Name: Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Ontdek overexpressed drivergenen in colorectale kankerstam-achtige HT29-tumorsferen met RNA-Seq en bio-informatica. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van kankerstamheid voor gerichte therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken het Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door subsidies van Chang Gung Memorial ziekenhuis (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), en Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 en MMH-106-61). Financieringsorganen hadden geen invloed op het ontwerp van de studie en het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.

1. Celkweek en tumorsfeervorming
<ol><li>Kweek HT29-cellen in een schaal van 10 cm met het gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) van Dulbecco met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine antibioticum (P/S).</li>
	<li>Kweek de cellen in een couveuse bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid onder aseptische omstandigheden, tot ze 80% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Trypsinize HT29 cellen met 1 mL van 0,25% trypsine gedurende 5 min bij 37 °C en neutraliseren bijgevolg de trypsine door 2 mL DMEM toe te voegen met 10% FBS en 1% P/S.</li>
	<li>Tel de HT29 cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Voeg 2.000 cellen/put toe aan een laag aangesloten 6 putplaten met 2 mL serumvrije DMEM met 1% P/S en aangevuld met 0,2% B27, 20 ng/mL van epidermale groeifactor (EFG), 20 ng/mL van fibroblast growth factor (bFGF), 20 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) en 20 ng/mL interleukine 6 (IL6).</li>
	<li>Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid onder aseptische omstandigheden.</li>
	<li>Voeg elke 2 dagen 0,5 mL stamcelmedium toe tot de tumorsferen minstens 7 dagen meten >100 μm in diameter.</li>
	<li>Observeer en meet de tumorsfeerdiameter met behulp van een omgekeerde microscoop met een digitaal celbeeldvormingssysteem.</li>
	<li>Wanneer de tumorsferen >100 μm in diameter bereiken, trypsinize de tumorsferen met 0.25% trypsine gedurende 5 min bij 37 °C en neutraliseer de trypsine door 2x het volume van het groeimedium toe te voegen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifuge bij 1.200 tpm gedurende 10 minuten en verwijder de supernatant.</li>
	<li>Incubeer 5 x 104 cellen met 2 μL anti-LGR5-PE en 2 μL anti-CD133-PE in 100 μL DMEM individueel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, schudden bij 200 rpm. OPMERKING: CD133 is een algemene kanker stamcel biomarker die sterk wordt uitgedrukt in HT29 cellen.</li>
	<li>Voeg 900 μL PBS toe en analyseer de LGR5- en CD133-expressie met behulp van stroomcytometrie. Een verandering in fluorescentie in het FL2-H kanaal duidt op genexpressie.</li>
</ol>2. RNA-isolatie
OPMERKING: Gebruik een commerciële kit (zie Tabel van materialen)met een snelle kolom voor RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
<ol><li>Voeg 50 μL PBS toe aan de geoogste cellen (2 x 105 cellen) en verbouw ze opnieuw met pipet.</li>
	<li>Voeg 200 μL lysebuffer toe met 2 μL bèta-mercaptoethanol (β-ME). Vortex snel en laat staan voor 5 min.</li>
	<li>Centrifuge de oplossing op 16.000 x g gedurende 10 min. Verzamel de supernatant en meng met 200 μL ethanol.</li>
	<li>Gebruik de bijgevoegde kolom om het oplosmiddel te verwijderen door middel van centrifugatie op 14.000 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Was met wasoplossing 1 en 2 om niet-RNAs volledig te verwijderen door centrifugatie op 14.000 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Centrifuge opnieuw op 14.000 x g gedurende 2 min om rest ethanol te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 50 μL gedestilleerd water toe, centrifuge bij 14.000 x g gedurende 1 min en verzamel de oplossing.</li>
	<li>Meet de RNA-concentratie met OD260 met een spectrofotometer. RNA-concentratie (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) en OD260/OD280 > 2. RNA-monsters moeten een RNA-integriteitsnummer (RIN) > 7 hebben.</li>
</ol>3. RNAseq profilering en bioinformatica analyse
OPMERKING: RNAseq-analyse werd commercieel uitgevoerd (zie Tabel van Materialen)om de differentiële genen in de HT29-afgeleide tumorsferen te onderzoeken in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen.
<ol><li>Gebruik commerciële services voor RNAseq-stappen, waaronder bibliotheekbouw, bibliotheekkwaliteitscontrole en DNA-sequencing.</li>
	<li>Het gegevensrapport moet belangrijke informatie bevatten, waaronder de leestellingen, log2-vouwwijziging en p-waarde. Selecteer de differentiële genen op basis van de volgende parameters: genen met een > 1 log2-vouwen veranderen met leestellingen >100 in de HT29-tumorsfeergroep en genen <-1 log2 fold change with read count >100 in the HT29 parental group. In dit geval werd een p-waarde < 0,05 aanvaardbaar geacht en werden de gegevens gebruikt (tabel 1). OPMERKING: Hier werd een gentelling >100 gebruikt als drempel om de studie van een bepaald gen voort te zetten en de expressie ervan te valideren.</li>
	<li>Gebruik statistische analysesoftware (zie Tabel van Materialen),om een heatmap weer te geven en overexpressed genen te identificeren >1 en gedownreguleerde genen < 1 in log2 fold change.</li>
	<li>Gebruik R-software om de Volcano Plot te tekenen met x: log2 fold change; y: -log10 (p waarde) om de differentiële genen te tonen.<ol>
<li>R-bibliotheek installeren install.packages(bibliotheek(kalibreren))</li>
		<li>Lees de gegevens in RStudio met het volgende programma: res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T) hoofd(res) met(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0")) met(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red")) met(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blue")) met(subset(res, pvalue>.05), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444")) abline(h=1.3, lty=2) abline(v=1, lty=2) abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>Voer de run uit om de Vulkaan Plot te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Driver gen selectie
<ol><li>Selecteer Single geninput in NetworkAnalyst.</li>
	<li>Kopieer en plak de geselecteerde overexpressed genen uit tabel 1 met "mens" opgegeven als het organisme en id-type Officieel gensymbool. OPMERKING: Gebruik ook Ensembl Gene ID voor kopiëren en plakken.</li>
	<li>Voeg de gegevens in door op Upload te klikken en ga verder om deze te analyseren met behulp van eiwit-eiwit interactie (PPI) na genetische PPI.</li>
	<li>Gebruik de STRING interactome database met een vertrouwensscore cutoff van 900 om de zaadgenen te laten zien die de geüploade genen kruisen. De zaadgenen die associëren met meer individuele genen werden geselecteerd als driver genen die betrokken kunnen zijn bij het handhaven van de vorming van HT29-afgeleide tumorsferen. OPMERKING: Er zijn drie interactome datasets voor gebruik: IMEx, STRING en Rolland. STRING bevat hoger vertrouwen experimenteel bewijs. Met lagere geüploade gennummers kan IMEx worden geselecteerd om de bestuurdersgenen in de interactome-netwerken te voorspellen en op te pikken.</li>
	<li>Selecteer Doorgaan in het toewijzingsoverzicht.</li>
	<li>Selecteer Wit op de achtergrond en Atlas forceren in de knop Indeling.</li>
	<li>Selecteer PANTHER BP om de upregulatiegengroep te analyseren. OPMERKING: Dit toont aan dat HSPA5 verantwoordelijk was voor anti-apoptose in de HT29-afgeleide tumorsferen in deze studie(figuur 3A). Om het specifieke functionele veld te beperken, kunnen KEGG, GO of PANTHER classificatie als alternatief worden gebruikt om de specifieke bestuurdersgenen te selecteren.</li>
</ol>

<ol><li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+colorectal+cancer%3A+incidence%2C+mortality%2C+survival%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Przegl%C4%85d+Gastroenterologiczny%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li>
<li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Intestinal+Research%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients%3A+possible+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death & Disease. 10 (7), 509(2019).</li>
<li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li>
<li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB+receptors%3A+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li>
<li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERBB+network%3A+at+last%2C+cancer+therapy+meets+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149(2017).</li>
<li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41(2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer%2C+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li>
<li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma%3A+Clinicopathological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cell-targeted+treatment%3A+elimination+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li>
<li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li>
<li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959(2019).</li>
<li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li>
<li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent%2C+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88(2011).</li>
<li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+SHP-1+agonists%2C+SC-43+and+SC-78%2C+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25(2018).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers%3A+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60(2018).</li>
<li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li>
<li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li>
<li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133%2C+CD44%2C+CD24%3A+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621(2014).</li>
<li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+for+statistical%2C+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80(2015).</li>
<li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li>
<li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li>
<li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gene+Ontology+Resource%3A+20+years+and+still+GOing+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+in+2013%3A+modeling+the+evolution+of+gene+function%2C+and+other+gene+attributes%2C+in+the+context+of+phylogenetic+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).</li>
<li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+3.0%3A+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.

In deze studie werden gekweekte kankerstamachtige tumorsferen gebruikt als model bij het analyseren van RNAseq-gegevens met beschikbare bioinformatica. Voor een ziektemodel werden HT29-afgeleide tumorsferen gebruikt. Omdat de tumorsferen resistentie tegen tumortherapieën hebben, kan het gevestigde model worden gebruikt om de gedetailleerde mechanismen van resistentie te onderzoeken door verschillen in genexpressie te onderzoeken. Bovendien biedt genomische technologie met RNAseq met beschikbare bioinformatica een snel in...

Colorectale kanker (CRC) is een belangrijke doodsoorzaak met een hoge prevalentie en sterfte wereldwijd1,2. Als gevolg van genmutaties en versterkingen groeien kankercellen zonder proliferative controle, wat bijdraagt aan celoverleving3, anti-apoptose4en kankerstamness5,6,7. Binnen een tumorweefsel, tumor heterogeniteit kan tumorcellen aan te passen en te overleven tijdens therapeutische behandelingen8. Kankerstamcellen (CSC's), met een hoger percentage zelfvernieuwing en pluripotentie dan differentiële kankertypes, zijn voornamelijk verantwoordelijk voor tumorrecidief9,10 en gemetastasatied CRC11. CSC's presenteren meer resistentie tegen geneesmiddelen12,13,14 en anti-apoptose eigenschappen15,16, dus overleven tumor chemotherapieën.
Hier, om het potentiële mechanisme voor stamheid in de geselecteerde CRC stamcellen te onderzoeken, werd RNAseq uitgevoerd om differentieel uitgedrukte genen in tumorsferoïden te screenen. De kankercellen kunnen sferoïden (ook wel tumorsferen) vormen wanneer ze worden gekweekt in lage therapietrouw en gestimuleerd door groeifactoren die zijn toegevoegd aan het gekweekte medium, waaronder EGF, bFGF, HGF en IL6. Daarom hebben we crc HT29-tumorcellen geselecteerd die bestand zijn tegen chemotherapieën met een toename van fosforyleerde STAT3 wanneer ze worden behandeld met oxaliplatine en irinotecon17. Bovendien, HT29 uitgedrukt hogere stemness markers wanneer gekweekt in de beschreven cultuur voorwaarden. Het HT29-afgeleide CSC-model gaf hogere hoeveelheden leucine-rijke repeat-containing G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5)18, een specifieke marker van CRC stamcellen19,20. Bovendien wordt CD133, beschouwd als een algemene biomarker voor kankerstamcellen , ook zeer uitgedrukt in de HT29-cellijn21. Dit protocol doel is om groepen van de bestuurder genen te ontdekken in de gevestigde kanker stam-achtige tumorsferen op basis van bio-informatica datasets in tegenstelling tot het onderzoeken van individuele oncogenen22. Het onderzoekt potentiële moleculaire mechanismen door middel van RNAseq-analyse, gevolgd door beschikbare bioinformatica-analyses.
De volgende generatie sequencing is een high-throughput, gemakkelijk beschikbaar, en betrouwbare DNA-sequencing methode op basis van computationele hulp, gebruikt om volledig te screenen driver genen voor het begeleiden van tumor therapieën23. De technologie wordt ook gebruikt voor het detecteren van genexpressie van omgekeerde transcriptie van een geïsoleerd RNA-monster24. Echter, bij het screenen met RNAseq, de belangrijkste genen te richten met therapie kan niet de hoogste expressie differentieel tussen experimentele en controle monsters. Daarom zijn sommige bioinformatica ontwikkeld voor het classificeren en identificeren van genen op basis van actuele datasets zoals KEGG25, GO26,27of PANTHER28, waaronder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 en NetworkAnalyst30. Dit protocol toont de integratie van RNAseq en NetworkAnalyst om snel een groep genen te ontdekken in de geselecteerde HT29-afgeleide sferoïden in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen. Toepassing van deze methode op andere ziektemodellen wordt ook voorgesteld voor het ontdekken van verschillen in belangrijke genen.
Vergeleken met onderzoek van individuele genexpressie biedt een hoge doorvoertechniek voordelen om gemakkelijk potentiële bestuurdersgenen te vinden voor tumorprecisiegeneeskunde. Met nuttige datasets zoals KEGG, GO of PANTHER kunnen specifieke genen worden geïdentificeerd op basis van de ziektemodellen, signaleringstrajecten of specifieke functies, en dit maakt het mogelijk om snel te focussen op specifieke, belangrijke genen, wat tijd en onderzoekskosten bespaart. Een soortgelijke toepassing wordt gebruikt in eerdere studies14,18,31. In het bijzonder, een tumor is ingewikkelder omdat verschillende soorten tumoren uitdrukken onderscheidende genen en paden voor overleving en proliferatie. Daarom kan dit protocol genen oppikken die verschillende tumortypen onder verschillende omstandigheden onderscheiden. Er is het potentieel om effectieve strategieën tegen kanker te vinden door het mechanisme van specifieke genexpressie te begrijpen.

<table><tbody><tr><td>iRiS Digital Cell Imaging System</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>voor het observeren van de vorming van tumorspheres</td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>voor het detecteren van de LGR5 en CD133 in de tumorspheres</td></tr><tr><td>anti-LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>LGR5 detectie reagens</td></tr><tr><td>anti-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>CD133 detectie reagens</td></tr><tr><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td><td>voor het kweken van tumorspheres</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td><td>voor het kweken van tumorspheres</td></tr><tr><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td><td>voor het kweken van tumorspheres</td></tr><tr><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td><td>voor het kweken van tumorspheres</td></tr><tr><td>PureLink RNA extraction kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183025</td><td>isoleer totaal RNA voor RNAseq analyse</td></tr><tr><td>RNAseq performance</td><td>Biotools, Taiwan</td><td></td><td>RNAseq analyse wordt commercieel uitgevoerd door Biotools, Taiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>een statistische analyse software</td></tr></tbody></table>

ontdekking van drivergenen in colorectale ht29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Kanker stamcellen spelen een vitale rol tegen klinische therapieën, bij te dragen aan tumor terugval. Er zijn veel oncogenes betrokken bij tumorigenese en de initiatie van kanker stamheid eigenschappen. Aangezien genexpressie in de vorming van colorectale kanker-afgeleide tumorsferen onduidelijk is, kost het tijd om de mechanismen te ontdekken die aan één gen tegelijk werken. Deze studie toont een methode om snel te ontdekken van de bestuurder genen die betrokken zijn bij de overleving van de colorectale kanker stam-achtige cellen in vitro. Colorectale HT29 kankercellen die de LGR5 uitdrukken wanneer gekweekt als sferoïden en begeleiden een toename CD133 stemness markers werden geselecteerd en gebruikt in deze studie. Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om RNAseq uit te voeren met beschikbare bioinformatica om snel de overuitexpressiebestuurdersgenen te ontdekken in de vorming van colorectale HT29-afgeleide stamachtige tumorsferen. De methodologie kan snel potentiële bestuurdersgenen in andere ziektemodellen screenen en ontdekken.

Om het model voor het onderzoeken van het mechanisme in kankerstamcellen vast te stellen, werden colorectale HT29 cellen gebruikt om de kankerstam-achtige tumorsferen in vitro te kweken in een laag-gehechtheidsplaat die B27, EGF, bFGF, HGF, en IL6 bevat. De tumorsferen >100 μm in diameter werden gevormd in 7 dagen(figuur 1A). De tumorsferen werden trypsinized aan enige cellen en geanalyseerd gebruikend stroomcytometrie om LGR5 en CD133 uitdrukking te ontdekken. LGR5 steeg in de HT29-drived t...

Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.

Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Ons protocol maakte gebruik van RNA-Seq en bio-informatische tools om snel de overuitexpressie driver genen die bijdragen aan de vorming van stam-achtige colorectale tumorsferen bloot te leggen. Dit protocol wordt gebruikt om een differentieel uitgedrukt gen en signaaltrajecten te screenen om een moleculair mechanisme voor kankerstamness in een selectieve colorectale kanker te onderzoeken. Gebruik op dag zeven van de cultuur een omgekeerde microscoop met een digitaal celbeeldvormingssysteem om de diameter van de tumorsferen te observeren en te meten.Wanneer de tumorsferen een diameter van meer dan 100 micrometer bereiken, behandel de cultuur met 0,25% trypsine. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius neutraliseert u de trypsine met twee keer het volume van het groeimedium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verzamel de cellen door centrifugatie.En resuspend de pellet op een vijf keer 10 tot de vier cellen per 100 microliter van gemiddelde concentratie. Voeg twee microliter van het primaire antilichaam van belang toe aan elke buis en broed de cellen gedurende 30 minuten uit bij kamertemperatuur en 200 omwentelingen per minuut. Aan het einde van de incubatie, was elke buis met 900 microliter pbs en analyseer de cellen voor expressie van het eiwit van belang door flow cytometrie volgens standaard protocollen.Voor RNA isolatie na trypsine collectie zoals net aangetoond, resuspend de cellen op een twee keer 10 tot de vijfde cellen per 50 microliter van PBS concentratie en lyse elk monster met 200 microliter lysis buffer aangevuld met twee microliters bèta mercaptoethanol per buis. Na korte vortexing en een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur, verzamel de lysates door centrifugatie en voeg 200 microliters van 70% ethanol aan elke buis. Breng de monsters in snelle kolommen en verwijder het oplosmiddel door centrifugatie.Was de monsters met 400 microliters wasoplossing één en 600 microliter wasoplossing twee om niet-RNA volledig te verwijderen door centrifugatie, gevolgd door nog eens twee minuten centrifugeren onder dezelfde centrifugeomstandigheden om eventuele resterende ethanol te verwijderen. Vervolgens resuspend de pellets in 50 microliters van gedestilleerd water per buis en centrifugeren het monster voor een minuut voor het verzamelen van de RNA met supernatants. Om de differentiële genexpressie tussen tumorsferische cellen te onderzoeken in vergelijking met ouderlijke tumorcellen na RNA-sequencing-analyse.Selecteer genen met een meer dan een tot min een log2 vouw verandering met lezen telt groter dan 100 in de tumorsfeer en ouderlijke groepen. En gebruik de commando's zoals aangegeven. Om een vulkaan plot van de gegevens te verkrijgen om het differentiële gen expressie te bepalen.Voor de selectie van aandrijfgen in netwerkanalist selecteert u enkele geninput en kopieer en plakt u de geselecteerde overexpressed genen met menselijke gespecificeerd als het organisme en het officiële gensymbool als het ID-type. Klik op Uploaden en ga verder. Voor het invoegen en analyseren van de gegevens met behulp van eiwit-eiwit interactie, na genetische eiwit-eiwit interactie, gebruik maken van de STRING interactome database met een vertrouwen score afgesneden van 900 om de zaadgenen te tonen.Het koppelen van de geüploade genen. De zaadgenen die associëren met meer individuele genen kunnen worden geselecteerd als driver genen die betrokken kunnen zijn bij het handhaven van de vorming van de tumorsfeer. Selecteer Doorgaan in het kaartoverzicht wit in de achtergrond en Atlas forceren in de knop Indeling.Selecteer vervolgens PANTHER basispaar om de upregulatie gengroep te analyseren. Tumorsferen van meer dan 100 micrometer in diameter vorm binnen zeven dagen van de cultuur. Flow cytometrische analyse onthult een toename van LGR5 en CD133 expressie in HT29-afgeleide tumorsferen in vergelijking met ouderlijke HT29 cellen.Na RNA-sequencing kunnen de genen met een meer dan één log2-voudige verandering in hun up- of downregulatie met een P-waarde van minder dan 0,05, zoals bepaald door de warmtekaart, worden uitgezet om de significante genen tussen HT29-afgeleide tumorsferen en ouderlijke HT29-cellen te onderscheiden. In dit representatieve experiment resulteerde de analyse van de upregulated genen met een meer dan één log2-vouw in 10 zaadgenen, waarbij de gennetwerken werden gekruist. Panther base pair analyse gaf aan dat twee genen werden geassocieerd met negatieve regulatie van apoptose.Bovendien werden de geselecteerde genen bevestigd door kwantitatieve PCR die hun verhoogde expressie in HT29-afgeleide tumorsferen bevestigde. De differentiële genselectie is de belangrijkste stap van de procedures. Vergeet niet om een log2-voudige wijziging groter dan een met vertelt groter dan 100 als de criteria te gebruiken.Met behulp van dit protocol kunnen de genen die zijn geselecteerd uit de colorectale tumorsferen worden neergehaald of overuitgedrukt om hun potentiële rol in tumorsfeervorming te ontdekken.

discovery-driver-genes-colorectal-ht29-derived-cancer-stem-like

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Gebruik makend van de patiënt afgeleide tumoren in een subcutane preklinisch model is een uitstekende manier om de effectiviteit van nieuwe therapieën, voorspellende ontdekking van biomarkers, en resistente paden te bestuderen. Dit model, in de ontwikkeling van geneesmiddelen, is essentieel voor het bepalen van het lot van vele nieuwe anti-kankerbehandelingen voorafgaand aan klinisch onderzoek.

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.

Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Ontdek overexpressed drivergenen in colorectale kankerstam-achtige HT29-tumorsferen met RNA-Seq en bio-informatica. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van kankerstamheid voor gerichte therapieën.

Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

Meer video's verkennen