Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Dit protocol heeft tot doel de voorbereiding van lage input, kleine RNA sequencing bibliotheken te vereenvoudigen van vroege embryo's om nauwkeurig profiel van de microRNAs die embryonale ontwikkeling te reguleren. Het voordeel van deze techniek is dat het de bundeling van lage invoermonsters vermijdt en gemakkelijk kan worden toegepast op zowel niet-gesorteerde als gesorteerde cellen. We demonstreren ook zorgvuldige embryo-enscenering om varianten tussen replica's te voorkomen.

Deze methode kan worden toegepast op temporele, genetische en ontwikkelingsstudies of andere toepassingen waar input RNA concentraties laag zijn. In de toekomst kan deze methode mogelijk worden gebruikt om ontwikkelingsstoornissen te diagnosticeren waarbij microRNAs worden gedysreguleerd. Het meest technisch uitdagende deel van dit protocol is de embryodissectie.

Omdat elk embryo moet worden ontleed, stadium, beeld, en vervolgens snel gescheiden om de levensvatbaarheid van de cel te garanderen. Om de embryo's te ontleden, spoel de baarmoeder van een zwangere vrouwelijke muis met PBS en plaats deze in een steriele plastic schaal van 10 centimeter. Gebruik microdissection schaar om de decidua met regio te scheiden en schil de baarmoederspier om alle decidua bloot te leggen.

Om de embryo's te ontleden, spoel de baarmoeder van een zwangere vrouwelijke muis met PBS en plaats deze in een steriele plastic schaal van 10 centimeter. Gebruik microdissection schaar om de decidua met een gebied te scheiden. Verplaats alle embryo's in een nieuw gerecht met schone PBS en neem een afbeelding van het hele nest.

Beeld vervolgens elk embryo afzonderlijk, en tel het aantal somites, waardoor de vergroting en blootstelling constant blijven tussen experimenten. Voor embryo's ouder dan E8.0, onthoofden net boven de otic placode en breng het hoofd naar een schone put van een 48-put plaat. Voeg 250 microliter papaïne toe aan de put en pipet zachtjes op en neer.

Gebruik de microscoop om te controleren op klonten en blijven pipetten op en neer totdat een enkele cel suspensie is bereikt. Voeg vervolgens 250 microliter FBS toe aan de cellen en filter 500 microliter van de suspensie door een nylon meshfilter van 35 micrometer. Verplaats het filtraat naar een nieuwe 1,5 milliliter buis en draai het vijf minuten naar beneden op 200 x g.

Breng de supernatant over naar een nieuwe buis en zet de celpellet opnieuw op in 300 microliter PBS met BSA. Wanneer u klaar bent om de cellen opnieuw te sorteren door een filterdopbuis en DAPI toe te voegen aan het bevlekken van levende cellen. Gebruik een celsorteerder met een nozzle van 70 micrometer om elk monster te sorteren in 500 microliters RNA-extractieoplossing, meng en bewaar het monster bij negatieve 80 graden Celsius.

Voeg vijf microliter 6x lading kleurstof aan elk monster en meng door pipetting. Laad de monsters op een 6%TBE polyacrylamide gel te beginnen met de laatste in de eerste put en het verlaten van een rijstrook tussen elk monster. Laat de gel 30 tot 40 minuten draaien op 150 volt in een 0,5X TBE-loopbuffer.

Wanneer de gel klaar is met lopen, verwijder deze voorzichtig van de glasplaten en plaats deze in de lade van de originele verpakking, waarbij de oriëntatie wordt opgemerkt. Verwijder de lopende buffer en bevlek de gel gedurende 15 minuten. En beeld het dan op een UV trans illuminator.

Identificeer de band op 150 basisparen en gebruik een schoon scheermesje om het weg te doen. Zorg ervoor dat u het adapterverkleinerproduct met 130 basisparen vermijdt. Doe de gelplakjes in microcentrifugebuizen en draai ze 30 seconden naar beneden op de maximale snelheid.

Gebruik vervolgens een P200-tip om de gelschijf in de kleinst mogelijke stukjes te verpletteren en de punt in de buis te werpen. Voeg 300 microliter elutie buffer aan elke buis, het wassen van de gel bits van de zijkant. Maak de pipetpunt opnieuw vast en was deze eraf voordat u deze uit de buis haalt.

Incubeer de monsters 's nachts bij 25 graden Celsius met 1.000 RPM schudden. Draai ze de volgende dag 10 minuten op maximale snelheid en breng de supernatant over naar een RNase-vrije 96-putplaat. Voeg 50 microliter van opruimen kralen aan elk monster en pipet te mengen.

Voeg vervolgens 350 microliter isopropanol toe, meng het monster en broed de plaat 10 minuten op kamertemperatuur tijdens het schommelen. Na de incubatie, trek draai de plaat en magnetiseren gedurende twee minuten. Gooi de supernatant weg en was de kralen met 950 microliter van 80% ethanol gedurende 30 seconden.

Droog het monster gedurende drie minuten en verwijder vervolgens alle restvloeistof aan de onderkant van de put. Haal de plaat van de magnetische standaard. En resuspend de kralen in 13 microliter van de resuspensie buffer.

Broed de plaat twee minuten in en breng deze vervolgens drie minuten terug naar de magnetische standaard. Breng 12 microliter van de supernatant over naar een schone buis en bewaar het 's nachts op vier graden Celsius of op lange termijn bij negatieve 20 graden Celsius. Embryo's op E7.5, E8.5 en E9.5 werden geoogst.

En somite geënsceneerd om de zes uur tijdsintervallen op te lossen. Toen de analyse van de principiële component werd gebruikt om monsters te groeperen op basis van gelijkenis, werd vastgesteld dat monsters naar leeftijd clusteren. Premigratory en migrerende neurale kamcellen werden gelabeld dat E8.5 met Wnt1-Cre en een E9.5 met Sox10-Cre.

Een vergelijking van de twee CRE-drivers bevestigt dat ze verschillende populaties markeren in vroege muisembryo's. RNA werd gekwantificeerd met een spectrofotometer en capillaire elektroforese. Terwijl de spectrofotometer spoor bleek dat het RNA bevat geen vervuilende eiwitten en een hoge celconcentratie, het was niet gevoelig genoeg om veranderingen in RNA concentratie met de leeftijd te detecteren.

Het capillaire elektroforesespoor kan worden gebruikt om de concentratie en grootte van de RNA-fragmenten te schatten. Pieken op 2, 000 en 5, 100 nucleotiden zijn respectievelijk 18S en 28S ribosomale RNA. Terwijl de kleine RNA-regio is gelegen op ongeveer 150 nucleotiden.

Gelextractie kan worden gebruikt om de kleine RNA-sequencingbibliotheken uit de buurt van de adapterprimeren te isoleren. Vóór excisie, een veelheid van productmaten zijn aanwezig in elk monster. Capillaire elektroforese sporen voor en na grootte selectie tonen de verbetering in de zuiverheid van de 150 base pair bibliotheek product na gel zuivering.

We hebben dit protocol ontworpen om een RNA prep van een enkel monster te splitsen in zowel kleine RNA-sequencingbibliotheken als bulkmRNA-sequencingbibliotheken. Dit zal niet alleen betrekking hebben op vragen rond microRNA-expressie, maar ook welke mRNA-doelen kunnen worden gereguleerd door de uitgedrukte microRNAs. Deze techniek stelde ons in staat om een uitgebreid beeld te krijgen van de meest uitgedrukte microRNAs en de regulering van hun doelen in craniale neurale kuifcellen tussen gastrulation en neurale buissluiting.