Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans
7 september 2021
Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.
Het gebruik van weefselspecifieke expressie van polyglutamine fluorescerende reporter in C.elegans is belangrijk omdat het de ontdekking en karakterisering van proteostaseregulatoren mogelijk maakt in de context van een intact meercellig organisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het visualisatie en kwantificering mogelijk maakt van de leeftijdsgebonden afname van cellulaire proteostase in vivo, wat essentieel is om dieper mechanistisch inzicht te krijgen in hoe organismen de juiste vouwing en functie van het proteoom en de effecten van veroudering behouden. Het ophelderen van mechanismen die in staat zijn om proteostase te behouden, zal de ontwikkeling van gerichte interventies vergemakkelijken voor de behandeling van verouderingsgerelateerde ziekten waarbij proteostase in gevaar is en om gezond ouder worden te bevorderen.
Proteostase-ineenstorting is een enorm probleem in de kliniek, omdat het ten grondslag ligt aan de ontwikkeling van eiwitmisvoudende ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson, de ziekte van Huntington en amyotrofische laterale sclerose. Begin met het gebruik van petriplaten met een diameter van 6 centimeter om vijf agarplaten voor elke testconditie te bereiden. Voor experimenten met RNAi, induceer dsRNA-productie in getransformeerde HT115 E.coli en gebruik RNAi-agar.
Gebruik OP50 E.coli op standaard NGM-agar voor experimenten zonder RNAi. Kweek de E.coli-culturen 's nachts bij 37 graden Celsius terwijl je schudt bij 220 RPM. Pellet de volgende dag de bacteriën door centrifugering bij 2, 400 G gedurende 15 tot 20 minuten, adem vervolgens het supernatant op en suspensie de pellet opnieuw in een tiende van het startvolume van lb.
Aliquot 200 microliter geconcentreerde bacteriën op elke plaat en laat de open platen drogen in een schone omgeving totdat alle vloeistof is geabsorbeerd. Om de C.Elegans te synchroniseren met hypochlorietbehandeling, wast u gravid hermafrodieten tweemaal met M9-buffer, brengt u ze over naar een verse buis en incubeert u gedurende vijf minuten in 5 milliliter hypochlorietoplossing, waarbij u ze elke minuut schudt. Draai na de incubatie de dieren naar beneden en was ze drie keer met M9-buffer.
Laat embryo's 's nachts in buisjes uitkomen in 3 milliliter M9-oplossing met rotatie bij 20 graden Celsius. Bereken de dichtheid van L1-dieren door 10 microliter L1-oplossing drie keer op een plaat van 6 centimeter te laten vallen en het aantal L1-dieren te tellen. Meng periodiek de L1-oplossingen om te voorkomen dat de dieren bezinken.
Zaai 50 L1 één dier op elke plaat, tel en noteer het aantal gezaaide en verplaats de platen naar een incubator van 20 graden Celsius. Als alternatief, om dieren te synchroniseren via eierleggen, plaats vijf tot tien jonge, gravid volwassen dieren op elk bord gedurende vier tot zes uur en laat ze eieren leggen totdat er ongeveer 50 eieren per bord zijn. Verwijder alle gravid volwassenen en verplaats de platen met de eieren naar een incubator van 20 graden Celsius.
Laat de dieren groeien tot het L4-stadium, wat ongeveer 40 uur duurt bij 20 graden Celsius. Voeg vervolgens 50 microliter van 160 keer FUDR toe. Om de afname van proteostase in spierweefsel te meten, kiest u 20 dieren en monteert u ze op een microscoopglaasje met een 3% agarosepad en een druppel van 5 microliter van 10 millimolair natriumazide.
Nadat alle wormen zijn geïmmobiliseerd, beeld je het hele lichaam van de dieren in met een vergrotingslens van 10 X. Gebruik een FITC- of YFP-filter en dezelfde blootstelling voor elk dier. Als u klaar bent, gooit u de dia's weg.
Tel het aantal foci in de lichaamswandspieren van het hele dier. Foci zijn helderdere onderbroken signalen die kunnen worden onderscheiden van het dimmer oplosbare signaal op de achtergrond. Kijk op scoringsdagen naar de platen met de dieren en noteer het aantal verlamde dieren en verwijder vervolgens verlamde dieren van de plaat.
Bereken aan het einde van het experiment de verlammingssnelheid voor elke aandoening en plot de progressie van de verlamming. Om de afname van proteostase in neuronaal weefsel te meten, monteer je de wormen op een dia zoals eerder beschreven en maak je Z-stack-afbeeldingen van het hoofd van de dieren op een samengestelde microscoop met behulp van een 40 X-vergrotingslens. Gooi de dia's weg na het afbeelden.
Na het verkrijgen van de afbeeldingen, vlakt u de Z-stapels af en gebruikt u ze om het aantal foci in neuronen op het zenuwringgebied te kwantificeren. Plot de progressie van YFP foci accumulatie van dag 4, 6, 8 en 10. Op dag twee van de volwassenheid pluk je 10 gesynchroniseerde dieren van de plaat en plaats je ze op een 10 microliter druppel M9-buffer op een microscoopglaasje.
Herhaal deze stap minstens vier keer om een monster van 40 of meer dieren te krijgen. Video-opname van de beweging van de dieren gedurende een periode van 30 seconden op een stereomicroscoop met een video-capabele camera. Zodra alle video's met de te analyseren dieren zijn opgenomen, speelt u de video af en scoort u de lichaamsbuigingen van elk dier.
Zet het aantal lichaamsbuigingen voor elk dier uit in een kolomgrafiek, waarbij elke stip het aantal lichaamsbuigingen in 30 seconden op de Y-as en de verschillende omstandigheden op de X-as vertegenwoordigt. Het polyglutamine-herhalingsmodel heeft een belangrijke rol gespeeld bij de identificatie van genen die het proteostatische netwerk reguleren. Spierspecifieke polyQ-YFP-expressie resulteert in accumulatie van fluorescerende foci die gemakkelijk te kwantificeren zijn onder een eenvoudige fluorescerende ontleedmicroscoop.
De dieren raken verlamd tijdens het midlife, omdat het proteoom in de spier instort als gevolg van het proteotoxische effect van de verslaggever. De leeftijdsgebonden afname van neuronale proteostase kan worden gevolgd door het direct kwantificeren van geaggregeerde vorming en afnames in gecoördineerde lichaamsbuigingen na het plaatsen van dieren in vloeistof. Deze methode is gebruikt om aan te tonen dat het homeo-domein interagerende eiwitkinase, een transcriptionele cofactor, de proteostase tijdens veroudering beïnvloedt door de expressie van autofagie en moleculaire chaperones te reguleren.
Het verlies van HPK-1 verhoogt het aantal Q35-YFP-aggregaten dat zich ophoopt tijdens het ouder worden. Controledieren vertoonden gemiddeld 18 aggregaten, terwijl de met HPK1 null mutant en HPK1 RNAi behandelde dieren gemiddeld respectievelijk 28 en 26 aggregaten vertoonden. Op dag acht van de volwassenheid was 77 tot 78% van de HPK1-deficiënte dieren verlamd, vergeleken met slechts 50% van de controle.
Bovendien werd aangetoond dat overexpressie van HPK1 de vorming van eiwitaggregaten reguleert en ouder wordende dieren beschermt tegen Q35-YFP-geassocieerde verlamming tijdens veroudering. Deze methode meet de algemene achteruitgang van het proteoom binnen een celtype. Er bestaan veel methoden om veranderingen in specifieke componenten van het prostaatnetwerk te beoordelen.
Samen geven ze een totaalbeeld. Afnemende proteostase is een kenmerk van veroudering. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om deze daling te kwantificeren.
In combinatie met genetische analyse is het een krachtig hulpmiddel voor ontdekking.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de afname van proteostase als een sleutelfactor bij veroudering en neurodegeneratieve ziekten, met behulp van een C. elegans model. De auteurs gebruiken weefselspecifieke expressie van polyglutamine fluorescente reporteren om proteostase kwantitatief in vivo te meten, waardoor inzichten worden verkregen in leeftijdsgerelateerde cellulaire achteruitgang.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Veroudering
- Neurodegeneratieve ziekten
- Proteostase
Achtergrond
- Proteostatische achteruitgang is gekoppeld aan ziekten zoals Alzheimer en Parkinson.
- Begrip van proteostase mechanismen is cruciaal voor mogelijke therapeutische interventies.
- Het gebruik van een multicellulair organismemodel (C. elegans) helpt bij de onderzoek van cellulaire processen in vivo.
Gebruikte methoden
- Weefselspecifieke polyglutamine fluorescente reporter expressie
- Caenorhabditis elegans
- Microscopie om foci en verlammingspercentages te kwantificeren
Belangrijkste resultaten
- De studie onthult de accumulatie van fluorescente aggregaten in C. elegans spier- en neuronweefsel als teken van proteostase achteruitgang.
- HPK-1-deficiëntie leidde tot verhoogde aggregatenvorming tijdens veroudering.
- Demonstreerde een correlatie tussen proteostase en verslechtering van motorfunctie.
Conclusies
- Dit onderzoek benadrukt de cruciale rol van proteostase in verouderingsprocessen.
- De bevindingen leveren waardevolle inzichten voor het ontwikkelen van interventies om leeftijdsgerelateerde eiwitmisvouwziekten te bestrijden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying tissue-specific proteostatic decline in C. elegans enables early-stage target validation for neurodegenerative disease mechanisms. The model provides quantitative, in vivo readouts of protein aggregation and functional decline, supporting predictive confidence in pathway modulation. This approach facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to proteostasis outcomes in an intact multicellular system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing age-associated proteostasis collapse in specific tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantification of fluorescent foci and locomotion defects as phenotypic readouts.
- Predictive Value: Correlates molecular changes with behavioral outputs, improving confidence in target relevance to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative imaging outputs for high-throughput screening of proteostasis modulators.
- Reproducibility: Uses synchronized worm populations and consistent imaging parameters to ensure reliable foci counting across conditions.
- Scalability: Adaptable to multi-well formats and automated imaging platforms for compound library evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models proteostasis decline underlying Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, and ALS, enabling target identification for protein misfolding diseases.
- Translational Continuity: Connects genetic hits (e.g., HPK-1) to autophagy and chaperone regulation, informing mechanistic pathways for therapeutic intervention.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of targets based on aggregate burden and paralysis progression, reducing false positives in lead selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, providing mechanistic insights after target identification and before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying tissue-specific proteostasis decline in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts (foci count, paralysis rate) for evaluating compound effects on protein homeostasis.
- Analytics: Enables statistical comparison of aggregation kinetics and functional decline across genotypes or treatment groups.
- Translational Research: Links molecular chaperone and autophagy pathways to phenotypic outcomes, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic proteostasis assessment across multiple disease-relevant tissues and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into proteostatic networks, reducing ambiguity in target validation for neurodegenerative indications.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative imaging-based assays with defined scoring criteria for foci and motility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular targets to functional decline in a physiologically relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by quantifying proteostasis rescue potential across neuronal and muscle tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, microscopy, and transgenic strain maintenance.
- Dependent on fluorescence microscopy systems with FITC/YFP filters and controlled environmental conditions for aging assays.
- Necessitates synchronization protocols and standardized scoring criteria for foci quantification and paralysis assessment.
- Adaptation across tissues relies on promoter-driven expression and may require optimization for signal-to-noise in different cellular contexts.
- Practical limitations include throughput constraints of manual imaging and variability in aggregate penetration depth in thick tissues.
