Meercellige human alveolaire model samengesteld uit epitheelcellen en primaire immuuncellen voor hazard assessment

Deze individuele menselijke audio model maakt gebruik van relevante immuuncellen als een krachtig instrument om acute immuunrespons van stoffen, waaronder nanomaterialen en kennismedicijnen te voorspellen. Deze medische combineert menselijke epitheelcellen en menselijke primaire immuuncellen om die specifieke reacties te beoordelen. Het gebruik van verse en bevroren monocyten biedt flexibiliteit voor het experimentplan.

Tal van studies hebben aangetoond dat dit model inzicht kan geven in de interstellaire communicatie tussen een gedragsgevoel en immuunzin. Aangezien deze demonstratie bevat alle belangrijke details voor studing het model een persoonlijke eigenschap in de celcultuur, visuele instructies om experimenten te repliceren. Verschillende stappen in het protocol van de blaas zijn complex en vereisen een speciale behandeling.

Daarom worden ze gedemonstreerd met alle vereiste details dat ze gemakkelijk kunnen worden gevolgd. Voor de isolatie van perifere bloedmonocyten van menselijke Buffy lagen, splits de oogst Buffy jas zak inhoud, gelijkmatig tussen 250 milliliter conische buizen. Breng voorzichtig het totale volume in elke buis 250 milliliter met PBS en meng de buizen met drie zachte inversies.

Splits vervolgens de Buffy coat PBS oplossing gelijkmatig over vier nieuwe 50 milliliter buizen, voeg dan 10 microliter cd 14 positieve magnetische kralen de zevende totale cellen aan de buis en meng goed door pipetting. Los bij het vullen de pipet los van de pipetter en stopte onmiddellijk de bovenste opening van de pipet met een duim en plaatste vervolgens de gevulde pipet aan de onderkant van één buis en haal de pipetopening los om het dichtheidsgradiënt medium langzaam onder het buffy coat PBS-mengsel te laten stromen, totdat er een milliliter van het dichtheidsgradiëntmedium in de pipet blijft. Wanneer het dichtheidsgradiëntmedium op dezelfde manier aan elke buis is toegevoegd, scheidt u de cellen per dichtheidsgradiëntcentrifugatie en gebruikt u een serologische pipet voor het verzamelen van de witte twee tot drie millimeter dikke perifere bloedmonopoliecellaag tussen het plasma en de gemiddelde lagen van het dichtheidsgradiënt.

De beste manier om de laag aan te sluiten is om eerst het plasma te verwijderen en dan onderdrukt u onze logische pipetten om de cellen te verzamelen. Trek de perifere bloedmononucleaire cellen uit elke set van twee buizen in een nieuwe 50 milliliter buis en was de cellen twee keer met een totaal volume van 50 milliliter verse PBS per wasbeurt. Gooi vervolgens supernatant weg en zet de pipet in elk in vijf milliliter verse PBS weg en pool de celsuspensies in een enkele buis om te tellen.

Na het tellen, centrifugeren de cellen opnieuw en resuspend de pelette tot 80 milliliter magnetische scheiding buffer per wonen aan de zevende cellen. Voeg vervolgens 10 microliters cd 14 positieve magnetische kralen per wonen de zevende totale cellen aan de buis en meng goed door pipetting. Na een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius spoel een magnetische kolom met drie milliliters magnetische scheidingsbuffer en voeg de cellen toe aan de kolom.

Was de kolom drie keer met drie milliliter buffervolumes per wasbeurt en breng de kolom over in een buis van 15 milliliter met een milliliter verse magnetische scheidingsbuffer. Gebruik vervolgens de zuiger en vijf milliliter buffer om de CD 14 positieve cellen in de buis te spoelen. Induceer differentiatie van de magnetische kraal geïsoleerde CD 14 positieve cellen.

Ten eerste, resuspend de cellen op een keer wonen aan de zes cellen per milliliter concentratie in celcultuur medium. Of MDDC differentiatie, voeg 10 nanogram per milliliter van en van granula site macrofaag kolonie stimulerende factor aan de buis en voeg drie milliliter cellen aan elke put van een zes goed cel cultuur plaat, of MDM differentiatie toe te voegen 10 nanogram per milliliter van macrofaag kolonie stimulerende factor om de cellen en de plaat van de cellen zoals net aangetoond. Het opzetten van een menselijke alveolaire epitheelcelweefsel triple cel co-cultuur model, eerst overdracht 1,5 milliliter van pre-warme cel cultuur medium in het juiste aantal Putten van een 12 put plaat en plaats een cel cultuur invoegen in elke put.

Voeg vervolgens 500 microliter epitheliale celsuspensie toe bij een dichtheid van vijf keer 10 aan de vijfde cellen per milliliter in de apicale kant van elke insert en bedek de plaat voor een vierdaagse incubatie in de celkweek incubator. Of MDDC zaaien vervangt supernatant van de Putten van zes goed platen gebruikt voor MDDC differentiatie, met een milliliter van verse warme cel cultuur medium en gebruik een cel schraper om de hechting cellen los te maken van elke put. Was elke put drie keer met de supernaat en in elke put en combineer alle celoplossingen in een enkele centrifugebuis.

De geoogste MDDC door centrifugatie en steriele pincet om de inzetstukken van de 12 putplaten ondersteboven in een steriele petrischaal te plaatsen. Schraap alle epitheelcellen van de basale kant van de wisselplaat en resuspend de MDDC's in verse celcultuur medium doen een concentratie van 4,2 keer 10 van deze cellen per milliliter. Voeg vervolgens 150 microliter cellen toe aan elke wisselplaat, zodat het gehele basale oppervlak van de wisselplaat gelijk bedekt is met de vloeistof zonder bubbels.

Voor MDDM-zaaiwerk na het oogsten van de gedifferentieerde MDDM's zoals aangetoond voor de MDDC's, verdun de cellen tot een 2,5 keer 10 tot de vier cellen per milliliter van verse celcultuur medium concentratie en voeg 500 microliter cellen langs de wand van elke epitheelcel en MDDC met celkweek insert, plaats dan het deksel op de plaat en plaats de plaat in een cel cultuur incubator voor 24 uur. De volgende dag aspirate de supernatant van zowel de apicale en basale gebieden van elke cel cultuur insert en Putten. Dan steriliseer je pincet om de wisselplaten uit de Putten te tillen en voeg 600 microliters van verse prewarm aan celcultuur medium om elke goed.

Na zes dagen van differentiatie verschijnen de MDM's rond van vorm, terwijl MDDC's clusters vormen die bestaan uit cellen met een meer langwerpige vorm en waarneembare uitsteeksels. Na drie dagen van groei op membraaninsert, vormen de epitheelcellen een dichte A significante toename van lactaatdehydrogenaseafgifte wordt waargenomen in het celkweekmedium van het basale compartiment bij blootstelling aan een positieve controle voor membraanbreuk, waaruit blijkt dat het model reageert op een cytotoxische stof. Geen toename van lactaatdehydrogenase afgifte zoals gemeten bij apicale stimulatie met TNF alpha of LPS.

Statistisch significante toenames in het vrijkomen van IL6 en IL8 worden waargenomen in zowel LPS- als TNF-alfabehandelde monsters in vergelijking met de controle onbehandelde cellen. Er worden geen verschillen in celmorfologie waargenomen tussen de co-cultuurmodellen die MDDM's en MDDC's van verse perifere bloedmonocyten gebruiken in vergelijking met die met ontdooide cellen in LPS en TNF alpha blootgestelde co-cultuur, een verstoorde epitheliale laag werd waargenomen. Het is mogelijk om andere soorten menselijke cellen te gebruiken, zoals luchtweg- of bronchiolarcellen, andere eindpunten kunnen ook worden geanalyseerd.

Voornamelijk onderzoekers zijn geïnspireerd door deze techniek met behulp van een vergelijkbaar op te zetten, maar met verschillende celtypes.