Name: Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer weefselspecifieke kwantificering van proteostatische achteruitgang bij Caenorhabditis elegans met fluorescentie-microscopie. Deze methode helpt onderzoekers veroudering en eiwitmisfoldingziekten te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag voormalige en huidige leden van het Samuelson-laboratorium bedanken voor hun hulp bij de verfijning van deze methode en / of discussie die de ontwikkeling van dit manuscript heeft geholpen. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute on Aging van de National Institutes of Health onder awardnummers RF1AG062593 en R21AG064519. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Veroudering wordt gekenmerkt door een geleidelijke afname van proteostase. Proteostase wordt onderhouden door een complex systeem, het proteostatische netwerk, voor de gecoördineerde, dynamische, stressresponsieve controle van eiwitvouwing, -afbraak en -translatie. Waarom proteostase faalt in de loop van het ouder worden is slecht begrepen, maar een rottend epigenoom, afnemende induceerbaarheid van stressreacties en verlies van compenserende overspraak vallen allemaal samen met deze afbraak. Bij C. elegans neemt...

Eiwithomeostase (proteostase) wordt gedefinieerd als het cellulaire vermogen om de juiste functie en vouwing van het proteoom te behouden. De inherente uitdaging voor proteostase is ervoor te zorgen dat alle eiwitten goed worden gevouwen en onderhouden in een inheemse conformatie, die verder wordt versterkt door de gevarieerde aard van eiwitgrootte, aminozuursamenstelling, structurele conformatie, stabiliteit, omzet, expressie, subcellulaire compartimentering en modificaties1. Proteostase wordt gehandhaafd door de gecoördineerde werking van een groot proteostatisch netwerk, bestaande uit ongeveer 2000 unieke eiwitten, die de juiste synthese, vouwing, handel en afbraak binnen het proteoomreguleren 2,3. De werkpaardcomponenten van het proteostatische netwerk zijn negen belangrijke families van moleculaire chaperones4. Elk weefsel- en celtype maakt bij voorkeur gebruik van specifieke subsets van moleculaire chaperones, vermoedelijk in overeenstemming met de verschillende eisen van verschillende proteomen5.
Een kenmerk van normale organismale veroudering is de progressieve afname en ineenstorting van cellulaire proteostase, waarvan wordt gedacht dat het een onderliggende basis is voor het begin en de progressie van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten. De ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) hebben bijvoorbeeld een gemeenschappelijk kenmerk: in elk geval wordt manifestatie van neurodegeneratie aangedreven door genetische veranderingen die een gemuteerd eiwit vatbaar maken voor aggregatie (respectievelijk amyloïde-β / Tau, α-synucleïne, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Tijdens veroudering neemt de integriteit en induceerbaarheid van het proteostatische netwerk af, wat resulteert in de accumulatie van proteotoxische aggregaten die resulteren in cellulaire disfunctie en neurodegeneratie. Van belang is dat eiwit conformatieziekten niet uniek zijn voor neuronen en voorkomen in meerdere weefsels, zoals benadrukt door type II diabetes, multipel myeloom en cystische fibrose11,12,13,14. Daarom zal het ophelderen van mechanismen die in staat zijn om proteostase te behouden, de ontwikkeling van gerichte interventies voor de behandeling van ziekten en om gezond ouder worden te bevorderen, vergemakkelijken.
De kleine bodemnematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft een belangrijke rol gespeeld bij het ontdekken van genen en het ophelderen van routes die de proteostase veranderen. Veel componenten van het proteostatische netwerk en de signaaltransductieroutes die de proteostase reguleren, zijn evolutionair geconserveerd. Bovendien heeft C. elegans de complexiteit en redundantie ten opzichte van gewervelde systemen verminderd, waardoor het meer vatbaar is voor genetische analyse en genontdekking. Bijkomende voordelen van C. elegans die ertoe hebben geleid dat het op grote schaal wordt gebruikt als een modelsysteem om proteostase te bestuderen, zijn onder meer: krachtige genetische en functionele genomica, een korte levenscyclus (3 dagen) en levensduur (3 weken), een compact en goed geannoteerd genoom, de beschikbaarheid van een breed assortiment genetische mutanten en het gemak van het visualiseren van weefselspecifieke veranderingen in de celbiologie met behulp van fluorescerende reporters.
Het progressieve verval van proteostase tijdens veroudering kan gemakkelijk worden gekwantificeerd in C. elegans. Het Morimoto-laboratorium toonde voor het eerst aan dat een polyglutamine-expansie gefuseerd tot geel fluorescerend eiwit (polyQ: : YFP) kon worden gebruikt om proteostatische afname van C. elegans tijdens veroudering15,16,17,18te kwantificeren. YFP-fusies tot 35 glutamine-herhalingen of meer resulteren in een leeftijdsgebonden vorming van fluorescerende foci samen met tekenen van cellulaire pathologie. Van belang is dat dit bereik van glutamine-expansie de lengte weerspiegelt van het polyglutaminekanaal van het huntingtine-eiwit waarbij de pathologie van de ziekte van Huntington bij mensen begint te worden waargenomen (meestal >35 CAG-herhalingen)19. Stammen met expressie van polyQ::YFP in spier-, darm- of neuronale cellen zijn gebruikt om te bevestigen dat de leeftijdsgebonden achteruitgang van proteostase optreedt in verschillende cel- en weefseltypen. Spierspecifieke polyQ::YFP-expressie (d.w.z. unc-54p::Q35::YFP) is de meest gebruikte weefselspecifieke verslaggever, omdat accumulerende fluorescerende foci gemakkelijk te kwantificeren zijn gedurende de eerste paar dagen van de volwassenheid met behulp van een eenvoudige fluorescerende ontleedmicroscoop (Figuur 1A-1B). Bovendien raken dieren verlamd tijdens het midden van het leven, omdat het proteoom in de spier instort als gevolg van het proteotoxische effect van de verslaggever (figuur 1C). Evenzo kan de leeftijdsgebonden afname van neuronale proteostase worden gevolgd (rgef-1p::Q40::YFP) door het direct kwantificeren van foci/aggregaatvorming en leeftijdsgebonden afnames in gecoördineerde lichaamsbuigingen na het plaatsen van dieren in vloeistof(Figuur 2).
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het meten van de leeftijdsafhankelijke progressie van eiwitaggregatieaccumulatie en de bijbehorende proteotoxiciteit geïnduceerd door de expressie van polyglutamineherhalingen in neuronaal en spierweefsel in C. elegans. We geven voorbeelden van typische resultaten die worden gegenereerd met behulp van deze stammen en methoden. Verder laten we zien hoe we deze methoden hebben gebruikt om transcriptionele regulatie van het proteostatische netwerk te bestuderen. We bespreken aanvullende manieren waarop deze reporters eenvoudig kunnen worden geïntegreerd met andere bestaande reagentia of kunnen worden aangepast voor grotere schermen.

<table><tbody><tr><td>24 Well Culture Plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro;L 96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>96-pin plate replicator</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Luchtdoorlatende plaatseal</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>bacteriologische agar</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>bacto-pepton</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collectie (Ahringer)</td><td>Zie ook Kamath et. al, Nature 2003.</td></tr><tr><td>C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Zie ook Rual et. al, Genome Research 2004. Deze bibliotheek is ook verkrijgbaar bij Dharmacon.</td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>Glazen microscope dekplapjes</td><td>VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>Glazen microscope slides</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranosid)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige niet-behandelde enkele plaat, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid, CAS #26628-22-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M2m microscoop met AxioVision v4.8.2.0 software</td><td>Zeiss</td><td>onbekend</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscoop</td><td>Zeiss</td><td>onbekend</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Het vermogen om een goede functie en vouwing van het proteoom (eiwithomeostase) te behouden, neemt af tijdens normale veroudering, waardoor het begin van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten wordt vergemakkelijkt. Eiwitten met polyglutamine-uitbreidingen zijn bijvoorbeeld gevoelig voor aggregatie, zoals geïllustreerd met het huntingtine-eiwit en het gelijktijdige begin van de ZvH. De leeftijdsgebonden verslechtering van het proteoom is op grote schaal bestudeerd door het gebruik van transgene Caenorhabditis elegans die polyQ-herhalingen tot expressie brengen die zijn gefuseerd met een geel fluorescerend eiwit (YFP). Dit polyQ::YFP transgene diermodel vergemakkelijkt de directe kwantificering van de leeftijdsgebonden achteruitgang van het proteoom door de progressieve vorming van fluorescerende foci (d.w.z. eiwitaggregaten) en het daaropvolgende begin van voortbewegingsdefecten die zich ontwikkelen als gevolg van de ineenstorting van het proteoom in beeld te brengen. Verder kan de expressie van het polyQ::YFP-transgen worden aangedreven door weefselspecifieke promotors, waardoor proteostase over weefsels kan worden beoordeeld in de context van een intact meercellig organisme. Dit model is zeer vatbaar voor genetische analyse en biedt dus een benadering om veroudering te kwantificeren die complementair is aan levensduurtests. We beschrijven hoe we de vorming van polyQ::YFP-foci in neuronen of lichaamswandspier tijdens het ouder worden nauwkeurig kunnen meten, en het daaropvolgende begin van gedragsdefecten. Vervolgens benadrukken we hoe deze benaderingen kunnen worden aangepast voor een hogere doorvoer en mogelijke toekomstige toepassingen met behulp van andere opkomende strategieën voor C. elegans genetische analyse.

In C. elegansis het polyglutamine-herhalingsmodel instrumenteel geweest voor de identificatie van genen die het proteostatische netwerk reguleren. We hebben bijvoorbeeld eerder aangetoond dat het homeodomain-interagerende eiwitkinase (hpk-1), een transcriptionele cofactor, de proteostase tijdens veroudering beïnvloedt door de expressie van autofagie en moleculaire chaperones te reguleren31. We ontdekten dat verlies van hpk-1, hetzij door RNAi-uitschakeling of in hpk-...

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Het gebruik van weefselspecifieke expressie van polyglutamine fluorescerende reporter in C.elegans is belangrijk omdat het de ontdekking en karakterisering van proteostaseregulatoren mogelijk maakt in de context van een intact meercellig organisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het visualisatie en kwantificering mogelijk maakt van de leeftijdsgebonden afname van cellulaire proteostase in vivo, wat essentieel is om dieper mechanistisch inzicht te krijgen in hoe organismen de juiste vouwing en functie van het proteoom en de effecten van veroudering behouden. Het ophelderen van mechanismen die in staat zijn om proteostase te behouden, zal de ontwikkeling van gerichte interventies vergemakkelijken voor de behandeling van verouderingsgerelateerde ziekten waarbij proteostase in gevaar is en om gezond ouder worden te bevorderen.Proteostase-ineenstorting is een enorm probleem in de kliniek, omdat het ten grondslag ligt aan de ontwikkeling van eiwitmisvoudende ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson, de ziekte van Huntington en amyotrofische laterale sclerose. Begin met het gebruik van petriplaten met een diameter van 6 centimeter om vijf agarplaten voor elke testcondi

quantifying-tissue-specific-proteostatic-decline-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

This video demonstrates an in vivo imaging-based assay to determine proteostasis decline due to aging. The assay uses Caenorhabditis elegans expressing polyglutamine YFP-fusion protein in body wall muscles to measure the age-associated aggregation of polyglutamine and induction of proteotoxicity, leading to paralysis.

Fluorescent Reporter-Based Paralysis Assay: A Technique to Assess Age-Associated Progressive Formation of Polyglutamine Fluorescent Reporter and Associated Paralysis in Caenorhabditis elegans

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Leer weefselspecifieke kwantificering van proteostatische achteruitgang bij Caenorhabditis elegans met fluorescentie-microscopie. Deze methode helpt onderzoekers veroudering en eiwitmisfoldingziekten te bestuderen.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen