Model van ischemische hartziekten en video-gebaseerde vergelijking van Cardiomyocyte Contractie met behulp van hiPSC-afgeleide Cardiomyocyten

Hart-en vaatziekten onderzoek wordt vaak uitgevoerd bij kleine en zoogdieren zoals knaagdieren. Echter, de fysiologie van het menselijk hart verschilt aanzienlijk van die van het knaagdierhart. Ons protocol maakt gebruik van cardiomyocyten onderscheiden van menselijke iPS cellen om ischemische hart-en vaatziekten model en om de schade en functionele aantasting van ischemische cardiomyocyten te kwantificeren.

Dit protocol kan een handige methode bieden voor gepersonaliseerde screening van geneesmiddelen met behulp van iPS-cellen afkomstig van individuele patiënten, de juiste behandeling van de iPS-cellen, zoals bij het gebruik van vers medium, en het langzaam en punctueel veranderen van het medium is van cruciaal belang voor een succesvolle differentiatie in functionele cardiomyocyten. Demonstreren van de procedure met Yun Liu, Yin Liang en Mengxue Wang zal Chen Wang, een promovendus uit een laboratorium. Om menselijke geïnduceerde Pluripotente stamceldifferentiatie in hartcellen te induceren, bestlaagt u eerst de putten van een 96 putcultuurplaat met 100 microliters van 1.675 microgram per milliliter laminine in PBS.

Na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius, zie drie keer 10 tot de vierde stamcellen in 200 microliters van IPS-onderhoudsmedium aangevuld met 10 micromolar Y27632 in elke put en breng de plaat terug naar de Celcultuur Incubator. Na 24 uur, vervang de super middelen met 200 microliters van IPS groeimedium per goed, en de plaat terug te keren naar de Cell Culture Incubator voor een extra twee tot drie dagen. Wanneer de cellen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken.

Vervang het medium in elke put door 200 microliters van voorverwarmd differentiatiemedium A en breng de plaat nog 48 uur terug naar de Celcultuur Incubator. Aan het einde van de incubatie verving langzaam de supernatant in elke put door 200 microliters van voorverwarmd differentiatiemedium B en de plaat terug te geven aan de Celcultuur Incubator. Na twee dagen, vervang de supernatants door 200 microliters van voorverwarmd cardiomyocyten onderhoudsmedium per put en keerde de plaat terug naar de Cell Culture Incubator voor maximaal 30 dagen.

Om de contractiliteit van de cardiomyocyten te beoordelen, installeert u het beeld van de deeltjescels velocimetry j-plugin en gebruikt u een fasecontrastmicroscoop en de vorken die ernaar streven om videobeelden van de cellen op te nemen met ongeveer 20 frames per seconde gedurende ongeveer 10 seconden. Sla vervolgens het videobestand op zoals onze API is geanalyseerd en maak een mapstructuur zoals aangegeven. Als u afzonderlijke tweedimensionale vectorvelden van cellulaire verplaatsing wilt analyseren, start u VG en selecteert u plug-ins, macro's en bewerkt u om vectoranalyse te openen.

ijm, klik dan op uitvoeren van de analyse zal automatisch worden uitgevoerd. Voor ischemische behandeling, vervang de supernatant in elke put met 200 microliters van dmem zonder glucose en serum, plaats dan de plaat in een Hypoxische kamer dan infuus stikstofgas in de kamer, het handhaven van de interne zuurstofconcentratie op 2%en de kooldioxide concentratie op 5%gedurende 24 uur. Met succes gedifferentieerde cellen, toont spontane samentrekking zoals waargenomen onder de microscoop met 50% van de cultuurputten die typisch spontane samentrekking in minder dan 20 dagen tentoonstellen.

Cardiale marker eiwit kan ook worden gebruikt om een succesvolle differentiatie te bevestigen Cellen uit de ischemische groep vertonen meestal een lagere levensvatbaarheid in MTT-tests en een lagere contractiliteit dan die van de normoxische controlegroep. De verhouding van propidium jodide positieve cellen is ook hoger in de Ischemische groep, dan in de controlegroep, wat wijst op een hogere incidentie van cellulaire schade. Het is belangrijk dat u nauwkeurig lokaliseren van de regio's van belang in de capture plaat om vergelijking van de contractiliteit van de cardiomyocyten mogelijk te maken.

Deze techniek kan worden gebruikt voor screening van geneesmiddelen, met behulp van patiënt afgeleide iPS cellen. Het biedt ook een uniek platform voor het verder toegehelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan ischemische hartziekten