High-Throughput Methode voor het meten van alcohol sedatie tijd van individuele Drosophila melanogaster

Drosophila biedt een uitstekend model om de genetische onderbouwing van alcoholgevoeligheid te bestuderen, omdat u alcoholgevoeligheid nauwkeurig kwantificeren onder gecontroleerde genetische achtergronden en omgevingsomstandigheden. Huidige methoden om alcoholgevoeligheid te meten in Drosophila-testgroepen van vliegen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, high-throughput methode om alcoholgevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen te beoordelen.

Variatie in alcoholgevoeligheid in Drosophila kan worden vertaald naar vergelijkbare fenotypen bij de mens, omdat vliegen ongeveer 75% van hun genen delen met menselijke orthologs. De test die we ontwikkelden kan ook worden toegepast om de effecten van acute toxiciteit van vluchtige stoffen op andere insecten, waaronder andere vliegsoorten of ziektevectoren, te meten. Begin met het maken van een kartonnen sjabloon van een 24-well celkweekplaat.

Traceer rond de plaat en knip het aangewezen gebied uit. Gebruik vervolgens de kartonnen sjabloon om een stuk klein insectenscherm te maken ter grootte van de plaat. Plaats een kleine lijn van hete lijm rond de omtrek van een 24-well cultuurplaat, en breng het scherm gaas op de top van de putten.

Gebruik dan de hete lijm pistool om een houten ambachtelijke stok vast te zetten aan drie zijden van de cultuur plaat. Bereid zoveel borden als kan passen in de filmkamer. Om de filmkamer te maken, snijdt u een gat ter grootte van de lens van de videocamera aan de ene kant van een polystyreendoos en een extra spleet op de grootte van het verlichtingskussen aan de andere kant.

Plaats het verlichtingskussen in de spleet en plaats de camera in het lensgat boven het verlichtingskussen. Plaats alle testmaterialen in een gecontroleerde omgeving, bij voorkeur een gedragskamer met een luchtvochtigheid van ongeveer 30%, een temperatuur van 25 graden Celsius, een uniforme luchtstroom en geluidsniveaus van minder dan 65 decibel. Gebruik de eerder gemaakte kartonnen sjabloon om twee stukken kaasdoek te snijden.

Dan pipette een milliliter van 100% ethanol via het scherm mesh in elke put. Droog het gaas en leg de twee stukken kaasdoek erbovenop. Snijd een klein stukje dunne, flexibele, plastic snijplank met behulp van de kartonnen sjabloon als een gids voor het uitbreiden van het gebied met een tot twee centimeter op een van de korte zijden.

Zorg er na het snijden voor dat het plastic nog steeds tussen de drie houten vaartuigen op het testapparaat past, maar aan één uiteinde hangt. Bereid een aspirator volgens manuscript richtingen, en gebruik het om een vlieg per goed in een 24-well cel cultuurplaat, die alle putten met eerder aangezogen vliegen met de flexibele plastic. Noteer de putpositie en alle relevante genotype- of fenotype-informatie van elke vlieg.

Houd de flexibele plastic flush met de bovenkant van de celcultuurplaat met de vliegen en keer de plaat om op de bovenkant van de gemodificeerde celkweekplaat met de ethanol. Gebruik de ambachtelijke stokken om de omgekeerde cel cultuur plaat uit te lijnen, ervoor te zorgen dat elke put met ethanol uitlijnt met elke put met een vlieg. Zorg ervoor dat het verlichtingskussen op volle helderheid brandt en begin met opnemen met de videocamera.

Stel de vliegen bloot aan de ethanol door het plastic tussen de twee platen zorgvuldig te verwijderen, zodat u het kaasdoek niet los maakt. Wanneer wordt vermoed dat alle vliegen de posturale controle hebben verloren, tikt u stevig in het midden van de plaat. Als er beweging is, blijven opnemen, tikken om de een tot twee minuten totdat er geen beweging optreedt.

Beëindig de opname zodra er geen beweging is. Om de vliegen te herstellen, verwijder de bovenste plaat van het testapparaat en haalt het individu in gekozen containers. Vervang de ethanol in de gemodificeerde celkweekplaten ten minste eenmaal per uur om consistente blootstelling aan ethanol gedurende de test te behouden en herhaal het experiment voor zoveel monsters als gewenst.

Bekijk de video-opname om de vliegsedatietijd te bepalen, die wordt gedefinieerd als het moment dat een vlieg posturale controle en motorische vermogen verliest. Om de nauwkeurigheid te garanderen, bekijk de film in omgekeerde richting en neem de tijd vast dat de vlieg begint te bewegen. Deze methode kan worden gebruikt om gegevens te genereren over een groot aantal vliegen binnen 10 minuten.

Twee 24-well platen werden gebruikt om tegelijkertijd ethanol sedatie tijden te meten voor 48 individuele vliegen van twee DGRP lijnen met verschillende gevoeligheden voor alcohol. Grote steekproefgroottes verhogen de nauwkeurigheid en verminderen fouten in omgevingsvariatie. RAL_555 vliegen waren minder gevoelig dan RAL-177 vliegen.

Mannetjes en vrouwtjes van RAL_177 vertoonden geen seksueel dimorfisch effect, terwijl de vrouwtjes van lijn RAL_555 minder gevoelig waren voor blootstelling aan ethanol dan de mannetjes. Bij het proberen van dit protocol is het cruciaal om de aspiratie van vliegen en de omkering van de celkweekplaat met precisie uit te voeren om het gewenste resultaat te bereiken. Aangezien de mogelijkheid om enkele vliegen te beoordelen verwarrende effecten als gevolg van groepsinteracties vermijdt, verbetert deze test het nut van het Drosophila-model voor studies met hoge doorvoer naar acute effecten van blootstelling aan alcohol.