact op de uitkomst van CM-kwaliteit.</li>
		<li>Zodra het bloed uit het hart is gewist, schakelt u over van oplossing A naar oplossing E(tabel 2). Titreeroplossing E met CaCl2 zoals hieronder aangegeven voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM in oplossing:<ol>
<li>Voeg na 10 min perfusie 12,5 μL 0,1 M CaCl2toe.</li>
			<li>Voeg na 15 min perfusie 25 μL van 0,1 M CaCl2toe.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laat de enzymoplossing nog 30-40 minuten door het hart gaan, totdat de stroom snel wordt en het hart buigzaam is.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Voorbereiding van CM-eencellige suspensie
<ol><li>Voorbereiding van de CM eencellige suspensie (muis)<ol>
<li>Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het naar een petrischaal van 60 mm gevuld met 5 mL enzymoplossing en breng de schotel over op een bioveiligheidskap. OPMERKING: Zorg voor voldoende hartvertering voordat u het hart uit het Langendorff perfusiesysteem verwijdert. De spijsverteringstijd is afhankelijk van de enzymactiviteit, de stroom van oplossing en de grootte van het hart.</li>
		<li>Voer verdere mechanische disaggregatie uit in een bioveiligheidskap om steriliteit te garanderen en besmetting te voorkomen.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de atria (1/4e van het basale hartgedeelte) en extra vetweefsel.</li>
		<li>Hak het hart met tangen in fijne stukken.</li>
		<li>Neem een steriele Pasteur pipet en snijd de punt in een hoek van 45º.</li>
		<li>Gebruik deze Pasteur pipet om het hartweefsel in een eencellige suspensie af te geven door zachte pipetting. Optimale spijsvertering zorgt voor een opschorting van eencellige cardiomyocyten. LET OP: Verwijder het smalle, onderste gedeelte van de transferpipet om CM-schade als gevolg van mechanische schroeien te verminderen.</li>
		<li>Voeg vervolgens 5 mL stopoplossing toe om de enzymactiviteit te stoppen, waardoor de mogelijkheid van overdigestie wordt vermeden.</li>
		<li>Neem een verse conische 50 mL conisch en plaats een steriele 100 μm cel zeef op.</li>
		<li>Geef de cardiomyocyte suspensie door de celzeef om het weefselbrok te verwijderen. Was de petrischaal en zeef met nog eens 5 mL stopoplossing(Tabel 1) om cardiomyocyten te verzamelen die aan de zeef blijven zitten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de CM eencellige suspensie (rat)<ol>
<li>Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het hart naar een 100 mm petrischaal gevuld met 5 mL oplossing A en verplaats de schotel naar een bioveiligheidskap. OPMERKING: Zorg voor voldoende hartvertering voordat u het hart uit het Langendorff perfusiesysteem verwijdert. De spijsvertering tijd hangt af van de enzymactiviteit, de stroom van de oplossing, en de grootte van het hart.</li>
		<li>Voer verdere mechanische disaggregatie uit in een bioveiligheidskap om steriliteit te garanderen en besmetting te voorkomen.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de atria (1/4e van het basale hartgedeelte) en extra vetweefsel.</li>
		<li>Hak het hart met tangen in fijne stukken.</li>
		<li>Neem een steriele Pasteur pipet en snijd de punt in een hoek van 45º.</li>
		<li>Gebruik deze Pasteur pipet om het hartweefsel in eencellige suspensie af te geven door zachte pipetting. Optimale spijsvertering zorgt voor een opschorting van eencellige cardiomyocyten. LET OP: Verwijder het smalle, onderste gedeelte van de transferpipet om CM-schade als gevolg van mechanische schroeien te verminderen.</li>
		<li>Voeg 5 mL oplossing B(tabel 2) toe aan de CM-suspensie en geef de oplossing door een celzeef van 100 μm om de resterende stukken vet of ander niet-verteerd weefsel te verwijderen.</li>
		<li>Verzamel filtraat in een verse 50 mL conische flacon.</li>
		<li>Gebruik nog eens 5 mL oplossing B om de petrischaal en eventuele resterende CM door de celzeef te wassen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Verwijdering van niet-CM's
<ol><li>Verwijdering van niet-CMs uit de schorsing voor één cel voor volwassenen (muis)<ol>
<li>Centrifuge de celsuspensie op 20 x g gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en plaats de cellen opnieuw in 10 mL stopoplossing(tabel 1). OPMERKING: Het verhogen van de concentratie van BSA in de stopoplossing zal de viscositeit verhogen en de sedimentatiesnelheid van niet-CMs verminderen.</li>
		<li>Resuspend de CMs door zachte inversie van de buis 3-5 keer.</li>
		<li>Voeg met intervallen van 3 minuten 10 μL van 100 μM CaCl2-oplossing toe en meng. Herhaal het driemaal.</li>
		<li>Na de vierde toevoeging, centrifugeren de cardiomyocyte suspensie op 20 x g gedurende 3 min.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Resuspend CMs in voorverwarmde (37 ºC), volwassen muis CM plating media (Tabel 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijdering van niet-CMs uit de volwassen eencellige suspensies (rat)<ol>
<li>Pelletcellen op 20 x g gedurende 3 minuten bij 25 ºC.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 25 mL oplossing B (tabel 2).</li>
		<li>Meng de cellen door zachte inversie en plaats het in een buisstandaard om de CM toe te staan om zich onder ernst te regelen.</li>
		<li>Gooi de supernatant voorzichtig weg.</li>
		<li>Resuspend de cellen in verse 25 mL van oplossing B en titreren tot 1,0 mM CaCl2 door stapsgewijze toevoeging van 50 μL, 75 μL, en 100 μL van 0,1 M CaCl2 op 3-5 min intervallen. OPMERKING: Een hogere concentratie BSA in oplossing B kan bij deze stap worden gebruikt. Het verhogen van de concentratie van BSA in oplossing B verhoogt de viscositeit en vermindert zo de sedimentatiesnelheid van niet-CMs.</li>
		<li>Pelletcellen op 20 x g gedurende 3 minuten bij 25 ºC, het supernatant aanzuigen en het gewenste volume van volwassen rattencelkweekmedia toevoegen (tabel 4).</li>
		<li>Zaad CMs op een laminine gecoate plaat. OPMERKING: Pre-plating van CMs op een niet-gecoate kweekplaat kan worden gebruikt om de verontreiniging van niet-CM-cellen te minimaliseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Volwassen CM-beplating
<ol><li>Voorbeplating<ol>
<li>Resuspend de cardiomyocyten in cultuurmedia.</li>
		<li>Pre-plate de cellen in een 60 mm of 100 mm schotel voor muis of rat CM, respectievelijk.</li>
		<li>Incubeer CMs voor 2 uur in een couveuse aangevuld met 5% CO2 bij 37 ºC.</li>
		<li>Tijdens de pre-plate incubatie, coat de celkweekplaten met laminine (10 μg/mL in PBS) voor de lange termijn CM cultuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na 2 uur pre-plating, verzamelen CMs in een 50 mL conische flacon.</li>
	<li>Verzamel de cellen uit de schotel en re-plate ze in een laminine gecoate 24 goed cultuur plaat voor transfectie experimenten.</li>
	<li>Kweekcellen in een couveuse op 37 ºC aangevuld met 5% met CO2. 4-6 uur is voldoende om zich aan de cardiomyocyten te hechten aan het oppervlak, en dus kan transfectie 6 uur na het beplating worden uitgevoerd. OPMERKING: Het beplatingsmedium met FBS wordt vaak gebruikt en vertoont een betere compatibiliteit met proliferatiestudies. Een serumvrij medium kan echter worden gebruikt voor experimenten waarbij secretoire factoren worden geanalyseerd.</li>
</ol>7. Transfection
<ol><li>Broed de CMs aan de celcultuurplaten die 4-6 uur met laminine zijn bekleed.</li>
	<li>Vier uur na cm zaaien op de laminine gecoate plaat, transfecte cellen met siRNAs (50 nM) van belang met behulp van een transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine RNAiMAX) volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Verander media 24 uur na transfectie en elke 24 uur daarna gedurende maximaal 20 dagen.</li>
	<li>Na 20 dagen fix cellen met 4% PFA in PBS voor downstream toepassingen, met inbegrip van immunocytochemie voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin om ervoor te zorgen live cardiomyocyten werden met succes gekweekt op lange termijn.</li>
</ol>

<ol><li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li>
<li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748(2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li>
<li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289(2013).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+ischemic+heart+disease%3A+novel+carriers+for+bioinformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451(2019).</li>
<li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases%3A+Beneficial+or+Detrimental%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058(2018).</li>
<li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li>
<li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089(2019).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-210-mediated+proliferation%2C+survival%2C+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634(2017).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357(2014).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li>
<li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li>
<li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+2%2C3-butanedione+monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li>
</ol>

Er is een kritische behoefte om een protocol voor volwassen cardiomyocyten isolatie en cultuur op lange termijn vast te stellen om celspecifieke mechanistische studies uit te voeren. Er zijn slechts een paar rapporten over volwassen CM isolatie protocollen, en nog minder van hen worden gebruikt voor de lange termijn cultuur van volwassen muizen CM15,16,17. Aangetoond wordt dat de volwassen rat CM een hogere tolerantie heeft voor...

Hartziekten zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Bijna alle vormen van hartletsel resulteren in een aanzienlijk verlies van volwassen cardiomyocyten (CMs). Volwassen zoogdier harten zijn niet in staat om hun hartletsel te herstellen als gevolg van de senescente aard van de volwassen CM1. Dus, elke belediging van de volwassen zoogdierhart resulteert in een permanent verlies van CMs, wat leidt tot verminderde hartfunctie en hartfalen. In tegenstelling tot volwassen zoogdieren kunnen kleine dieren zoals zebravissen en nieuwe harten hun hartletsel regenereren door bestaande CM proliferatie2,3,4. Een wereldwijde inspanning is aan de gang om een nieuwe therapeutische interventie voor hartletsel te vinden via zowel proliferative en niet-proliferative benaderingen. In de afgelopen decennia zijn verschillende soorten genetische muismodellen ontwikkeld om hartletsel en reparatie te bestuderen. Het gebruik van in vivo diermodellen blijft echter een dure benadering met de extra complexiteit om een celautonoom mechanisme te ontcijferen aan secundaire effecten. Bovendien zijn in vivo systemen een uitdaging om CM-specifieke effecten van een farmacologische interventie te analyseren die cardioprotectieve signalering van de CM induceert.
Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk om CM-proliferatieanalyses uit te voeren. CM proliferatie testen vereisen een minimum van 4-5 dagen voor cellen worden geïnduceerd in de celcyclus en om nauwkeurige gegevens te verkrijgen na dat. Bovendien, studies die gebruik maken van geïsoleerde CMs voor elektrofysiologische studies, drug screening, toxiciteit studies, en Ca++ homeostase studies zijn allemaal behoefte aan een verbeterde cultuur systeem5,6,7. Bovendien tonen recente studies de cardioprotectieve betekenis aan van cytokinen die zijn afgescheiden van CMs (cardiokines)8,9. Om de therapeutische rol en het moleculaire mechanisme van deze cardiokines tijdens hartreparatie en regeneratie te onderzoeken, is een langdurige cultuur vereist.
Volwassen rat-CMs zijn robuust genoeg voor eencellige isolatie en cultuur op lange termijn in een in vitrosysteem10,11,12. Echter, volwassen muis CMs zijn van groot belang voor in vitro testen, als gevolg van de beschikbaarheid van een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde muis modellen, die het mogelijk maakt voor het ontwerp en de uitvoering van verschillende innovatieve analyses die niet mogelijk zijn met rat CM13. In tegenstelling tot volwassen rat CM isolatie, is het heel uitdagend om een eencellige suspensie te verkrijgen van volwassen muis harten, en de lange termijn cultuur van volwassen muis CMs in de cultuur is nog uitdagender.
Volwassen CM isolatie van muis- en rattenharten met behulp van een Langendorff-systeem is eerder opgezet om CM-functie5,14,,15te bestuderen . Hier hebben we in detail de protocollen beschreven voor volwassen CM-isolatie van zowel ratten als muizen, evenals een gewijzigde langetermijncultuur, transfectie en CM-proliferatie van geïsoleerde cellen.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butane Dione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Disposable polystyrene weighing dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fine Point High Precision Forceps</td><td>Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td><td>Fisherbrand</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo cultuur van de volwassen zoogdier cardiomyocyten (CMs) presenteert de meest relevante experimentele systeem voor de in vitro studie van cardiale biologie. Volwassen zoogdier-CMs zijn terminaal gedifferentieerde cellen met een minimale proliferative capaciteit. De post-mitotische toestand van volwassen CMs beperkt niet alleen cardiomyocyte celcyclusprogressie, maar beperkt ook de efficiënte cultuur van CMs. Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk voor veel studies, zoals CM-proliferatie en analyse van genexpressie.
De muis en de rat zijn de twee meest geprefereerde proefdieren die worden gebruikt voor cardiomyocyte isolatie. Hoewel de langetermijncultuur van ratten-OEM's mogelijk is, zijn volwassen muis-OEM's gevoelig voor de dood en kunnen ze niet langer dan vijf dagen onder normale omstandigheden worden gekweekt. Daarom is er een kritische behoefte om de celisolatie en het langetermijncultuurprotocol voor volwassen murine-OEM's te optimaliseren. Met dit gewijzigde protocol is het mogelijk om zowel volwassen muis- als ratten-OEM's gedurende meer dan 20 dagen succesvol te isoleren en te verlenen. Bovendien is de siRNA transfectie-efficiëntie van geïsoleerde CM aanzienlijk toegenomen in vergelijking met eerdere rapporten. Voor de CM-isolatie van de volwassen muis wordt de Langendorff-perfusiemethode gebruikt met een optimale enzymoplossing en voldoende tijd voor volledige extracellulaire matrixdissociatie. Om zuivere ventriculaire CMs te verkrijgen, werden beide atria ontleed en weggegooid alvorens verder te gaan met de dissociatie en beplating. Cellen werden verspreid op een laminine gecoate plaat, die het mogelijk gemaakt voor een efficiënte en snelle bevestiging. CMs mochten genoegen nemen met 4-6 uur voor siRNA transfectie. Cultuur media werd vernieuwd om de 24 uur voor 20 dagen, en vervolgens, CMs werden vastgesteld en gekleurd voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin en markers van celcyclus zoals KI67.

Het huidige gewijzigde protocol maakt efficiënte isolatie en cultuur van rat en muizen CMs in vitro mogelijk. Voor rat CM isolatie, een totaal van 3 volwassen (12 weken oude) mannelijke Fischer 344 ratten werden gebruikt in de procedure. Figuur 1 toont de chirurgische apparatuur en isolatieopstellingen die nodig zijn in de procedure; elk deel is gemarkeerd en beschreven in de figuurlegende. Collagenase type 2 werd gebruikt voor de spijsvertering, die een hoge hoeveelheid hoge kwaliteit CMs l...

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Het doel van deze video is om een gestandaardiseerd protocol aan te tonen voor volwassen cardiomyocyten isolatie, cultuur op lange termijn en transfectie. Het isoleren en culteren van cardiomyocyten van muis of rat blijft een essentiële methode om de cel autonome biologie van cardiomyocyten binnen het gezonde en ziektehart te onderzoeken. Er zijn verschillende vragen die we kunnen beantwoorden met behulp van geïsoleerde cardiomyocyten.Zoals het proliferative potentieel. Er zijn genexpressie veranderingen of specifieke cytokine uitdrukkingen bij letselrespons. Helaas, muis cardiomyocyten niet overleven afgelopen een week in normale cultuuromstandigheden.Daarom beschrijven we in deze video een geoptimaliseerde methode om cardiomyocyten van volwassen muizen te isoleren, ze te transfixeren en te kweekten tot ver na 21 dagen, deze techniek is in eerste instantie moeilijk onder de knie te krijgen. Maar met de praktijk kan men bereiken ongeveer 80 tot 90% overleven in cardiomyocyten na isolatie en ongeveer een 100 procent transfectie efficiëntie. En de meeste van deze cardiomyocyten in de juiste omstandigheden kunnen overleven afgelopen 20 dagen.Reinig en steriliseer uw chirurgische instr

isolation-transfection-long-term-culture-adult-mouse-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en de teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC). Geïsoleerde ARVC kan worden gebruikt voor de teelt van korte en lange termijn. De isolatie en de teelt van ARVC kunnen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van nieuwe behandeling regimes voor hartziekten.

Isolatie en teelt van volwassen ratten Cardiomyocytes

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Leer een geoptimaliseerd protocol voor isolatie, transfectie en lange termijn cultuur van volwassen muis- en ratcardiomyocyten. Deze methode maakt overleving mogelijk van meer dan 20 dagen met hoge transfectie-efficiëntie.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Meer video's verkennen