Driedimensionale beeldvorming van de wervellymfefelietische vasculatuur en drainage met behulp van iDISCO⁺ en Light Sheet Fluorescentie Microscopie

Ons protocol biedt driedimensionale en grootschalige weergaven van wervellymfelymfevaten en hun drainerende lymfeklieren, waardoor de studie van lymfedrainage en het lymfeverkeer van immuuncellen wordt vergemakkelijkt. Het iDISCO+clearing protocol behoudt de weefselintegriteit, waardoor lokalisatie van de neurale, vasculaire en immuuncellen van de wervelkolom mogelijk is, waaronder het ruggenmerg, hersenvliezen, epidurale ruimte en drainerende lymfeklieren. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in een verdoofde 8 tot 12 weken oude muis, plaats de muis in een stereotaxic frame.

En gebruik een scalpel om een huidincisie te maken in de juiste regio voor de geplande injectie. Gebruik een spinale adapter om het ruggenmerg te immobiliseren op het th12-L1-wervelniveau en stompe ontleed de paracervical of paraspinale spieren die de nek en de kolom bedekken om het oppervlak van de dura mater te visualiseren. Gebruik vervolgens een 26-meter naald om het centrale gebied van de dura mater en onderlegde arachnoid zorgvuldig te accentueren.

Snijd vervolgens twee millimeter van een glazen capillaire punt en sluit de capillaire aan op een canule gekoppeld aan een 10 microliter spuit. Laad de micro capillaire met twee tot acht microliter van de fluorescerende tracer naar keuze. En introduceer een micro capillair in het mediale gebied van de dura mater onder de juiste hoek voor de geplande injectie.

Duwen de capillaire 1,5 millimeter onder de dura mater, sluit de incisie rond de capillaire met 10 microliter chirurgische lijm. Wanneer de lijm is gedroogd langzaam injecteren van de fluorescerende tracer met een snelheid van een microliter per minuut. Wanneer het gehele volume is geleverd, laat u het capillair gedurende één minuut op zijn plaats voordat u de microcapillaire intrekt.

En sluit het injectiegat met extra lijm. Op het juiste moment na de injectie gebruik dissectie schaar om de huid en peritoneale incisies van de onderbuik naar de thoracale kooi te maken. Open de thoracale kooi om toegang te krijgen tot het hart en steek een 26-meterige naald in de linker hartkamer van het hart.

Doorsnede met 20 milliliter ijskoud 4%paraformaldehyde in PBS, met een snelheid van twee milliliter per minuut. En gebruik een schaar om snel het rechter atrium te snijden waardoor de perfusievloeistofstroom vrijkomt. Gebruik tangen om de huid volledig te verwijderen en verwijder de ledematen met een schaar.

Verwijder alle inwendige organen, zorg ervoor dat de lymfeklieren intact blijven en snijd de ribben. Dompel de ontleed weefsels in ijskoud 4%paraformaldehyde in PBS in individuele 50 milliliter buizen 's nachts op vier graden Celsius, voor het wassen van de vaste weefsels drie keer in 50 milliliter verse PBS, gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voor iDISCO+labeling van hele-mount monsters eerst, dehydrateren van de weefsels met opeenvolgende onderdompelingen in opgaande concentraties van methanol in PBS voor een uur per onderdompeling met agitatie bij kamertemperatuur.

Na de laatste onderdompeling incubeer de monsters in een 33%methanol, 66%dichloormethaan oplossing 's nachts met agitatie. De volgende ochtend, was de monsters twee keer met 100% methanol voor een uur per wasbeurt op kamertemperatuur. Gevolgd door een nachtelijke incubatie in 5% waterstofperoxide in methanol bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend rehydrateren de monsters geleidelijk in opeenvolgende onderdompelingen in dalende concentraties methanol in PBS gedurende een uur per concentratie met agitatie bij kamertemperatuur. Om de wervels te ontkalken de monsters in morse's oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door twee spoelingen in PBS en twee, een uur incubaties, in 0,2%Triton X-100 in PBS, met agitatie bij kamertemperatuur.

Behandel de monsters na de tweede Triton X-100 incubatie gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met permeabilisatieoplossing. Gevolgd door een 24-uurs incubatie in het blokkeren van oplossing bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de blokkeringsoplossing labelen de monsters met primair antilichaam, verdund in een 0,2%Tween-20 en 0,1%heparine in PBS aangevuld met 5%dimethylsulfoxide en 3%ezelserumoplossing bij 37 graden Celsius gedurende zes dagen.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters met vier tot vijf nachtelijke incubaties in verse 2%Tween-20 en 0,1% heparine in PBS per wasbeurt bij kamertemperatuur met agitatie. Vervolgens broeden de monsters met secundaire antilichamen volgens manuscript richtingen. Na de laatste waswatermonsters met opeenvolgende onderdompelingen in opgaande concentraties methanol in PBS gedurende een uur per concentratie.

Gevolgd door een nachtelijke incubatie in 33%methanol 66%dichloormethaanoplossing. De volgende ochtend, was de monsters met twee 15 minuten dichloormethaan wast. En duidelijk de monsters in dibenzyl ether zonder te schudden voor vier uur.

Voor lichtblad fluorescentie microscopie imaging plaats de gewiste monsters in een transversale vlak in de microscoop stadium onder een 4X, 0.3 doelstelling. En selecteer een eenzijdige driebladige eliminatieconfiguratie met een vaste X-positie zonder dynamisch scherpstellen. Gebruik LED-lasers afgestemd op 561 nanometer en 100 milliwatt en 639 nanometer en 70 milliwatt.

En stel de lichtplaat numerieke diafragma op 0,03. Stel de juiste emissiefilters in en vul de microscoopkamer met dibenzylether. Gebruik vervolgens de camera om stapels met 2,5 micrometer Z-stacks en een belichtingstijd van 30 milliseconden per stap te verkrijgen met behulp van de twee X optische zoom en 0,8 micrometer per pixel.

En voer de mozaïekaanwinsten uit met een overlap van 10% op het volledige frame. Verwerf afbeeldingen in TIF-formaat en zet ze om naar 3D-formaat met een geschikt volledig conversiesoftwareprogramma. Om de mozaïeken te reconstrueren met Stitcher-software opent u de afbeeldingen en rangschikt u handmatig de afbeeldingen om het hele mozaïekbeeld opnieuw samen te stellen, met behulp van de 10% overlap tussen de afbeeldingen als gids.

Gebruik vervolgens 3D-software om orthogonale projecties van de gegevens te genereren. Het toevoegen van een kleur-code attribuut aan de lymfevaten en de andere anatomische structuren tentoongesteld. En stel een gammacorrectie van 1,47 in op de ruwe gegevens verkregen uit de lichtbladfluorescentiemicroscopie.

volgens de instructies van de fabrikant. De combinatie van iDISCO+met lichtbladfluorescentiemicroscopie behoudt de wervelanatomie en maakt het mogelijk de lymfevaat in de omliggende botten, ligamenten, spieren en zenuwganglia vast te leggen. De injectie van een kleine rode fluorescerende tracer in ofwel het cerebrale ruggenmergvocht, de cisterna magna of de thoracolumbar regio van het ruggenmerg resulteert in tracer accumulatie in de diepe cervicale lymfeklieren 45 minuten na injectie, wat de opname en drainage van de tracer door het lymfesysteem aangeeft.

Tracer injectie in de thoracolumbar spinale parenchyma resulteert in tracer accumulatie in ruggenmergweefsels en diepe cervicale drainerende lymfeklieren, maar niet in de cervicale en thoracale lymfe vasculatuur gelabeld met anti-LYVE-1 antilichamen. Anti-LYVE injectie in de thoracolumbar spinale parenchyma resulteert in etikettering van zowel de wervellymfomatica en hun extra-wervellymfelysatieverbindingen. Onderbouwing van de opname van de tracer door wervellymfeloosvaten en de lymfedrainage naar het buitenwervellymfestelsel.

Voer de sporeninjectie zeer zorgvuldig uit om die CSF-circulatie niet te verstoren. Het iDISCO+-protocol is zeer officieus, maar u moet zich aanpassen aan de grootte van uw monsters. Na sporeninjectie in het centrale zenuwstelsel kan immuunvlekken of live imaging experiment worden uitgevoerd door AUS.

Het iDISCO+-protocol kan worden gebruikt om verschillende cellen, populaties en weefsels te bestuderen.