Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van botcellen binnen een aanpasbaar lab-on-a-chip platform. Deze technieken kunnen worden gebruikt om ons begrip van de mechanismen die mechanisch geïnduceerde bot remodelleren regelen. Ons systeem maakt het mogelijk om op lange termijn botcellen te kweken, wat directe kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk maakt in reactie op veranderde mechanische belastingomgevingen.

Het gebruik van deze fundamentele technieken kan leiden tot ontdekkingen die zich uitstrekken tot een aantal botgerelateerde problemen zoals osteoporose, fractuurgenezing en periprosthetische osteolyse. Om de put- en microkanaallaag te maken, combineert u het PDMS prepolymeer en het uithardingsmiddel bij een verhouding van 10 tegen één in een plastic beker en meng het het polymeer vervolgens gedurende 30 minuten. Giet het mengsel langzaam over het juiste voorgekileerde masker.

Laat het zitten voor 30 minuten en bak het op 45 graden Celsius voor 18 uur. Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en pel het voorzichtig van het masker, knip vervolgens individuele chips uit met een scalpel en een 3D-geprinte sjabloon en maak ze schoon met verpakkingstape. Als u de PDMS-membraanlaag wilt maken, herhaalt u de vorige stappen voor het mengen, gieten en bakken van de PDMS.

Verwijder het PDMS-vel uit de egalingsdoos en snijd afzonderlijke membranen die overeenkomen met de afmetingen van de put- en microkanaallaag. Gebruik remklauwen om de membraandikte in het midden te meten en verwijder alle membranen die buiten de gewenste dikte vallen, maak de membranen voorzichtig schoon met verpakkingstape en leg ze op een stuk paraffinefilm. Als u de PDMS-deksellaag wilt maken, herhaalt u de vorige stappen voor het mengen, gieten en bakken van de PDMS.

Na het snijden van individuele deksels op maat, punch toegang gaten door de PDMS met een een millimeter biopsie punch en vervolgens oppervlak schoon te maken met verpakkingstape. Activeer de oppervlakken van de lagen een en twee met een plasmareiniger gedurende 30 seconden op een medium radiofrequentiekrachtinstelling, lijn vervolgens de toegangsgaten in laag één uit met de microkanalen in laag twee en druk de twee lagen stevig tegen elkaar. Voor het diepe ontwerp, herhaal dit proces met lagen twee en drie met behulp van dubbelzijdige tape om de paraffine film van laag drie hechten aan een vlakke ondergrond tijdens plasmabehandeling.

Snijd overtollig materiaal van het PDMS-membraan af en pel voorzichtig het blad paraffinefilm van de onderkant van de chip. Bak de chip op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten om de bindingssterkte tussen de PDMS-lagen te verhogen, plaats vervolgens hoekafgiftepunten in de toegangsgaten in het deksel en bevestig ze met een tweedelige epoxy met behulp van een micropipet-tip om de epoxy rond elke tip aan te brengen. Nadat de epoxy volledig is uitgehard, reinig het oppervlak de chip met 70% ethanol en breng deze over naar een bioveiligheidskast.

Sluit een spuit van vijf milliliter aan op de afsnijtips met steriele siliconen buizen en vul de hele chip met 70% ethanol gedurende ten minste 30 seconden. Haal de ethanol uit de chip en steriliseer deze 's nachts met UV-licht. Op de volgende dag, was de chip drie keer met gedestilleerd water, vul het met water, en verwijder de slang uit de dispensing tips.

Incubeer de chip voor ten minste 48 uur op 37 graden Celsius. Plaats een compressieveer rond de as van de platen en plaats deze in het centrale gat aan de onderkant van de basis en bevestig het draaiblok vervolgens aan de onderkant van de basis met vier zelftappende schroeven. Plaats een tweede compressieveer rond de centrale schroef.

Steek de schroef in het zeshoekige gat in de onderkant van de wijzerplaat en schroef de montage in het schroefdraadgat in het midden van het wijzerplaatblok. Schroef vier man-vrouw impasses in de bodem van de basis. Verwijder speling van het apparaat door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de bovenkant van de platen zich onder de bovenkant van de basis bevindt en draai de wijzerplaat langzaam met de klok mee totdat de bovenkant van de platen vlak is met de bovenkant van de basis.

Gebruik een vijf milliliter spuit om het water te verwijderen uit de deep-well chip en de vacht van de bodem van de put met 200 microliter van type I collageen in azijnzuur voor een uur. Spoel de chip drie keer af met DPBS met calcium en magnesium en plaats deze in de chiphouder. Zaad de chip met MLO-Y4 osteocyten in MEM alfa medium aangevuld met kalf serum, FBS, en penicilline / streptomycine.

Verwijder de slang uit de afgiftetips, plaats de chip in een diep-goed cultuur schotel, en broeden de cellen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide voor 72 uur. Na de incubatie, bevestig steriele buizen aan het verstrekken van tips en gebruik een vijf milliliter spuit om de gebruikte cultuur medium te verwijderen uit de chip, dan langzaam vullen de chip met vers medium. Plaats de spaanhouder in het rechthoekige inzet aan de bovenkant van de basis van het laadapparaat, voer de slang door de sleuven op het deksel en sluit het deksel aan de basis.

Breng de belasting op de cellen aan door de wijzerplaat met de klok mee te draaien totdat de gewenste platenverplaatsing is bereikt, plaats het laadapparaat vervolgens in een lege P1000 micropipette tipbox en ontcubeer de cellen 15 minuten met de belasting. Na de incubatie, verwijder de belasting van de cellen door het draaien van de wijzerplaat tegen de klok in naar de oorspronkelijke startpositie, verwijder dan het deksel van het apparaat, plaats de chip houder in de deep-well cultuurplaat, en broeden de cellen voor een 90 minuten na belasting herstelperiode. Gebruik een spuit van vijf milliliter om het geconditioneerde medium uit de chip te verwijderen en de chip uit de chiphouder te verwijderen en gebruik vervolgens een taps toelopende spatel om de band tussen het PDMS-deksel en de putlaag te breken.

De cellen zijn nu klaar om geanalyseerd te worden. De shallow-well configuratie kan worden gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit van osteoblasten en osteoclasten. Botvorming van preosteoblasten werd gekwantificeerd met behulp van alizarin rood en von Kossa vlekken.

Bot resorptie van osteoclasten werd gekwantificeerd met behulp van toluidine blauwe vlekken en scanning elektronenmicroscopie werd gebruikt om de aanwezigheid van resorptie putten te controleren. De deep-well chip configuratie werd gebruikt om osteocyten mechanotransductie te induceren door het uitrekken van de cellen via een statische uit het vlak distension. Afbeeldingen van osteocyten gezaaid in chips tonen aan dat de 48-uurs incubatie van de chip met gedestilleerd water van cruciaal belang is voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen in typische morfologie.

Tijdens de aanvallen van het laden, osteocyten werden blootgesteld aan een stam gradiënt geïnduceerd op de PDMS membraan. De relatie tussen gemiddelde equivalente stam en platenverplaatsing voor waarden tussen één en twee millimeter werd bepaald en er werd een representatieve warmtekaart van de geïnduceerde stam gegenereerd. Na het laden werd de levensvatbaarheid van de cel geanalyseerd met lactaatdehydrogenase kleuring en de bijlage in V en dode celtest.

Lactaat dehydrogenase vlek van uitgerekte osteocyten toonde een lichtere kleuring in de buurt van de buitenste rand van de put, die overeenkomt met de locatie van hogere stamwaarden. Ons platform biedt een hoge mate van veelzijdigheid en kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan factoren te onderzoeken die botremodellering reguleren, zoals door belasting geïnduceerde mechanotransductie, ontsteking en medicijneffecten. De hier gepresenteerde technieken vormen een basis voor het ontwikkelen van een echt botorgel op een chip die ons begrip van de meercellige fijne kneepjes die de gezondheid van het bot reguleren sterk kunnen verbeteren.